PM2.5暴露通過NF-κB信號通路致雄性大鼠生殖功能障礙

邱嫻嫻 安妮妮 江克華 彭金普 趙銀銀 孫發(fā)，

1貴州醫(yī)科大學（貴陽 550004）；2貴州醫(yī)科大學附屬人民醫(yī)院（貴陽 550002）

全世界男性不育癥發(fā)病率的上升引起了世界衛(wèi)生組織的關(guān)注。導致男性生殖功能障礙的原因包括環(huán)境因素和生活方式等［1］。近年來，隨著社會工業(yè)化的發(fā)展，空氣污染變得更為嚴重，霧霾天氣對男性生殖系統(tǒng)的影響一直是研究的重點［2-3］。霧霾的成分中，細顆粒物PM2.5 粒徑小，黏附力強，易攜帶多種重金屬及化學物質(zhì)，所以與其他顆粒物相比，它造成的危害更大。然而，目前的研究主要集中在PM2.5 對呼吸及心血管系統(tǒng)的影響上［4-7］。隨著男性不育率的升高，PM2.5 對男性生殖功能造成的不利影響成為亟需解決的問題。已有研究表明，PM2.5 可通過氧化應(yīng)激、IRE 1∕JNK∕自噬信號通路等影響精子發(fā)生及睪丸正常功能［8-9］。然而，炎癥損傷也是導致男性生殖功能障礙的核心因素之一。WANG 等［10］就指出PM2.5 暴露可通過炎癥造成生殖損害。盡管如此，目前關(guān)于炎性損傷的研究探討仍較少，其機制有待于進一步闡明。為此，本研究通過建立PM2.5 暴露雄性SD 大鼠生殖損傷模型，探討PM2.5 暴露后致大鼠生殖功能障礙的可能機制，為臨床上改善男性生殖功能、降低不育率提供新的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 選取30只健康雄性SD大鼠，8周齡（約300 ～400 g），由湖南省長沙市天勤生物技術(shù)有限公司提供（合格證號：No.430726210100140623）。在12 h 光照∕黑暗動物房中，溫度（22 ± 2）℃，相對濕度65% ～75 %下適應(yīng)性喂養(yǎng)1 周后開始實施實驗。

1.2 實驗試劑及材料 PM2.5 由貴陽市疾病預防控制中心提供。超聲震蕩儀（KQ250 江蘇昆山舒美公司）；真空冷凍干燥機（Gene Company Limited基因有限公司）；電子分析天平秤（湘儀天平儀器設(shè)備有限公司）；EP 管（武漢塞維爾生物科技有限公司）；一抗GAPDH Mouse（abcam 公司）；二抗HRP-Goat anti Rabbit；HRP-Goat anti Mouse（KPL 公司）；RNA 提取液（Servicebio 公司）；三氯甲烷（國藥集團化學試劑有限公司）；異丙醇（國藥集團化學試劑有限公司）；無水乙醇（國藥集團化學試劑有限公司）；HyPureTMMolecular Biology Grade Water（HyClone 公司）；Servicebio?RT First Strand cDNA Synthesis Kit（Servicebio 公司）；2×SYBR Green qPCR Master Mix（None ROX）（Servicebio 公司）；引物（Servicebio 公司）；75%乙醇由HyPureTMMolecular Biology Grade Water 配制；乙醚（貴州醫(yī)科大學設(shè)備科提供）；水合氯醛（武漢塞維爾生物科技有限公司）；睪丸組織固定液（武漢塞維爾生物科技有限公司）；離心機（Gene Company Limited 基因有限公司）。

1.3 實驗方法

1.3.1 PM2.5 混懸液制備 將樣本玻璃纖維濾膜剪成1 cm×1 cm 小片，置于適量雙蒸水中，使用超聲震蕩儀震蕩4 次，每次30 min。震蕩完成后得到PM2.5 混懸液，再經(jīng)八層無菌紗布濾過。將濾出的液體置于貴州省人民醫(yī)院中心實驗室真空冷凍干燥機中進行干燥24 ～48 h，得到PM2.5 固體粉末，置于-80 ℃冰箱內(nèi)儲存。使用前用電子分析天平秤稱取適量PM2.5 粉末，置于EP 管中，用無菌生理鹽水 分別 配 成 濃 度 為4.3 mg∕mL 及12.8 mg∕mL 的PM2.5 混懸液，配置后于實驗室紫外線殺菌后再次用超聲震蕩儀混勻后使用。

