HPLC法測定葛根養(yǎng)生酒中葛根素含量的分析研究

王 丹，吳小娟，劉小剛，蘭 余，吉 喆，吳衛(wèi)宇，馬 康，周成坪，袁 強(qiáng)，羅 爽，鄧有輝

（1.瀘州老窖股份有限公司，四川瀘州 646000；2.四川國檢檢測有限責(zé)任公司，四川瀘州 646000；3.瀘州老窖養(yǎng)生酒業(yè)有限責(zé)任公司，四川瀘州 646000）

葛根素是從豆科植物葛根中提取的一種異黃酮類化合物，具有抗心律失常、抗心肌缺血、擴(kuò)張血管、改善微循環(huán)、降血脂、降血糖、增加腦血流量、保護(hù)腦神經(jīng)細(xì)胞、抗氧化、防醉酒、治醉酒和對抗酒精性肝損傷等作用。隨著人們健康意識的不斷提升，葛根被應(yīng)用到食品、藥品等多個(gè)領(lǐng)域。葛根酒是一類健康養(yǎng)生酒，以傳統(tǒng)白酒為酒基，葛根為主要原料，輔以其他食藥原材，經(jīng)現(xiàn)代萃取技術(shù)將食藥材中的風(fēng)味、活性等成分融入到酒體中，形成在風(fēng)味、口感上區(qū)別于傳統(tǒng)白酒的養(yǎng)生酒。近年來，葛根酒市場發(fā)展比較快，受到消費(fèi)者喜愛。

目前，對于原料中葛根素的檢測已有相關(guān)研究，如高效液相色譜法、分光光度法、薄層掃描法、毛細(xì)管電泳法、近紅外光譜法、酶聯(lián)免疫吸附測定法等分析方法，其中高效液相色譜法檢測效果較好。然而，對于酒類中的葛根素檢測卻鮮有報(bào)道。在酒體中乙醇及其他原輔料成分可能會對葛根素的檢測造成干擾，影響穩(wěn)定性及準(zhǔn)確度。本試驗(yàn)主要探討葛根養(yǎng)生酒中葛根素含量的高效液相色譜（HPLC）檢測法，優(yōu)化相關(guān)檢測參數(shù)，以期為養(yǎng)生酒葛根素含量檢測提供快速可靠的測定方法。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑及儀器

葛根養(yǎng)生酒樣品：瀘州老窖養(yǎng)生酒業(yè)有限責(zé)任公司提供。

試劑及耗材：甲醇、冰乙酸均為色譜純，上海安譜實(shí)驗(yàn)科技股份有限公司；葛根素標(biāo)準(zhǔn)品（純度≥95%），上海安譜實(shí)驗(yàn)科技股份有限公司；實(shí)驗(yàn)用水符合GB/T 6682中一級水的規(guī)定。

儀器設(shè)備：LC 1260 II 高效液相色譜儀，美國Agilent公司；超純水制備儀，美國Millipore公司；電子天平，賽多利斯科學(xué)儀器；恒溫水浴鍋，金壇市醫(yī)療儀器廠。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 色譜檢測條件

色譜柱：JADE-PAK ODS-AQ C水相柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）；流速：1.0 mL/min；柱溫：40 ℃；檢測波長：250 nm，進(jìn)樣量：10 μL；流動(dòng)相：甲醇（A）-0.1 %乙酸水溶液（B），梯度洗脫程序見表1。

表1 梯度洗脫程序

1.2.2 葛根素標(biāo)準(zhǔn)溶液的制備

葛根素標(biāo)準(zhǔn)儲備液配制：精密稱取10.0 mg 葛根素標(biāo)準(zhǔn)品用甲醇溶解并定容至10 mL，混勻，得濃度為1.00 mg/mL 的標(biāo)準(zhǔn)品儲備液，于4 ℃下保存?zhèn)溆谩?/p>

葛根素標(biāo)準(zhǔn)系列工作液：用水將葛根素標(biāo)準(zhǔn)儲備液稀釋成濃度為1.0 mg/L、5.0 mg/L、10 mg/L、40 mg/L、80 mg/L、120 mg/L的標(biāo)準(zhǔn)工作溶液。

1.2.3 樣液制備方法

葛根素含量＞100 mg/kg 的養(yǎng)生酒：根據(jù)其含量，稱取混勻試樣2～5 g（精確至0.0001 g），用水稀釋成適當(dāng)濃度，經(jīng)0.45μm微孔濾膜過濾后，待液相色譜分析。

