circ0000781通過吸附miR-21-5p調控BTG2表達抑制骨肉瘤增殖和侵襲的機制*

徐斌 付玲鈺 張波 吳輝 張旭乾

(南充市中心醫院·川北醫學院第二臨床醫學院 1.骨科；2.健康管理中心；3.病理科，四川 南充 637000)

骨肉瘤是兒童和青少年最常見的惡性骨腫瘤之一，每年全球新發病例約為400萬[1-4]。骨肉瘤早期診斷較困難，目前新輔助化療聯合腫瘤切除術是骨肉瘤的主要治療方法，但預后較差[5-7]。盡管骨肉瘤的治療手段不斷更新，但是轉移或復發的骨肉瘤患者死亡率仍然很高，總生存率低于20%[8-10]。骨肉瘤患者預后差的原因是其發病機制尚不清楚且存在爭議，因此進一步研究骨肉瘤增殖和轉移的機制，尋找新的腫瘤標志物和治療靶點就顯得非常重要。BTG2是BTG/TOB家族中的關鍵基因，與包括腫瘤在內的多種生物學現象有關[11]。既往研究發現BTG2在多種腫瘤組織中低表達[12-14]，也有研究證實BTG2在骨肉瘤組織中的表達水平明顯降低[15]，提示BTG2可能作為抑癌基因發揮作用，然而BTG2對骨肉瘤細胞增殖的影響及其上游調控機制尚不明確。本研究深入探討了BTG2在骨肉瘤發病中的作用及其上游調控機制，以期為骨肉瘤的早期診斷和治療提供新的生物標志物和作用靶點。

1 材料與方法

1.1 材料 人骨肉瘤細胞株，正常人成骨細胞hFOB1.19細胞株和3種人骨肉瘤細胞株(HOS、MG63和Saos-2)購自美國種質保藏中心。用含有10%胎牛血清的DMEM-F12(Gibco，Carlsbad，USA)培養hFOB1.19細胞。三種骨肉瘤細胞在含有100 U/mL青霉素，100 mg/mL鏈霉素和10%胎牛血清的DMEM(Gibco)中培養，培養箱內溫度為37℃，并含有5% CO2。

1.2 細胞轉染 miR-21-5p mimic、miR-21-5p inhibitor及BTG2 siRNA(5′-GCUCCAUCUGCGUCUUGUA-3′)購自RiboBio公司 (Guangzhou，China)，circ0000781過表達載體PcDNA3.1- circ0000781質粒和BTG2過表達載體PcDNA3.1- BTG2質粒購自GeneChem公司 (Shanghai，China)。根據制造商的說明，使用Lipofectamine 2000試劑(Life Technologies，Carlsbad，USA)進行轉染，轉染后48 h收集細胞進行后續實驗。

1.3 qRT-PCR 根據制造商說明書使用TRIzol(Invitrogen，Carlsbad，CA，USA)從細胞中提取總RNA，再應用Primescript逆轉錄試劑盒(Takara，Otsu，Shiga，Japan)逆轉錄成cDNA。然后用PowerUpTM SYBRTM Green Master Mix(Applied Biosystems，美國)對cDNA進行PCR擴增。BTG2引物序列如下:5′-GCGTGAGCGAGCAGAGGCTT-3′(forward)，5′-GGCTGGCCACCCTGCTGATG-3′(reverse)。miR-21-5p引物序列如下:5′-CTTACTTCTCTGTGTGATTTCTGTG-3′(forward)，5′-ACAACCTTTCCAAAATCCATGAGGC-3′(reverse)。采用2-△△Ct法記錄mRNA相對表達水平。

1.4 CCK-8 CCK-8用于檢測細胞增殖能力。將處理過的細胞用胰蛋白酶消化后接種到96孔板(每孔約2000個細胞)，每組5個重復。用CCK8分析不同時間點(接種后24、48和72 h)的細胞增殖活性。

1.5 Transwell 按照制造商的說明(BD Biosciences，Bedford，MA，USA)，將預涂有Matrigel的Transwell小室用于細胞侵襲分析。1×105處理過的OS細胞添加到上室，600 ul培養基添加到下室，細胞培養24 h。在倒置光學顯微鏡下(Zeiss，Primovert)隨機取三個視野計算侵襲細胞數。

1.6 生物信息學數據庫使用 通過生物信息學數據庫Targetscan(http://www. targetscan. org/vert_71/)篩選可與BTG2靶向結合的miRNA，再通過Circular RNA Interactome(https://circinteractome. nia. nih. gov/)數據庫預測可與miR-21-5p靶向結合的circRNA。

1.7 熒光素酶報告實驗 設計含有circ0000781野生型序列和突變型序列及BTG2野生型序列和突變型序列的熒光素酶報告質粒(Shanghai GeneChem Co)。將骨肉瘤細胞與報告質粒和miR-21-5p mimic或陰性對照模擬物(NC)共轉染并培養24 h，然后用雙熒光素酶報告系統(Promega)測定熒光素酶活性。

