微電解無菌水系統(tǒng)在實驗動物屏障設(shè)施中應(yīng)用的跟蹤監(jiān)測

張 薇, 唐 彬, 趙 勇, 張志妮, 鄧新燕

(中山大學(xué)實驗動物中心,廣州 510006)

目前，國內(nèi)實驗動物屏障設(shè)施中無菌水的相關(guān)報告很少。實驗動物屏障設(shè)施的無菌水系統(tǒng)猶如人體的血液循環(huán)系統(tǒng)，不僅供給動物不可或缺的飲用水，也為屏障內(nèi)的日常清潔等工作提供用水，是影響動物質(zhì)量和干擾實驗研究的潛在因素。根據(jù)國家標(biāo)準(zhǔn)《實驗動物環(huán)境與設(shè)施》GB 14925—2010 要求，清潔級以上的實驗動物飲用水應(yīng)達(dá)到無菌要求；而對于清潔級以上屏障設(shè)施中日常工作用水則沒有明確規(guī)定，但要求屏障環(huán)境中的沉降菌最大平均濃度［每0.5 h內(nèi)φ90 mm 平皿中菌落形成單位（colony-forming unit，CFU）］≤3。屏障環(huán)境用水一旦污染也將導(dǎo)致動物生存環(huán)境污染，因此，屏障設(shè)施內(nèi)的日常工作用水也應(yīng)達(dá)到無菌要求。有些屏障設(shè)施中無菌水系統(tǒng)制水不能持續(xù)保持無菌，遂采用高壓滅菌器滅菌制備動物飲用水，而屏障設(shè)施內(nèi)日常工作用水則采用添加化學(xué)消毒劑的方法制備。但是能達(dá)到滅菌效果的化學(xué)消毒劑較少，且化學(xué)消毒或滅菌劑效果受影響的因素較多，如物體表面有機物、塵埃、水的酸堿性及水中有機物等均會降低滅菌效果。因此，屏障環(huán)境工作用水同樣需要控制微生物而達(dá)到無菌，才能消除屏障環(huán)境與動物污染隱患。

中山大學(xué)實驗動物中心于2008年開始將微電解無菌水系統(tǒng)應(yīng)用到屏障設(shè)施中供應(yīng)SPF 級動物飲用水和日常工作用水，并于2018 年11 月新增微電解儀備用機。前期研究表明，微電解無菌水可以持續(xù)保持無菌，并對SD大鼠的血液生化等臨床指標(biāo)沒有影響［1］。2018年4月～2022年3月本中心對微電解無菌水系統(tǒng)的使用情況進(jìn)行了跟蹤觀察，然后對微電解無菌水系統(tǒng)配置、運行管理中的細(xì)節(jié)加以總結(jié)和分析，以供同行借鑒。

1 材料與方法

1.1 微電解無菌水系統(tǒng)

微電解無菌水系統(tǒng)由超濾、微電解儀、循環(huán)輸水管路和屏障實設(shè)施內(nèi)終端供水口組成。微電解儀1 號和2 號互為備用，當(dāng)其中一臺發(fā)生故障時，啟用另外一臺。微電解用220 V 電源，實際工作電壓≤80 V，功率為280 W；微電解儀產(chǎn)生的電流為2 A～10 A。超濾材料主要有5 μm保安過濾膜、1 μm精密過濾膜、0.1 μm超濾膜。微電解無菌水系統(tǒng)由廣州惜水科技有限公司提供。系統(tǒng)工藝流程見圖1 所示，虛線左側(cè)為屏障環(huán)境設(shè)施內(nèi)管網(wǎng)布局，右側(cè)為屏障環(huán)境設(shè)施外管網(wǎng)及機房布局。

圖1 微電解無菌水系統(tǒng)的工藝流程簡圖Figure 1 Process flow diagram of micro-electrolyzed sterile water system