葛根素含量≤100 mg/kg 的養(yǎng)生酒：稱取混勻試樣10 g（精確至0.0001 g），水浴加熱去除乙醇，加水溶解轉(zhuǎn)移至10 mL 容量瓶，定容后搖勻，經(jīng)0.45μm微孔濾膜過濾后，待液相色譜分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 流動(dòng)相配比與洗脫方式選擇

選擇不同流動(dòng)相進(jìn)行系統(tǒng)適用性比較，分別試驗(yàn)比較了甲醇-水（30∶70）、甲醇-0.1%乙酸水（30∶70）下的出峰情況，發(fā)現(xiàn)采用甲醇-水（30∶70）時(shí)，上機(jī)采集20 min 內(nèi)目標(biāo)峰不出；采用甲醇-0.1%乙酸水（30∶70）等度洗脫時(shí)，13 min 左右出現(xiàn)目標(biāo)峰且峰形較好，綜合考慮時(shí)間成本，選擇甲醇-0.1 %乙酸水作為流動(dòng)相。

分別考察了甲醇-0.1 %乙酸水等度洗脫和梯度洗脫效果，采用甲醇-0.1 %乙酸水（30∶70）等度洗脫時(shí)，雜峰在目標(biāo)峰出現(xiàn)后近20 min內(nèi)仍不能完全流出，會嚴(yán)重干擾下一針采集，故采用甲醇-0.1%乙酸水梯度洗脫的方式，洗脫程序見表1，結(jié)果表明，梯度洗脫效果較好，該條件下葛根素標(biāo)準(zhǔn)品的色譜圖見圖1。

圖1 葛根素標(biāo)準(zhǔn)溶液及不同方法制備的酒樣供試液色譜圖

2.2 樣品前處理方法的選擇

考慮到以葛根為主要原料的養(yǎng)生酒樣若直接過濾進(jìn)樣檢測，乙醇可能對峰型和葛根素含量有影響，對高葛根素含量（＞100 mg/kg）養(yǎng)生酒采用經(jīng)水稀釋后過微孔濾膜再檢測。對葛根素含量（≤100 mg/kg）相對較低的養(yǎng)生酒，為避免過度稀釋對檢測結(jié)果準(zhǔn)確性的影響，同時(shí)提高檢測響應(yīng)值，考察了水浴除去乙醇后加水定容樣和不除去乙醇樣對檢測時(shí)出峰峰型和葛根素含量的影響。

結(jié)果（見圖1）表明，是否水浴加熱除去乙醇對葛根素含量無較大影響，但不除去乙醇會造成葛根素色譜峰前拖尾，色譜峰較寬，在6.3 min 附近多1個(gè)雜峰。同時(shí)采用加標(biāo)回收試驗(yàn)進(jìn)一步考察水浴加熱除乙醇下葛根素的熱穩(wěn)定性，酒樣在20 mg/kg加標(biāo)水平下的檢測結(jié)果表明，葛根素的平均加標(biāo)回收率為99.8 %，說明葛根素回收率高，熱穩(wěn)定性良好。綜合考慮到當(dāng)色譜柱柱效下降后，不除去乙醇樣品色譜峰峰型可能會變差，故選擇采用水浴加熱法處理葛根素含量（≤100 mg/kg）相對較低的養(yǎng)生酒樣。

2.3 檢出限、定量限和線性關(guān)系

當(dāng)葛根素標(biāo)液稀釋至濃度為0.10 mg/L 進(jìn)行上機(jī)檢測時(shí)，信噪比為5.8，更低稀釋濃度時(shí)，信噪比小于3，因此，將0.10 mg/L 確定為儀器最低檢測濃度。取6 份陰性空白酒樣10 g，以0.10 mg/kg 水平加入葛根素標(biāo)液，水浴揮發(fā)乙醇后，加水轉(zhuǎn)移定容至10 mL 容量瓶，上機(jī)測定，發(fā)現(xiàn)6 次加標(biāo)測定信噪比均大于3，結(jié)合直接稀釋葛根素標(biāo)液濃度為0.10 mg/L 時(shí)信噪比，按照信噪比S/N≥3 和S/N≥10 確定方法檢出限為0.10 mg/kg，定量限為0.40 mg/kg。