1.3.2 PM2.5 染毒模型制備 將30 只雄性SD 大鼠隨機分為三組，每組10 只，分籠飼養(yǎng)，分別命名為生理鹽水對照組、PM2.5 低濃度（PM 4.3 mg∕mL）暴露組、PM2.5 高濃度（PM 12.9 mg∕mL）暴露組。將SD 大鼠置入密閉容器內(nèi)經(jīng)乙醚吸入麻醉后，低濃度組組和高濃度組使用氣管插管氣管內(nèi)滴注法給予PM2.5 混懸液（劑量：1 mL∕kg），每隔2 天滴注1 次；對照組用同樣方法按給予無菌生理鹽水（劑量：1 mL∕kg），總持續(xù)暴露時間為4 周。實驗中對大鼠精神、飲食、皮毛及死亡情況進行記錄。

1.3.3 大鼠睪丸臟器系數(shù)計算 所有大鼠經(jīng)PM2.5暴露4 周后，禁食8 h 用水合氯醛腹腔注射麻醉動物致安樂死，稱取大鼠的最終重量并記錄。立即解剖取大鼠睪丸組織稱重，然后放入-80 ℃冰箱內(nèi)儲存待使用。按下列公式計算臟器比重：臟器系數(shù)（%）=臟器質(zhì)量（g）∕體質(zhì)量（g）×100%。

1.3.4 睪丸組織HE染色病理觀察 仔細分離大鼠睪丸，將睪丸用動物睪丸組織固定液固定，24 h 后用乙醇脫水，行石蠟包埋。然后將組織切成5 μm切片，固定在切片上，去石蠟，再水化，用蘇木精和伊紅染色（HE 染色）。在光學顯微鏡下對睪丸組織進行200 倍和400 倍放大。

1.3.5 測定血清性激素睪酮（T）含量 解剖時立即取約5 mL 腹主動脈血，用離心機經(jīng)3 044 g 離心15 min 后，將血清仔細吸出置于EP 管內(nèi)，保存在-20 ℃冰箱中待用。將大鼠血清標本送至貴州省人民醫(yī)院檢驗科用吖啶酯化學發(fā)光免疫檢測法檢測血清T 含量。

1.3.6 實時定量PCR 法檢測大鼠睪丸組織中TNF-α、IL-6 和IL-1βmRNA 表達水平 根據(jù)引物設(shè)計原則，參照SD 大鼠TNF-α、IL-6 和IL-1β 基因文庫，依據(jù)文獻及軟件同源檢索后合成相應(yīng)引物序列，見表1。從-80 ℃冰箱中取出大鼠睪丸組織，使用Trizol 法提取睪丸組織RNA，然后利用紫外分光光度計檢測提取的樣品RNA 濃度和含量，同時配置逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)液，將RNA 逆轉(zhuǎn)錄合成c-DNA，隨后配置PCR 反應(yīng)體系液，在設(shè)置好的反應(yīng)條件下根據(jù)引物序列進行實時熒光定量PCR 反應(yīng)（表1）。用熔融曲線法評價mRNA 擴增特異性，利用軟件工具根據(jù)2-ΔΔCT方法計算各基因的相對表達量。

表1 引物序列表Tab.1 The table of primersequences

1.3.7 WB法檢測大鼠睪丸組織中IKK和NF-κB、p-NF-κB p65、p-IκB-α 蛋白的表達 在冰塊上將約50 mg 睪丸組織放入勻漿器中，加入裂解液反復勻漿，直至樣本完全碾碎后倒入干凈EP 管中以20 392 g 離心20 min，收集上清液保存于-80 ℃冰箱中待用。采用BCA 法測定蛋白質(zhì)濃度。然后行蛋白電泳、轉(zhuǎn)膜，加入一抗及二抗完成免疫反應(yīng)，重復三次測定蛋白表達。內(nèi)參照為GAPDH。

1.4 統(tǒng)計學方法 采用SPSS 22.0 統(tǒng)計軟件分析數(shù)據(jù)，對所有數(shù)據(jù)進行正態(tài)性和方差齊性檢驗，符合正態(tài)分布時以均數(shù)±標準差表示。多組間比較采用ANOVA 單因素方差分析，兩獨立樣本采用t檢驗，方差不齊時采用Tamhane's T2 檢驗。以P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 大鼠睪丸重量及睪丸系數(shù) PM2.5 暴露4 周后，稱取大鼠體重及睪丸重量，并計算睪丸系數(shù)。與對照組比較，實驗組大鼠睪丸重量減低；三組大鼠睪丸系數(shù)差異無統(tǒng)計學意義，見表2。