2 結果

2.1 BTG2在骨肉瘤細胞中的表達 PCR結果顯示，與正常人成骨細胞hFOB1.19細胞株(0.99±0.07)相比，骨肉瘤HOS(0.65±0.05)、MG63(0.42±0.04)和Saos-2(0.71±0.06)細胞中BTG2表達水平明顯降低，在MG63細胞中的表達水平最低，故選擇MG63細胞進行后續實驗，見圖1。

圖1 BTG2在細胞株中表達水平Figure 1 BTG2 expression level in cell lines

2.2 BTG2對細胞增殖的影響 通過PcDNA3.1- BTG2質粒在MG63細胞中過表達BTG2，與空載組和空白對照組相比，BTG2過表達組細胞增殖能力明顯降低，差異具有統計學意義(P<0.05)，見表1。

表1 過表達BTG2對細胞增殖的影響Table 1 Effects of overexpression of BTG2 on cell proliferation

2.3 BTG2對細胞侵襲的影響 通過Transwell法發現，與空載組(92.67±5.15)和空白對照組(94.33±4.04)相比，BTG2過表達組細胞侵襲能力明顯降低(36.33±2.52)，差異有統計學意義(P<0.05)，見圖2。

圖2 BTG2對細胞侵襲的影響Figure 2 Effect of BTG2 on invasion

2.4 BTG2可與miR-21-5p靶向結合 通過Targetscan發現miR-21-5p含有BTG2的結合位點，進一步通過熒光素酶報告實驗證實BTG2可與miR-21-5p靶向結合，見圖3、圖4。

圖3 miR-21-5p與BTG2結合位點Figure 3 Binding site of miR-21-5p and BTG2

圖4 雙熒光素酶報告實驗結果Figure 4 Luciferase reporter gene assay

2.5 miR-21-5p負調控BTG2 在MG63細胞中轉染miR-21-5p mimic過表達miR-21-5p，發現與陰性對照組(miR-21-5p mimic NC)和空白對照組(Blank)相比(分別為1.00±0.08，0.97±0.06)相比，miR-21-5p過表達組中BTG2表達水平明顯降低(0.59±0.04)，說明miR-21-5p負調控BTG2的表達，見圖5。

圖5 miR-21-5p負調控BTG2表達Figure 5 miR-21-5p negatively regulates BTG2 expression

2.6 miR-21-5p通過負調控BTG2促進細胞增殖 為證實miR-21-5p通過負調控BTG2促進細胞增殖，本研究設立對照組，miR-21-5p mimic，miR-21-5p mimic NC及miR-21-5p mimic+ BTG2過表達組，檢測細胞增殖能力，結果顯示與對照組和miR-21-5p mimic NC組相比，miR-21-5p mimic組細胞增殖能力明顯增強，但是與miR-21-5p mimic組相比，miR-21-5p mimic+BTG2過表達組細胞增殖能力則有所降低，說明BTG2可逆轉miR-21-5p對細胞增殖的促進作用，見表2。

表2 miR-21-5p通過負調控BTG2促進細胞增殖Table 2 miR-21-5p promoted cell proliferation by negatively regulate BTG2

2.7 miR-21-5p通過負調控BTG2促進細胞侵襲 為證實miR-21-5p通過負調控BTG2促進細胞侵襲，本研究設立對照組，miR-21-5p mimic，miR-21-5p mimic NC及miR-21-5p mimic+ BTG2過表達組，檢測細胞侵襲能力，結果顯示與對照組(39.00±2.00)和miR-21-5p mimic NC組(37.67±4.51)相比，miR-21-5p mimic組(84.00±3.00)細胞侵襲能力明顯增強，但是與miR-21-5p mimic組相比，miR-21-5pmimic+ BTG2過表達組(64.67±4.04)細胞侵襲能力則有所降低，說明miR-21-5p對細胞侵襲的促進作用可被BTG2逆轉，見圖6。

圖6 miR-21-5p通過負調控BTG2促進細胞侵襲Figure 6 miR-21-5p promoted cell invasion by negatively regulate BTG2

2.8 circ0000781可與miR-21-5p靶向結合 通過Circular RNA Interactome發現，circ0000781含有miR-21-5p結合位點，進一步通過通過熒光素酶報告實驗證實circ0000781可與miR-21-5p靶向結合，見圖7、圖8。

圖7 circ0000781與miR-21-5p可能結合位點Figure 7 Binding site of circ0000781 and miR-21-5p

圖8 雙熒光素酶報告實驗結果Figure 8 Luciferase reporter gene assay

2.9 circ0000781負調控miR-21-5p表達 通過PcDNA3.1-circ0000781質粒在MG63細胞中過表達circ0000781，發現與空載組(Vector)和空白對照組(Blank)相比(分別為1.03±0.04，0.97±0.06)，circ0000781過表達組miR-21-5p表達水平明顯降低(0.60±0.07)，證實circ0000781可下調miR-21-5p表達，見圖9。

