洋河濃香型大曲產(chǎn)香細(xì)菌的篩選、鑒定及香氣成分分析

陳桂芳，王曉慧，趙 琦，邵高超，董大偉

（江蘇洋河酒廠股份有限公司，江蘇宿遷 223800）

白酒是我國(guó)民族傳統(tǒng)產(chǎn)品，歷史悠久、風(fēng)格獨(dú)特，白酒的質(zhì)量決定了一個(gè)企業(yè)的競(jìng)爭(zhēng)力與生命力。洋河濃香型大曲由于其特殊的制曲工藝，網(wǎng)羅了許多產(chǎn)香微生物，形成了特定的微生物區(qū)系，這些產(chǎn)香微生物對(duì)白酒風(fēng)味的形成起著至關(guān)重要的作用。隨著研究的深入，濃香型大曲產(chǎn)香功能菌在提高白酒的品質(zhì)、豐富白酒風(fēng)味等方面取得了較好的應(yīng)用效果。本研究從濃香型大曲中分離篩選產(chǎn)香細(xì)菌，對(duì)篩選得到的菌株進(jìn)行高通量測(cè)序鑒定和產(chǎn)香性能研究，在探索不同微生物產(chǎn)香特性的同時(shí)，以期篩選出呈香效果較好的微生物種屬，為洋河濃香型大曲質(zhì)量的提升和制曲機(jī)理的研究提供一定的理論依據(jù)和實(shí)踐基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料、儀器

1.1.1 大曲樣品

選取洋河酒廠制曲一、二車間的出房曲，從感官、微生物和理化指標(biāo)等維度進(jìn)行綜合評(píng)價(jià)，選取綜合質(zhì)量較好的優(yōu)等大曲作為篩選樣本，粉碎后過(guò)40 目篩，采用四分法縮至200 g，裝于無(wú)菌袋，4 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.1.2 試驗(yàn)耗材

細(xì)菌分離、保藏培養(yǎng)基：LB培養(yǎng)基。

細(xì)菌種子培養(yǎng)基：LB肉湯。

小麥固體培養(yǎng)基：取200 g 適度粉碎的小麥于500 mL 三角瓶中，調(diào)節(jié)小麥原料含水量36 %～38.5%。

1.1.3 儀器設(shè)備

分析天平（±0.0002 g），型號(hào)AR224CN，上海奧豪斯公司；電熱恒溫水浴鍋（±0.1 ℃），型號(hào)DKS24，上海蘇達(dá)實(shí)驗(yàn)儀器有限公司；立式壓力蒸汽滅菌鍋（±0.1 ℃），型號(hào)LDZW-80KCS，上海申安醫(yī)療器械廠；電熱恒溫培養(yǎng)箱（±0.1 ℃），型號(hào)DNP-9162，上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司；SW-CJ-1F 超凈工作臺(tái)，蘇州蘇潔凈化設(shè)備有限公司；燒杯；三角瓶；發(fā)酵栓；培養(yǎng)皿等。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 細(xì)菌的分離、純化

采用稀釋涂布平板法對(duì)細(xì)菌進(jìn)行分離篩選：準(zhǔn)確稱取2 g 大曲樣品，置入裝有18 mL 無(wú)菌水的三角瓶中，振蕩30 min。用移液槍吸取1 mL 振蕩均勻的菌懸液，置入裝有9 mL 無(wú)菌水的試管中，振蕩均勻，以此10倍逐級(jí)稀釋至10。

取10、10、103 個(gè)稀釋度的菌懸液分別在LB 培養(yǎng)基上進(jìn)行平板涂布，于37 ℃下倒置培養(yǎng)24 h。長(zhǎng)出菌落后，選取具有典型細(xì)菌特征的菌落進(jìn)行劃線分離、純化，鏡檢后編號(hào)，接種于斜面試管中保藏，并送至上海美吉生物醫(yī)藥科技有限公司進(jìn)行菌株鑒定。

1.2.2 固態(tài)產(chǎn)香實(shí)驗(yàn)

