腫瘤出芽預測ⅠA2-ⅠB1期宮頸鱗狀細胞癌淋巴結轉移的意義

盧善明 羅文娟 劉堃 薛祥興 謝玉珍

梅州市人民醫院病理科（廣東梅州 514031）

盆腔淋巴結清掃是早期宮頸癌（ⅠA1 期除外）的標準治療。可是，ⅠA2、ⅠB1 期宮頸癌淋巴結轉移率只有0% ～4.8%和13.7% ～13.9%［1-2］。因此，相當多早期宮頸癌患者承受了不必要的盆腔淋巴結清掃。早期宮頸癌具有較高的前哨淋巴結檢出率、敏感度和陰性預測值［3-4］。對擬行保留生育手術的患者，手術中可以聯合應用前哨淋巴結活檢術（SLNB）。雖然NCCN 和FIGO 都推薦早期宮頸癌使用前哨淋巴結活檢術，但前哨淋巴結活檢術存在一定的操作難度，臨床并未廣泛開展。

腫瘤出芽（tumor budding，TB）是指腫瘤浸潤前分散在間質的單個瘤細胞或小于等于4 個細胞的瘤細胞簇［5］。腫瘤出芽是pT1 期結直腸癌淋巴結轉移的獨立預測因素，已作為結直腸惡性息肉是否需要追加手術的指標。ⅠA2-ⅠB1 期宮頸鱗癌淋巴結轉移率低，而且大部分患者適合保留生育功能，探討腫瘤出芽能否作為ⅠA2-ⅠB1 期宮頸鱗癌淋巴結轉移的預測因素具有臨床應用意義。目前有少量文獻報道了腫瘤出芽與宮頸癌淋巴結轉移和預后的相關性，而關于其在早期宮頸鱗癌方面的研究有限。本研究收集行盆腔淋巴結清掃術的FIGO（2009）IA2-IB1 期宮頸鱗狀細胞癌患者的資料，分析腫瘤出芽預測淋巴結轉移的價值，以期為早期宮頸鱗癌的個體化治療提供依據。

1 資料與方法

1.1 一般資料 收集108 例FIGO（2009）ⅠA2-ⅠB1 期行宮頸癌根治術的宮頸鱗狀細胞癌臨床病理資料，所有患者術前未行新輔助放療或化療，無其他惡性腫瘤病史。排除標準為炎癥細胞浸潤明顯致無法準確計數瘤芽的病例。

1.2 腫瘤出芽評估方法 調取病理存檔蠟塊及切片，復閱病理切片，篩選出腫瘤出芽最豐富的切片用于分析。腫瘤出芽評估方法參照國際腫瘤出芽共識大會（ITBCC）2016 的建議［5］，并稍作計數面積調整。在10 倍目鏡下觀察腫瘤浸潤前沿區篩選出瘤芽熱點，在20 倍目鏡下（視野為0.95 mm2）計數單個視野最高瘤芽數量。分別由兩位有經驗的病理醫師進行計數，分級不一致的病例共同鏡下討論決定。腫瘤出芽分級：0 ～4 個為低級別腫瘤出芽，≥5 個為高級別腫瘤出芽。

1.3 免疫組化 腫瘤出芽最豐富的蠟塊行4 μm切片2 張，1 張用于HE 染色，1 張用于免疫組化Pan-CK 染色。免疫組化采用EnVision 二步法。抗體Pan-CK 購自福州邁新生物技術開發有限公司。

1.4 統計學方法 統計軟件為SPSS 22.0，腫瘤出芽與臨床病理參數的相關性采用χ2檢驗，淋巴結轉移危險因素的分析采用logsitic 多因素回歸。P＜0.05 為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 臨床病理特征 108例ⅠA2-ⅠB1期宮頸鱗癌中，患者中位年齡48 歲（28 ～74），高中分化92 例（85%），低分化16例（15%）。腫瘤浸潤宮頸淺肌層33例（31%），中肌層12例（11%），深肌層63例（58%）。出現淋巴結轉移53例（49%），脈管癌栓65例（60%）。

2.2 腫瘤出芽與臨床病理特點的相關性 采用HE 染色方法評估腫瘤出芽，腫瘤出芽中位數為4（0 ～20）個，低級別腫瘤出芽56 例（52%），高級別腫瘤出芽52 例（48%），見圖1。腫瘤出芽與患者年齡（P= 0.568）、腫瘤浸潤深度（P= 0.515）、脈管癌栓（P= 0.287）均差異無統計學意義（表1）。腫瘤出芽與腫瘤分化顯著性相關（P= 0.004），低分化組比高中分化組更易出現高級別瘤芽（13∕16vs.39∕92）。高級別瘤芽組趨向比低級別組更易發生淋巴結轉移（30∕52vs.23∕56），但兩組差異無統計學意義（P=0.084，表1）。