圖9 circ0000781負調控miR-21-5p表達Figure 9 circ0000781 negatively regulates miR-21-5p expression

2.10 circ0000781通過負調控miR-21-5p上調BTG2表達 本研究設立對照組，circ0000781過表達組，PcDNA3.1-circ0000781 NC(空載組)組及circ0000781過表達+miR-21-5p mimic組，結果發現與對照組(0.70±0.07)和空載組(0.72±0.06)相比，circ0000781過表達組中BTG2表達水平明顯增高(0.90±0.06)，但是與circ0000781過表達組相比，circ0000781過表達+miR-21-5p mimic組中BTG2表達水平則有所降低(0.79±0.04)，說明miR-21-5p可逆轉circ0000781對BTG2表達的促進作用，見圖10。

圖10 circ0000781通過負調控miR-21-5p上調BTG2表達Figure10 circ0000781 upregulated BTG2 expression by negatively regulate miR-21-5p

3 討論

BTO/TOB家族是20世紀90年代發現的一個抗增殖蛋白家族。既往研究發現BTG2在多種組織中均有表達，參與細胞分化、增殖、DNA損傷修復及細胞凋亡等多種生物活性。研究表明BTG2可使細胞周期阻滯在G0和G1期從而抑制細胞增殖，也有研究發現BTG2可通過調控p38和MAPK信號通路下調口腔鱗癌細胞增殖活性[16-17]。Gu等[15，18]的研究證實BTG2在骨肉瘤組織中低表達，并且BTG2可通過PI3K-AKT信號通路抑制骨肉瘤細胞增殖和轉移。本研究也發現BTG2在骨肉瘤細胞中的表達水平相比于正常人成骨細胞明顯降低，并且過表達BTG2可明顯抑制骨肉瘤細胞的增殖和侵襲能力，證實BTG2在骨肉瘤中扮演著抑癌基因的角色，與既往結果相符，表明BTG2是一個極具前景的骨肉瘤治療新靶點。

雖然本研究表明BTG2在骨肉瘤中作為抑癌基因發揮作用，然而調控其表達的上游機制尚不明確。miRNA是一類單鏈非編碼小RNA(18-25nt)，它們廣泛存在于真核生物中并可與靶基因的3-UTR結合，通過mRNA降解或翻譯抑制負調控基因表達[19]。通過生物信息學數據庫Targetscan我們發現BTG2 mRNA的3-UTR中含有miR-21-5p的結合位點，進一步雙熒光素酶報告基因法證實BTG2可與miR-21-5p靶向結合。miR-21-5p對腫瘤發生發展的調控作用已得到廣泛的證實。如miR-21-5p通過靶向SMAD7促進非小細胞肺癌增殖、遷移和侵襲，并且miR-21-5p在復發性胃癌中高表達，可作為胃癌的潛在預后因子[20-21]。除此之外Zhang等[22]的研究發現miR-21-5p在骨肉瘤組織中高表達，然而miR-21-5p在骨肉瘤中的調控網絡尚不清楚。本研究發現miR-21-5p可負調控BTG2的表達，miR-21-5p還可促進骨肉瘤細胞增殖和侵襲，然而miR-21-5p對骨肉瘤細胞增殖和侵襲的促進作用可被BTG2逆轉，證實miR-21-5p作為癌基因通過抑制抑癌基因BTG2的表達促進骨肉瘤細胞增殖和侵襲。

進一步我們探討了miR-21-5p的上游調控基因。基于環狀 RNA(circularRNAs，circRNAs)在腫瘤中的重要作用及其與microRNA的密切關系，我們將目光轉向circRNAs。circRNA是一類雙鏈閉合 RNA，其 3′和 5′末端連接形成共價閉合的環狀結構，大部分屬于非編碼RNA[23]。研究表明，circRNA 在腫瘤中可以作為“海綿”來阻斷及競爭性抑制 miRNA 來發揮作用，因此circRNA可以作為內源性競爭 RNA 參與腫瘤的發病[24]。鑒于circRNA 在腫瘤發生中的重要作用，我們通過生物信息學數據庫Circular RNA Interactome篩選可與miR-21-5p靶向結合的circRNA，發現circ0000781含有miR-21-5p結合位點，接下來的熒光素酶報告實驗證實circ0000781可與miR-21-5p靶向結合，并且circ0000781可負調控miR-21-5p表達。本研究還發現circ0000781可上調BTG2的表達，但是過表達miR-21-5p后BTG2的表達水平則明顯降低，說明miR-21-5p可逆轉circ0000781對BTG2表達的促進作用。

4 結論

本研究結果顯示，BTG2在骨肉瘤細胞中低表達并可抑制骨肉瘤細胞增殖和侵襲。進一步在探尋BTG2上游調控機制的過程中發現circ0000781可作為海綿競爭性抑制miR-21-5p的表達，最終通過上調BTG2的表達降低骨肉瘤細胞的增殖活性和侵襲能力。這表明circ0000781/miR-21-5p/BTG2信號軸可作為骨肉瘤治療的潛在作用靶點。