將分離出的細(xì)菌菌株分別接入LB肉湯中，37 ℃搖床培養(yǎng)16 h 后，調(diào)節(jié)種子液濃度至10個(gè)/mL。按10%接種量接種于滅菌后的小麥固體培養(yǎng)基中，于37 ℃靜置培養(yǎng)9 d。

1.2.3 產(chǎn)香性能測(cè)定

對(duì)各細(xì)菌菌株的發(fā)酵產(chǎn)物進(jìn)行感官評(píng)價(jià)。對(duì)發(fā)酵產(chǎn)物香味良好的菌株進(jìn)行揮發(fā)性成分的鑒定分析。

1.2.3.1 固態(tài)發(fā)酵產(chǎn)物感官評(píng)價(jià)

由6 名聞香專業(yè)人員組成評(píng)價(jià)小組，對(duì)各菌株發(fā)酵后的樣品進(jìn)行外觀、香味評(píng)價(jià)。

1.2.3.2 固態(tài)發(fā)酵產(chǎn)物的揮發(fā)性成分檢測(cè)

根據(jù)參考文獻(xiàn)修改。

固相微萃取條件：取3 g 發(fā)酵產(chǎn)物于頂空瓶中，放入40 ℃左右的孵化池，再加入乙酸薄荷酯內(nèi)標(biāo)20 μL（100 mg/L）；60 ℃頂空瓶中預(yù)熱10 min 后插入固相萃取頭吸附40 min，萃取結(jié)束后立即插入氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀進(jìn)樣口熱解吸5 min。

色譜條件：HP-FFAP 石英毛細(xì)管柱（50 m×0.20 mm×0.33 μm）；升溫條件：柱溫箱溫度50 ℃保持3 min，以3 ℃/min 升溫至170 ℃，再以6 ℃/min升溫至230 ℃保持5 min，總檢測(cè)時(shí)間50 min；載氣流速1.5 mL/min；分流比設(shè)為不分流；質(zhì)量掃描范圍30～550 amu，檢索NIST 庫(kù)，選取匹配度大于800 的物質(zhì)，采用內(nèi)標(biāo)法計(jì)算化合物的含量。

2 結(jié)果與分析

2.1 大曲樣本的篩選

從制曲車間選取3 種感官較好且微生物和理化指標(biāo)適中的大曲進(jìn)行粉碎并混合后作為篩選樣本。大曲的感官和理化指標(biāo)結(jié)果見(jiàn)表1。選取的大曲篩選樣本感官方面包含了斷面發(fā)酵好、火圈勻凈和菌絲飽滿等特征，理化指標(biāo)均在優(yōu)等曲指標(biāo)范圍，富含霉菌、酵母和細(xì)菌等功能菌。

表1 中高溫大曲的感官及理化指標(biāo)

2.2 產(chǎn)香微生物的篩選及鑒定

挑取不同形態(tài)特征的菌落進(jìn)行劃線，分離單菌落，記錄單菌落的特征，并對(duì)分離菌株鑒定結(jié)果進(jìn)行匯總，結(jié)果見(jiàn)表2。結(jié)果表明，本次篩選出共計(jì)8株菌株，均為芽孢桿菌屬，經(jīng)高通量測(cè)序分析，分別為貝萊斯芽孢桿菌、短小芽孢桿菌、巨大芽孢桿菌、空氣芽孢桿菌、地衣芽孢桿菌、淀粉液化芽孢桿菌、短芽孢桿菌和枯草芽孢桿菌。其中貝萊斯芽孢桿菌的菌落特征主要表現(xiàn)為圓形，菌落較大，有凸起，無(wú)光澤，邊緣不整齊；地衣芽孢桿菌的菌落特征表現(xiàn)為不規(guī)則圓形，邊緣規(guī)則，透明有光澤；枯草芽孢桿菌在菌落形態(tài)上表現(xiàn)為圓形或不規(guī)則圓形，菌落大小適中，沒(méi)有光澤，邊緣呈絨毛狀；其余芽孢桿菌多表現(xiàn)為菌落呈微黃、黃色或乳黃色，菌落較小，邊緣較整齊，表面濕潤(rùn)有光澤。

表2 產(chǎn)香芽孢桿菌菌落形態(tài)及鑒定結(jié)果

2.3 產(chǎn)香微生物的產(chǎn)香驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)