1.2 主要試劑與儀器

SPX-600 智能生化培養(yǎng)箱購自上海鴻都電子科技有限公司；DHP-9162電熱恒溫培養(yǎng)箱購自上海一恒科學(xué)儀器有限公司；腦心浸液肉湯、硫乙醇酸鈉肉湯無菌采樣瓶、大豆蛋白凍肉湯培養(yǎng)基均購自于廣東環(huán)凱微生物科技有限公司；化學(xué)純36%～38%鹽酸購自廣州化學(xué)試劑廠（批號：2021030216）。

1.3 水采樣點的設(shè)置及編號

設(shè)8個取水樣點。1、2號微電解儀的3個水龍頭是共同的終端出水實體。屏障設(shè)施內(nèi)3 個終端水龍頭對應(yīng)1號微電解儀的水樣標(biāo)記為1號、2號、3號取樣點，對應(yīng)2 號微電解儀的水樣標(biāo)記為6 號、7 號、8 號；屏障設(shè)施外微電解機房的2 個取水點，即輸水管網(wǎng)回水取樣點（標(biāo)記為4 號）和微電解出水進(jìn)入輸水管網(wǎng)前取樣點（標(biāo)記為5號）各1個。

1.4 水樣采集

超濾水采樣：確認(rèn)微電解儀均處于關(guān)閉狀態(tài)，開啟，1、2、3 號終端出水口放水5 min，然后用酒精燈燒灼出水口，用采樣瓶以無菌操作的方法對上述取水點進(jìn)行水樣采集，500 mL/瓶，每份水樣各2瓶。

微電解水采樣：開啟微電解儀1 h后采樣。采樣點包括3 個終端出水口（1 號微電解儀啟用時命名為1、2、3 號水樣；2 號微電解儀啟用時命名為6、7、8 水樣）、1 個輸水管網(wǎng)回水取樣點4 號、1 個微電解出水口至輸水管網(wǎng)前的取樣點5 號。對采樣出水口放水5 min，用酒精燈燒灼出水口，以無菌操作的方法采集水樣500 mL/瓶，每份水樣各2瓶。

酸化水采樣：對終端出水口的水人工添加36%～38%化學(xué)純鹽酸，達(dá)到pH測試紙值2.5～3，以無菌操作的方法采集水樣500 mL/瓶，每份水樣各2瓶。

1.5 樣品接種培養(yǎng)

過濾法檢測：依據(jù)《中華人民共和國藥典》2020版中純化水、注射用水的檢測方法。于水平流潔凈工作臺上進(jìn)行操作。每份樣品隨機取其中1 瓶500 mL 水樣，經(jīng)0.22 μm無菌薄膜過濾器濾過后，取出濾膜，菌面向上貼于R2A 瓊脂培養(yǎng)基，30～35 ℃培養(yǎng)至少5 d，觀察菌落數(shù)。

國標(biāo)法檢測：依據(jù)國家標(biāo)準(zhǔn)GB 14925—2010《實驗動物環(huán)境及設(shè)施》、GB 14926.41—2001《實驗動物無菌動物生活環(huán)境及糞便標(biāo)準(zhǔn)的檢測方法》檢測。另1瓶500 mL水樣按無菌操作分別吸取0.5 mL樣品，分別接種到腦心浸液肉湯、硫乙醇酸鈉肉湯、大豆蛋白凍肉湯、血瓊脂平皿培養(yǎng)基中。其中，接種腦心浸液肉湯、硫乙醇酸鈉肉湯培養(yǎng)基后，置于（36±1）℃培養(yǎng)至少14 d，并在第7和第14天時采用革蘭染色法鏡檢；接種血瓊脂平皿后，放置35～37 ℃培育箱中48～72 h，觀察血瓊脂平皿中有無細(xì)菌生長，以及其菌落數(shù)；接種大豆蛋白凍肉湯培養(yǎng)基后，置于25～28 ℃培養(yǎng)至少14 d，觀察有無真菌生長。