取濃度為1.0 mg/L、5.0 mg/L、10 mg/L、40 mg/L、80 mg/L、120 mg/L 的葛根素標(biāo)準(zhǔn)溶液，在優(yōu)化后的色譜條件上機(jī)檢測。以葛根素質(zhì)量濃度（mg/L）為橫坐標(biāo)（x），峰面積為縱坐標(biāo)（y）繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得出葛根素濃度在1.0～120 mg/L 范圍內(nèi)時(shí)，峰面積y與質(zhì)量濃度x 呈良好線性關(guān)系（y=45.849x-6.1179，R=0.9999）。

2.4 精密度試驗(yàn)

精密吸取同一酒樣，按優(yōu)化后的方法制備供試樣液，重復(fù)進(jìn)樣測定6 次，計(jì)算出峰時(shí)間和峰面積（n=6）的RSD，結(jié)果見表2。

由表2 可知6 次測定的保留時(shí)間和峰面積相對標(biāo)準(zhǔn)偏差均較小，表明儀器精密度良好。

表2 6次平行測定的保留時(shí)間和峰面積

2.5 重復(fù)性試驗(yàn)

取兩個(gè)葛根素濃度水平的養(yǎng)生酒即樣品A 和樣品B 各1 批次，每批次樣分別平行稱定6 份，按照優(yōu)化后的方法制備供試液各6 份進(jìn)樣測定，測得結(jié)果見表3。由表3 可知，測定結(jié)果相對標(biāo)準(zhǔn)偏差分別為0.7%、1.9%，方法重復(fù)性良好。

表3 重復(fù)性試驗(yàn)結(jié)果(n=6)

2.6 加標(biāo)回收率試驗(yàn)

精密稱取約10 g 養(yǎng)生酒陰性空白樣品，按照0.40 mg/kg、4.0 mg/kg、40.0 mg/kg 3 個(gè)濃度水平添加葛根素標(biāo)準(zhǔn)溶液，按1.2 項(xiàng)下優(yōu)化后的供試樣制備方法和色譜條件進(jìn)行檢測，加標(biāo)回收試驗(yàn)結(jié)果見表4。

表4 樣品在不同加標(biāo)濃度下的回收率(n=6)

由表4 可以看出，該養(yǎng)生酒中葛根素含量的檢測方法回收率良好且比較穩(wěn)定，符合GB/T 27404—2008附錄F中對回收率的要求。

2.7 穩(wěn)定性試驗(yàn)

取同一個(gè)養(yǎng)生酒供試樣溶液，分別在0 h、2 h、4 h、8 h、24 h、48 h 上機(jī)測定，測得其響應(yīng)峰面積見表5。由表5 可知，在48 h 內(nèi)測得的響應(yīng)面積相對標(biāo)準(zhǔn)偏差小于10 %，表明樣品試樣溶液放置于室溫下48 h內(nèi)測定仍能滿足檢測精密度要求。

表5 穩(wěn)定性試驗(yàn)結(jié)果(n=6)

3 結(jié)論

本研究優(yōu)化了高效液相色譜條件，篩選了適用于不同葛根素濃度水平的養(yǎng)生酒樣品前處理方法，建立了高效、適用的HPLC 方法測定養(yǎng)生酒中葛根素的含量。該方法在1.0～120 mg/L 范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，相關(guān)系數(shù)R為0.9999，線性方程y=45.849x-6.1179，方法檢出限、定量限分別為0.10 mg/kg、0.40 mg/kg；儀器精密度較好，響應(yīng)峰面積的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為0.22 %；方法重復(fù)性較好，兩個(gè)不同葛根素濃度的養(yǎng)生酒樣品6 次平行試驗(yàn)測定結(jié)果分別為2765.1 mg/kg、11.5 mg/kg，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差分別為0.7%、1.9%；養(yǎng)生酒樣品在加標(biāo)濃度為0.4 mg/kg、4.0 mg/kg 和40 mg/kg 3 個(gè)水平下，回收率范圍為90.52 %～93.98 %（n=6），相 對 標(biāo) 準(zhǔn) 偏 差 為0.57%～2.37%，滿足相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)要求。該方法操作簡單，具有檢測靈敏度高、分析時(shí)間短、穩(wěn)定性好、準(zhǔn)確可靠的特點(diǎn)，是檢測養(yǎng)生酒中葛根素含量的有效方法。