圖1 HE 染色觀察早期宮頸鱗狀細胞癌腫瘤出芽（×200）Fig.1 HE staining to observe TB in the early-stage cervical CSCC（×200）

表1 腫瘤出芽與宮頸鱗癌臨床病理特點的相關性Tab.1 Correlation between TB and clinicopathological features of CSCC

2.3 臨床病理特點與淋巴結轉移的相關性 高、低齡組患者淋巴結轉移率為38%（20∕53）和60%（33∕55），低齡組患者更易出現淋巴結轉移（P= 0.021）。高中分化組淋巴結轉移率為43%（40∕92），低分化組為81%（13∕16），兩組差異具有統計學意義（P= 0.005）。腫瘤浸潤深度與淋巴結轉移顯著性相關（P ＜0.001），浸潤深肌層組淋巴結轉移率為65%（41∕63），浸潤淺中肌層為27%（12∕45）。脈管癌栓組和無癌栓組淋巴結轉移率為62%（40∕65）和30%（13∕43），脈管癌栓組淋巴結轉移率明顯升高（P= 0.001）（表2）。多因素分析顯示患者年齡（HR 3.470，95%CI：1.402 ～8.586）、腫瘤 分化（HR：5.090，95%CI：1.181 ～21.936）、腫瘤浸潤深度（HR：5.489，95%CI：2.190 ～13.759）是淋巴結轉移的獨立預測因素（表2）。

表2 淋巴結轉移與宮頸鱗癌臨床病理特點的相關性Tab.2 Correlation between lymph node metastasis and clinicopathological features of CSCC

2.4 HE 與免疫組化染色對腫瘤出芽評估的一致性比較 為評估免疫組化Pan-CK 染色和HE 染色評估腫瘤出芽分級的一致性，33例標本平行進行了免疫組化Pan-CK 染色（圖2）。HE 染色和免疫組化Pan-CK染色腫瘤出芽分級顯著相關（P ＜0.001），有6 例分級不一致，一致率為81.8%（Kappa=0.629），見表3。

圖2 免疫組化Pan-CK 染色觀察早期宮頸鱗狀細胞癌腫瘤出芽（×100）Fig.2 Pan-CK immunostaining to observe TB in the earlystage CSCC（×100）

表3 免疫組化Pan-CK 染色和HE 染色評估腫瘤出芽的一致性Tab.3 Agreement of bud counts assessed using HE and Pan-CK immunostaining

3 討論

近年來，宮頸癌發病年齡趨向年輕化。隨著宮頸癌篩查的普及，越來越多的宮頸癌能早期診斷。許多早期宮頸癌患者是育齡期患者，有保留生育功能的需求。大部分ⅠA2-ⅠB1 期宮頸鱗癌符合保留生育功能指征，其淋巴結轉移率較低，評估淋巴結轉移風險對避免不必要的系統性盆腔淋巴結清掃術非常必要，尤其對有保留生育需求患者手術方式的選擇具有重要臨床意義。尋找預測早期宮頸癌淋巴結轉移的方法或標志物一直是臨床關注的問題［6-8］。

腫瘤出芽與瘤細胞間粘附性喪失和瘤細胞的遷移有關，是腫瘤細胞呈上皮-間質轉化（EMT）的組織形態學表現。越來越多研究顯示腫瘤出芽與腸癌、口腔鱗癌、乳腺癌、食管癌、肺癌、胃癌、胰腺癌、宮頸癌等多種腫瘤淋巴結轉移和預后相關［9-12］。腫瘤出芽的細胞常保留上皮的形態特點，細胞呈圓形、卵圓形或多角形，胞質較豐富、紅染。研究顯示在多種腫瘤不同觀察者間計數腫瘤出芽具有較高的可重復性。與大腸腺癌相比，宮頸鱗狀細胞癌腫瘤出芽的準確評估具有一定的難度，影響因素主要有：（1）發生間質轉化的瘤芽細胞則較難與間質內的纖維母細胞鑒別；（2）宮頸癌組織因伴有HPV 感染等原因，間質內常伴較多炎癥細胞浸潤，干擾了瘤芽的識別；（3）腫瘤細胞巢壞死導致腫瘤細胞的脫落可誤判為瘤芽。本研究探討了HE 染色和免疫組化Pan-CK 染色評估腫瘤出芽分級的一致性。HE 染色和免疫組化Pan-CK染色評估瘤芽分級的一致性為81.8%，這與本課題組在另一組宮頸鱗癌樣品中的研究結果較相似［13］。宮頸鱗癌常伴明顯炎癥細胞浸潤，免疫組化Pan-CK 染色有助于腫瘤細胞的識別，尤其是單個瘤芽細胞。雖然免疫組化Pan-CK 染色后瘤芽計數更為容易，提高了觀察間的可重復性，但是脫離癌巢的凋亡、壞死的腫瘤細胞及碎片也呈Pan-CK染色陽性，可誤判為瘤芽。