1.6 結(jié)果判斷

光學(xué)顯微鏡下未觀察到細(xì)菌，同時R2A 瓊脂培養(yǎng)基和血瓊脂皿上無細(xì)菌生長，大豆蛋白凍肉湯培養(yǎng)基中無真菌生長，即判斷水質(zhì)合格，無菌水符合無菌要求，結(jié)果表示為陰性“－”。任何一個培養(yǎng)基中出現(xiàn)陽性結(jié)果，即判斷為不符合無菌要求，結(jié)果表示為陽性“＋”。

2 結(jié)果

2.1 超濾水與微電解水的檢測結(jié)果對比

關(guān)閉微電解儀時，經(jīng)過超濾處理的1、2、3 號水樣進(jìn)行微生物檢測，結(jié)果均為陽性。開啟2 號微電解儀1 h 后，4、5、6、7、8 號水樣進(jìn)行微生物檢測的結(jié)果均為陰性。兩種水樣采用過濾法的檢測結(jié)果與依據(jù)GB 14925—2010、GB 14926.41—2001國標(biāo)檢測的結(jié)果一致，具體見表1。

表1 超濾水與微電解水的檢測結(jié)果比較Table 1 Comparison between ultrafiltration water and micro electrolysis water

2.2 微電解儀故障與正常運行期間的檢測結(jié)果

2018 年4 月～2022 年3 月跟蹤檢測期間，在編號為20180921 和20181011 的二次連續(xù)檢測時發(fā)現(xiàn)1、2、3 號終端出水口水樣有細(xì)菌，對應(yīng)1 號微電解儀故障，此后增加備用微電解儀（命名為2 號微電解儀）；另外，在編號20210923 和20211215 的檢測時發(fā)現(xiàn)6、7、8 終端水樣有細(xì)菌，對應(yīng)2 號微電解儀故障。結(jié)果提示，微電解儀正常運行時，終端水樣檢測結(jié)果為陰性；若微電解儀出現(xiàn)故障，終端水樣檢測結(jié)果為陽性（表2）。

表2 微電解儀故障時的水樣檢測結(jié)果Table 2 Detection result of water samples in case of failure of micro-electrolyzed sterile water system

2.3 微電解無菌水跟蹤監(jiān)測微生物結(jié)果

2018 年4 月～2022 年3 月共進(jìn)行17 次采樣檢測，除編號為20180921、20181011、20210923、20211215的終端水樣檢測有細(xì)菌（分別對應(yīng)1號和2號微電解儀故障）外，其他時間的跟蹤檢測結(jié)果顯示微電解無菌水系統(tǒng)的終端出水口1、2、3、6、7、8水樣、回水口4水樣、微電解出水口5水樣、酸化水樣經(jīng)培養(yǎng)14 d后均無細(xì)菌和真菌生長（表3），符合GB 14925—2010、GB/T 14926.41—2001國家標(biāo)準(zhǔn)。

表3 2018年4月—2022年3月微電解無菌水微生物檢測情況Table 3 Microbial detection of micro-electrolyzed sterile water from April 2018 to March 2021

3 討論

本中心所用的微電解無菌水系統(tǒng)在跟蹤前期的檢測結(jié)果顯示，僅經(jīng)過超濾的水不能達(dá)到無菌，且在微電解儀故障時，所制終端水不能達(dá)到無菌；開啟微電解儀并正常工作1 h后所制水能達(dá)到無菌。國內(nèi)有學(xué)者比較了反滲透實驗動物飲用水與高壓滅菌水，發(fā)現(xiàn)前者不能達(dá)到無菌［2-3］。不能保持所制水無菌的原因可能與反滲透膜、前置超濾膜自身微生物滋生以及輸水管道內(nèi)、終端開放口微生物滋生有關(guān)。同時，前期的檢測水樣采用過濾法與國標(biāo)法（水樣未經(jīng)過濾）的檢測結(jié)果一致，因此在后期的跟蹤監(jiān)測中采用了GB 14925—2010、GB/T 14926.41—2001 國家標(biāo)準(zhǔn)推薦的方法。