8 株芽孢桿菌的產(chǎn)香試驗(yàn)結(jié)果如表3 所示。結(jié)果表明，地衣芽孢桿菌、淀粉液化芽孢桿菌、短芽孢桿菌和枯草芽孢桿菌在模擬發(fā)酵過(guò)程中產(chǎn)生明顯的褐變反應(yīng)。褐變反應(yīng)與形成醬香型酒的風(fēng)格質(zhì)量有著十分密切的聯(lián)系，是產(chǎn)生醬香物質(zhì)的基礎(chǔ)，因此褐變反應(yīng)控制得當(dāng)，可以賦予大曲獨(dú)特的風(fēng)味。褐變反應(yīng)的菌株產(chǎn)香效果中多含有醬香味；沒(méi)有發(fā)生褐變反應(yīng)的菌株產(chǎn)香效果較差，多為霉味、餿味、汗臭味、氨味等異雜味。

表3 8株芽孢桿菌產(chǎn)香試驗(yàn)結(jié)果

貝萊斯芽孢桿菌、短小芽孢桿菌、巨大芽孢桿菌、空氣芽孢桿菌整體產(chǎn)香效果較差，主要以異雜味為主，且褐變反應(yīng)不突出；地衣芽孢桿菌、淀粉液化芽孢桿菌和短芽孢桿菌雖產(chǎn)醬香明顯，但含有酸味、臭味等異雜味；枯草芽孢桿菌呈香效果最好，以甜醬香為主且香氣濃郁，是本次篩選中最理想的產(chǎn)香細(xì)菌。

2.4 產(chǎn)香微生物的香氣成分分析

對(duì)菌株X-8 的發(fā)酵產(chǎn)物進(jìn)行感官跟蹤，發(fā)現(xiàn)隨著發(fā)酵時(shí)間的延長(zhǎng)，發(fā)酵基質(zhì)在外觀上從小麥原色至深褐色，氣味從小麥原味到香味微弱、有醬味，最終呈現(xiàn)濃郁的香味，這一現(xiàn)象與明紅梅等的研究結(jié)果相一致。菌株X-8 的發(fā)酵產(chǎn)物的香氣成分分析見(jiàn)表4 和表5，發(fā)酵產(chǎn)物中的香氣成分共有65種，主要為吡嗪類、醇類和酮類，其中吡嗪類物質(zhì)的相對(duì)含量最高，達(dá)60.8 %，其次為醇類，達(dá)21.4 %，酸類和酯類物質(zhì)較少，不產(chǎn)生醛類和胺類物質(zhì)。吡嗪類物質(zhì)具有焙烤香、咖啡和烤面包香，在大曲香味中貢獻(xiàn)較高；醇類物質(zhì)中的2,3-丁二醇主要產(chǎn)生似黃油、乳脂、水果香，是酒類中極少數(shù)呈香的多元醇。發(fā)酵產(chǎn)物中含有的2-甲氧基-苯酚、2-羥基-3-己酮、2-庚酮等也是大曲和白酒的主要香味成分。因此，枯草芽孢桿菌X-8 是濃香型大曲中1株較為理想的產(chǎn)香功能細(xì)菌。

表4 X-8發(fā)酵產(chǎn)物揮發(fā)性物質(zhì)匯總表

表5 X-8發(fā)酵產(chǎn)物揮發(fā)性物質(zhì)測(cè)定

3 結(jié)論

通過(guò)稀釋涂布平板法及高通量測(cè)序成功篩選到一株產(chǎn)香效果較好的枯草芽孢桿菌X-8。通過(guò)單菌株產(chǎn)香試驗(yàn)感官聞香，發(fā)現(xiàn)X-8 香味特征表現(xiàn)為濃郁的甜醬香味。利用頂空固相微萃取-氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)對(duì)該菌株發(fā)酵后的香氣成分進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)該菌株發(fā)酵產(chǎn)物中共有65 種香氣成分，主要為吡嗪類和醇類，這兩類物質(zhì)也是濃香型大曲及白酒的重要香味成分。因此，枯草芽孢桿菌X-8是濃香型大曲中一株較為理想的產(chǎn)香功能細(xì)菌。