表2 三組大鼠睪丸重量及睪丸系數(shù)Tab.2 Testicular weight and testicular index of rats in the three groups ±s

表2 三組大鼠睪丸重量及睪丸系數(shù)Tab.2 Testicular weight and testicular index of rats in the three groups ±s

組別對照組低濃度組高濃度組睪丸重量（g）1.90±0.14 1.69±0.18 1.77±0.19睪丸系數(shù)（%）0.48±0.02 0.42±0.08 0.41±0.04

2.2 大鼠睪丸組織HE 染色觀察 PM2.5 暴露后，與對照組相比，實驗組大鼠睪丸組織曲細精管管壁變薄，各級生精細胞排列松散紊亂，管腔中成熟精子數(shù)量減少（圖1B-C）。高倍鏡下，高濃度組睪丸組織曲細精管管壁基底膜斷裂，生精細胞脫落至管腔中（圖1E-F）。

圖1 PM2.5 暴露后睪丸組織HE 染色形態(tài)學改變Fig.1 The morphological changes of testis tissue through HE staining after PM2.5 exposed

2.3 大鼠血清睪酮（T）含量 將三組大鼠腹主動脈血離心后的血清用吖啶酯化學發(fā)光免疫檢測法檢測性激素T，實驗組血清T 含量較對照組顯著降低，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），見圖2。

圖2 PM2.5 暴露后三組大鼠血清T 含量Fig.2 The content of serum T in the three groups after PM2.5 exposed

2.4 各組大鼠睪丸組織中TNF-α、IL-6 和IL-1β mRNA 水平比較 用實時熒光PCR 法檢測大鼠睪丸組織中TNF-α、IL-6 和IL-1βmRNA 表達水平。與對照組相比，實驗組睪丸組織中TNF-α、IL-6 mRNA 表達水平升高，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。低濃度組和高濃度組中IL-1β mRNA 表達較對照組稍增高，但差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05），見圖3。

圖3 各組大鼠睪丸組織中TNF-α、IL-6、IL-1βmRNA 表達水平Fig.3 The mRNA expression level of TNF-α、IL-6 and IL-1β in rat testist Issue in each group

2.5 各組IKK 和NF-κB、p-NF-κB p65、p-IκB-α蛋白表達 PM2.5 暴露4 周后留取睪丸組織采用WB 法檢測相關(guān)蛋白表達情況及結(jié)果顯示：實驗組睪丸組織中IKK、NF-κB、p-NF-κB p65 和p-IκB-α蛋白表達明顯上調(diào)，與對照組比較差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），且高濃度組IKK 和p-NF-κB p65 蛋白顯著高于低濃度組，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），見圖4。

圖4 各組大鼠睪丸組織中IKK、NF-κB、p-NF-κB p65 和p-IκB-α 蛋白表達水平和灰度值比較Fig.4 The protein expression level and the gray value comparisonofIKK、NF-κB、p-NF-κB p65 and p-IκB-α in rat testis tissue in each group

3 討論

PM2.5 是人群中普遍存在的一種污染物，它對全世界人類健康造成了威脅［11］。在全球不同國家及地區(qū)，暴露于空氣污染物PM2.5 導致了過早的死亡率，也增加了嚴重疾病的發(fā)病率［12］。且已有不少研究證實PM2.5 對男性生殖功能造成不同程度的損害。JUREWICZ 等［13］指出以細顆粒物PM為主的大氣污染物可能導致男性精子DNA 的斷裂、精子運動減低，從而降低男性生育力。因此，開展高PM2.5 暴露水平的研究對于居住在PM2.5 污染嚴重地區(qū)的居民來說是有意義的。結(jié)合貴陽市大氣污染特點，開展露天暴露或短期內(nèi)收集PM2.5難以達到本次研究目的，因此本研究請本市疾控中心專業(yè)人員收集貴陽市一整年大氣中PM2.5，制備成PM2.5 混懸液進行實驗。本研究通過氣管滴注法建立雄性SD 大鼠生殖損傷模型，使用的氣管滴注法及PM2.5 濃度、滴注劑量都是根據(jù)前人的研究確定制備的［14-15］。