屏障設(shè)施無菌水系統(tǒng)均由滅菌環(huán)節(jié)、輸水管路、供水終端組成。目前，國內(nèi)應(yīng)用到屏障設(shè)施的無菌水系統(tǒng)主要有反滲透或+浸沒式紫外線、超濾（超濾+臭氧發(fā)生器+浸沒式紫外線）、在線滅菌。反滲透和超濾均是利用膜過濾法進(jìn)行凈化水。反滲透可以截留9×101道爾頓的小分子，能有效清除溶解于水中的無機物、有機物、細(xì)菌、熱源等。超濾可以截留相對分子質(zhì)量在1×103～1.5×105，不能過濾水溶性無機離子，也通常作為反滲透的前置過濾。但反滲透和超濾均需要防止過濾膜被細(xì)菌污染或堵塞，需定期監(jiān)控并更換過濾膜，否則導(dǎo)致過濾失敗，系統(tǒng)滋生細(xì)菌［4-5］。也有學(xué)者認(rèn)為，反滲透只可以去除大部分細(xì)菌，而不是全部［6］。同時這2 種系統(tǒng)的輸水管道以配置成循環(huán)管路為佳，而維持輸水管路內(nèi)的無菌則是防止污染的關(guān)鍵點和難點。在線高溫滅菌是將水高溫滅菌結(jié)合降溫輸送，有文獻(xiàn)［2］報道其可以保持終端出水的無菌，但隨著在飲水瓶儲存時間延長，滋生細(xì)菌逐漸增多，同時能耗較高。微電解是通過改變電場強度，影響細(xì)菌的生理代謝而導(dǎo)致其死亡，同時水分子通過微電解發(fā)生強的氧化還原反應(yīng)，并釋放活性物質(zhì)［O］、HO2-、H2O2等自由基到循環(huán)水中發(fā)揮殺菌作用［1］。微電解的優(yōu)勢是保持循環(huán)輸水系統(tǒng)持續(xù)存在強氧化活性物質(zhì)而達(dá)到滅菌作用，尤其是可以持續(xù)保持輸水管路的無菌［1］；但將其灌裝飲水瓶后能維持多長時間的無菌，尚未做監(jiān)測。本研究通過對微電解無菌水系統(tǒng)多年的跟蹤觀察發(fā)現(xiàn)，微電解無菌水系統(tǒng)的終端出水口水樣檢測無菌表明整個無菌水系統(tǒng)無菌；回水口水樣無菌表明輸水管路無污染；微電解出水口進(jìn)入供水網(wǎng)管前水樣無菌表明微電解儀器工作正常；而酸化水監(jiān)測結(jié)果保持陰性，是無菌水系統(tǒng)的第二屏障，可彌補無菌水不能實時監(jiān)測帶來的污染風(fēng)險。