關于腫瘤出芽在宮頸癌淋巴結轉移和預后方面的研究，可見少量文獻報道［14-19］。由于數據有限，未能就宮頸癌的高瘤芽閾值達成共識。本研究參照國際腫瘤出芽共識大會（ITBCC）2016 的建議［5］，把1 個20 倍物鏡視野內（0.95 mm2）瘤芽≥5個作為高瘤芽標準。顯示高瘤芽組趨向比低級別組更易發生盆腔淋巴結轉移，但兩組差異未達統計學意義（P= 0.084）。HUANG 等［15］采用與本研究一致的高瘤芽閾值，行免疫組化Pan-CK 染色后再行腫瘤出芽計數。對634 例IA2-IIA 期宮頸癌研究顯示，高瘤芽宮頸癌復發風險增加并與盆腔淋巴結轉移密切相關，高瘤組無疾病生存率下降。CHONG 等［16］把瘤芽≥3∕HPF（20 ×）作為高瘤芽閾值，宮頸癌腫瘤浸潤前沿的瘤芽與淋巴結轉移不相關，但是宮頸癌復發的獨立預測因素。研究結果的不一致，可能與瘤芽評估方法和病例的臨床分期不一致有關。

宮頸癌不同區域的腫瘤出芽活性具有異質性，增加觀察范圍可能更能客觀評估腫瘤出芽活性。JESINGHAUS 等［17］把瘤芽≥15∕10HPF（40 ×）作為高腫瘤出芽閾值，分析了247 例宮頸癌腫瘤出芽的臨床病理意義，發現在測試隊列高瘤芽與淋巴結轉移不相關，而在驗證隊列兩者顯著性相關。ZARE 等［18］和SHI 等［19］分別在94 例宮頸鱗癌和398 例宮頸管腺癌中再次驗證了JESINGHAUS等［17］的研究結果，顯示高瘤芽腫瘤更易出現淋巴結轉移。SATABONGKOCH 等［20］也采用一樣的高瘤芽閾值研究了129 例IB-IIA 期早期宮頸腺癌的腫瘤出芽情況，發現高瘤芽與淋巴結轉移密切相關。雖然計數10HPF 瘤芽數量可能會增加病理醫生的工作量，但這些研究顯示把瘤芽≥15∕10HPF（40×）作為高腫瘤出芽閾值得出的研究結果較為一致。該瘤芽評估方法在預測ⅠA2-ⅠB1 期宮頸鱗癌淋巴結轉移的價值需要進一步探討。

淋巴結轉移是影響早期宮頸癌不良預后的最重要因素之一。本研究單因素分析顯示傳統不良病理因素如患者年齡、腫瘤分化、脈管癌栓、浸潤深度與淋巴結轉移顯著性相關。多因素分析顯示只有患者年齡、腫瘤分化和腫瘤浸潤深度是淋巴結轉移的獨立預測因素。CHONG 等［16］報道脈管癌栓、腫瘤浸潤深度與宮頸癌淋巴結轉移相關。FERRANDINA 等［21］探討了463 例ⅠA2-ⅠB1∕ⅡA1宮頸癌淋巴結轉移風險因素，單因數和多因數分析均顯示腫瘤大小、分化和脈管癌栓均與淋巴結轉移顯著性相關。因此，在宮頸錐切標本評估傳統不良病理因素如腫瘤分化、浸潤深度和脈管癌栓等有助于評估淋巴結轉移風險。

本研究不足之處是不少病例炎癥細胞浸潤明顯，瘤芽準確計數有一定困難，其次本研究是回顧性研究。需要擴大研究隊列和優化瘤芽評估方法來進一步驗證腫瘤出芽在預測ⅠA2-ⅠB1 期宮頸鱗癌淋巴結轉移的作用，結合傳統病理參數如組織學分級、脈管癌栓、浸潤深度等探討淋巴結轉移預測模型。關于腫瘤出芽的評估方法、高瘤芽閾值的確定、能否作為淋巴結轉移和預后的獨立預測因素、是否應體現在病理報告等問題仍有待更多的研究。