生殖功能的損害作用反映在睪丸重量和組織結(jié)構(gòu)的變化上。本研究結(jié)果顯示實驗組大鼠睪丸重量較對照組減輕，光鏡下觀察實驗組生精細胞結(jié)構(gòu)疏松，成熟精子數(shù)量減少，曲細精管管壁變薄，生精細胞脫落至管腔中，說明PM2.5 對大鼠生殖功能造成了損害。YANG 等［9］在探討PM2.5 對雄性大鼠的損害中也發(fā)現(xiàn)PM2.5 暴露后，光鏡下睪丸生精細胞結(jié)構(gòu)破壞，精子數(shù)量減少。精子數(shù)量減少及成熟障礙是男性生殖系統(tǒng)損傷的標志之一。同樣，ZHANG［14］和WEI 等［16］用氣管滴注法將不同濃度PM 滴注于大鼠體內(nèi)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)大鼠精子活力下降，精子畸形率增加。這些結(jié)論在一定程度上加強了本研究中PM2.5 對男性生殖系統(tǒng)的損傷的證據(jù)。

睪酮是由睪丸間質(zhì)細胞分泌的一種主要男性性激素，同雌激素屬于類固醇類激素，對男性性發(fā)育及第二性征的維持起著重要作用。有研究指出，血清睪酮降低可能是睪丸間質(zhì)細胞損傷的一個重要標志［17］。本研究結(jié)果表明暴露于PM2.5 后大鼠血清睪酮的含量顯著減低，反映出PM2.5 可能損傷了大鼠睪丸間質(zhì)細胞，導致其內(nèi)分泌功能障礙，睪酮含量減低。

男性生殖道炎癥對精子的產(chǎn)生具有危害作用。LI 等［18］通過構(gòu)建類似真實環(huán)境的獨特PM 吸入系統(tǒng)，發(fā)現(xiàn)PM2.5 暴露后大鼠睪丸組織生精管和生精總量明顯減少，并闡明與睪丸組織中特異性炎性因子TNF-α、IL-6 等上調(diào)致靶器官受損有關(guān)。本研究中，PCR 法結(jié)果證實實驗組睪丸組織中TNF-αmRNA 及IL-6mRNA 表達顯著高于對照組，但IL-1βmRNA 升高差異不明顯，說明PM2.5 暴露后，大鼠睪丸組織內(nèi)可能發(fā)生了炎性反應(yīng)，進而促進大量炎性因子的產(chǎn)生，造成炎性損傷。PM2.5 對男性睪丸炎性損傷的具體信號通路尚未完全闡明。在炎性反應(yīng)中，核轉(zhuǎn)錄因子NF-κB（nuclear transcription factor）信號通路是近20年來的研究熱點。NF-κB 是一條經(jīng)典的炎癥信號通路，對于免疫系統(tǒng)的發(fā)育和維持、炎癥反應(yīng)的控制以及先天和適應(yīng)性免疫至關(guān)重要［19-20］。其家族由NFκB1、NFκB2、RERA、REL 和RELB 編碼的5 個成員組成，分別為p50、p52、p65（Rela）、c-rel 和relB［21］。在細胞未受到刺激時這5 個成員以同系或異二聚體的形式存在于細胞質(zhì)中，并與IκB 結(jié)合［22］。當受內(nèi)外源性刺激后在IKK（IκB 激酶）的介導下促使IκB-α 發(fā)生磷酸化，磷酸化后的IκB-α繼續(xù)發(fā)生泛素化，并被蛋白酶降解，使原先存在于細胞質(zhì)中的NF-κB 二聚體游離進入細胞核，調(diào)節(jié)核內(nèi)基因轉(zhuǎn)錄，進而誘導各種炎性因子的過表達，進一步激活NF-κB 通路，從而放大炎癥級聯(lián)［23-24］。研究發(fā)現(xiàn)，PM2.5 可激活NF-κB 炎癥信號通路，且磷酸化的p65（p-NF-κB p65）及IκB-α（p-IκB-α）蛋白為NF-κB通路活化的標記物［25］。本研究中，實驗組IKK、NF-κB、p-NF-κB p65 和p-IκB-α 蛋白表達均顯著上調(diào)，表明了在本研究中NF-κB 炎癥信號通路可能被激活，激活后產(chǎn)生大量的IL-6、TNF-α和IL-1β 等炎性因子，放大炎癥級聯(lián)，造成睪丸組織的炎性損傷。本的研究結(jié)果強烈提示雄性大鼠生殖功能的損害可能是通過NF-κB 炎癥信號通路激活引起的睪丸炎癥損傷。

綜上所述，PM2.5 可能通過誘導NF-κB 炎癥信號通路，上調(diào)IL-6、TNF-α 和IL-6 的表達，從而導致雄性大鼠生殖功能障礙。目前，關(guān)于炎癥與PM2.5所致男性生殖功能損害關(guān)系的研究較少，其具體相關(guān)蛋白及信號通路尚未完全闡明，本研究的具體機制仍需進一步確認和研究。