屏障設(shè)施無菌水系統(tǒng)的污染環(huán)節(jié)主要發(fā)生在滅菌主機功能減弱或故障、膜過濾或輸水循環(huán)管路污染、單行無循環(huán)管路或供水末端的逆行污染、動物自動飲水嘴的逆行污染。本中心在對微電解無菌水系統(tǒng)的跟蹤監(jiān)測過程中發(fā)現(xiàn)，取樣點的科學(xué)設(shè)置非常重要。因此在觀察中不僅設(shè)置了終端取水點，還設(shè)置了循環(huán)管路的回水取樣點和微電解儀出水口進(jìn)入管網(wǎng)前的取樣點，以此達(dá)到對無菌水系統(tǒng)的各關(guān)鍵環(huán)節(jié)點起到準(zhǔn)確監(jiān)控作用。一旦發(fā)現(xiàn)污染，可以通過污染取樣點位置判斷無菌水系統(tǒng)污染發(fā)生的具體環(huán)節(jié)，即準(zhǔn)確判斷是微電解儀器問題、輸水管路問題、終端水逆行污染還是取樣操作污染問題。通過幾年跟蹤觀察發(fā)現(xiàn)：微電解無菌水系統(tǒng)多以微電解儀發(fā)生故障導(dǎo)致殺菌失敗，在1號微電解儀工作時2次檢測陽性，維修發(fā)現(xiàn)電解極片結(jié)垢板結(jié)，在兩極片中形成隔離層，使微電解減弱或不能正常工作。因此，微電解儀的維護(hù)非常重要。微電解無菌水系統(tǒng)維護(hù)的關(guān)鍵點是：定期清洗除垢，每月一次，每500 L 加檸檬酸500 g，開啟微電解無菌水系統(tǒng)，使檸檬酸水在系統(tǒng)中循環(huán)保持1～2 h，減少礦物質(zhì)等雜質(zhì)在電極片上的結(jié)垢，保持陰極片、陽極片正常發(fā)揮電解作用；過濾膜定期更換，保安過濾每3個月、精過濾膜6 個月、超濾膜12 個月更換一次。過濾膜的配置起到攔截微量懸浮物和微小雜質(zhì)顆粒以及部分微生物的作用，可實現(xiàn)水的預(yù)處理，減少電極片的結(jié)垢，但其不具備自凈功能，不能持續(xù)保持無菌。經(jīng)2015—2017年［1］及近4年來的跟蹤監(jiān)測發(fā)現(xiàn)，在微電解系統(tǒng)正常工作時，微電解儀出水口、輸水管路、終端出水均沒有污染，后期還設(shè)置了備用微電解儀器，交替使用，以確保生產(chǎn)屏障設(shè)施中動物飲用水和日常工作清潔用水的無菌。如沒有備用微電解儀且僅有的一臺微電解儀故障時，應(yīng)用高壓滅菌水替代，以保障屏障設(shè)施內(nèi)動物飲用水和日常工作用水符合無菌要求。

屏障設(shè)施中動物飲用水和日常用水一旦污染將直接導(dǎo)致動物和環(huán)境的污染，因此，維持并保持屏障設(shè)施無菌水系統(tǒng)的無菌顯得極其重要。經(jīng)過多年跟蹤監(jiān)測的結(jié)果表明，微電解無菌水在屏障設(shè)施中應(yīng)用是可行的，但也存在一些關(guān)鍵的細(xì)節(jié)問題。一方面，無菌水僅僅靠微電解儀尚不能達(dá)到持續(xù)無菌，輸水管路的科學(xué)配置是極其關(guān)鍵的因素，必須設(shè)置循環(huán)回路，使微電解的殺菌物質(zhì)在循環(huán)管路中持續(xù)保持。筆者了解到國內(nèi)目前約25家實驗動物設(shè)施使用了微電解無菌水系統(tǒng)，另有2 家單位在嘗試應(yīng)用微電解系統(tǒng)時發(fā)現(xiàn)所制水不能達(dá)到無菌而放棄使用，究其原因是配置的輸水管路沒有設(shè)置循環(huán)回路、輸水管網(wǎng)有過長過多盲端、輸水管網(wǎng)中形成旁通獨立閉環(huán)等，導(dǎo)致輸水管路死角和部分不能循環(huán)的水存在，管網(wǎng)中的水不能全部回流而重新進(jìn)入微電解殺菌循環(huán)系統(tǒng)中，從而導(dǎo)致水中細(xì)菌的滋生。因此，在實驗動物屏障設(shè)施的設(shè)計規(guī)劃中，對無菌水系統(tǒng)中輸水管路的布局需要考慮循環(huán)輸水管路的設(shè)計，盡可能減少輸水死角。另一方面，目前的微電解無菌水系統(tǒng)沒有即時報警系統(tǒng)。本中心自2018年11 月起在系統(tǒng)中配置了在線微電解儀電流檢測表，以監(jiān)控微電解儀產(chǎn)生的電流，小于或等于2 A時應(yīng)立即停用，啟用備用機。此外，準(zhǔn)確判斷仍然需要取水樣進(jìn)行微生物檢測，歷時2～14 d才能報告結(jié)果，因此水質(zhì)微生物檢測結(jié)果的判斷遲于污染發(fā)生的實際時間。未來工作中，將考慮利用微電解水中的主要滅菌成分設(shè)置在線檢測報警系統(tǒng)以達(dá)到實時監(jiān)控的作用。