吳和剛 朱坤婷 王姣姣 莊翔

(宜賓市第一人民醫院病理科，四川 宜賓 644000)

在世界范圍內，宮頸癌是公認的導致女性死亡的主要因素之一；每年大約有53000新增病例及27500死亡病例[1-3]。與宮頸癌發生發展密切相關的主要危險因素有：人類高危乳頭瘤病毒(high-risk human papilloma virus，hrHPV)感染、年齡、吸煙、分娩以及飲食[1，3-7]。宮頸癌的進展過程主要包括以下幾個階段：正常的宮頸上皮，宮頸低級別上皮內瘤變，宮頸高級別上皮內瘤變，在此過程中，hrHPV的感染為主要的致病因素。宮頸上皮感染hrHPV后，宿主細胞的基因發生改變，最終導致多種抑癌因子被沉默以及多種癌基因被激活，從而引起一系列的功能異常改變。Trx1在腫瘤的病理生理改變中起到重要作用，并且在多種腫瘤中檢測到Trx1的異常表達[8]。已有研究發現Trx1參與了各種重要的細胞功能，并且在多種人類腫瘤中表達上調，參與了腫瘤進展過程和耐藥現象[9]。已知Trx1主要是通過與其下游的過氧化物酶相互作用而發揮其抗氧化的功能[10]。本研究將在目前研究的基礎上進一步驗證Trx1在宮頸癌中的表達情況，探討Trx1發揮作用的分子學機制，為抑制宮頸癌的發生發展尋找新的方法和藥物奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料和試劑 鼠抗人GAPDH抗體(Santa Cruz公司)；DAPI(Sigma公司)；兔抗人Trx1，HLA-DR(Bioworld公司)；熒光二抗(Santa Cruz公司)；0.01M檸檬酸鈉緩沖液顆粒、蘇木素染液(重慶鼎國生物技術有限公司)；S-P免疫組化試劑盒、DAB染色試劑盒(北京中杉金橋公司)； PrimeSTAR HS DNA Polymerase(Takara公司)。

1.2 方法

1.2.1 組織標本收集：宜賓市第一人民醫院病理科標本庫中提取3對宮頸癌及癌旁組織標本。

1.2.2 組織蛋白檢測：稱取相同重量的宮頸癌組織，放入EP管中備用。加入預冷的含PMSF的RIPA裂解液，用勻漿器使組織完全裂解后，14000×g，4℃離心取上清，-80℃保存。取上清液加入loading buffer，進行SDS-PAGE以及Western blot檢測蛋白表達。

1.2.3 基因表達檢測：根據GenBank 提供的SND1 cDNA 序列(NM_014390.4)用Primer 5.0設計合成引物。上游5′-AACAAGAAACTGCGTCCCCT-3′；下游5′-GATGTGCAGCCAGCCGATAA-3′。GAPDH引物序列：上游5，-ACAGTCAGCCGCATCTTCTT-3′；下游5′-GTCAAAGGTGGAGGAGTGGG-3′。從宮頸癌中提取人的mRNA，以其為模板反轉錄合成cDNA后，進行PCR擴增各組SND1基因。并用瓊脂糖凝膠電泳檢測表達情況。

1.2.4 免疫組織化學檢測蛋白定位和表達：人宮頸癌組織和癌旁組織固定并制成蠟塊后，對組織進行切片、脫蠟、梯度乙醇水化、通透、抗原修復、一抗Trx1于4℃孵育過夜、顯色，最后復染和封片。于光學顯微鏡下觀察結果并拍照。

1.2.5 免疫熒光檢測蛋白定位和表達：人宮頸癌組織和癌旁組織在冰凍切片機上切片后，對組織進行通透、封閉、一抗Trx1和HLA-DR于4℃孵育過夜、第二天加入稀釋的熒光二抗，甘油封片后，熒光顯微鏡下觀察結果并拍照。

2 結果

2.1 Trx1蛋白在宮頸癌和癌旁組織中的表達情況 Trx1在宮頸癌組織中高表達，在癌旁組織中表達相對較低，差異具有統計學意義(P<0.05)，見圖1。

圖1 Trx1蛋白在宮頸癌組織和癌旁組織中的表達Figure 1 The expression of Trx1 in cervical cancer and adjacent tissues

2.2 RT-PCR結果SND1在宮頸癌組織中表達顯著高于癌旁組織，見圖2。

圖2 SND1基因的RT-PCR檢測結果Figure 2 Identification of gene expression of SND1 by RT-PCR

2.3 免疫組織化學實驗結果 與對照組相比，Trx1蛋白在宮頸癌組織中表達明顯高于癌旁組織，并且主要定位于細胞質中，見圖3。

圖3 免疫組織化學實驗鑒定Trx1在宮頸癌和癌旁組織中的表達Figure 3 Verification of Trx1 in cervical cancer and adjacent tissues by IHC

2.4 免疫熒光實驗結果 Trx1和HLA-DR均表達在胞漿中，且Trx1和HLA-DR 表達有共定位現象，見圖4。

圖4 免疫熒光觀察Trx1與HLA-DR的共定位Figure 4 Co-localization of Trx1 and HLA-DR in cervical cancer tissues by IF注：A.DAPI在宮頸癌組織中；B.Trx1在宮頸癌組織中；C.HLA-DR在宮頸癌組織中；D.宮頸癌組織中Trx1和HLA-DR共定位現象(200×)

3 討論

目前為止，宮頸癌中已發現了多種分子層面改變。最近的研究證明多種致癌因子能夠促進宮頸癌的進展過程，其中包括HMAG1、KLF5、miR-146b-3p以及多種長鏈非編碼RNAs[11-14]。另一方面，miR-27a，miR-328等被證實具有抑制宮頸癌的作用[15，16]。同時，通過高通量的基因測序，發現了在宮頸癌中多種基因突變，如FAT1，MLL3和FADD等[16]。以上這些研究都提示了在宮頸癌的發生發展過程中存在多種機制及信號通路，然而Trx1與宮頸癌的關系的研究并不充分。

Trx1是一種12 kDa的具有氧化還原活性的二硫酚蛋白質；它位于半胱氨酸-甘氨酸-脯氨酸-半胱氨酸的活性區域，并且在人體內廣泛存在[17]。多種應激因素可以誘導產生這種防御蛋白；Trx1具有抗氧化、抗凋亡和抗炎等作用[18]。已有研究證明Trx1與多種腫瘤的發生發展有關[8]。本實驗通過檢測人宮頸癌和癌旁組織中Trx1蛋白的表達，證明了Trx1在宮頸癌組織中顯著高表達(圖1)，這與它在其他腫瘤中的表達一致[8]，同時也提示Trx1很可能促進宮頸癌的發生發展過程。目前普遍認為SND1也能促進多種人類腫瘤的進展[19]。本研究檢測了宮頸癌和癌旁組織中SND1 mRNA的表達情況，發現其在宮頸癌組織中表達高于癌旁組織，推測SND1也能促進宮頸癌的進展，并且與Trx1在宮頸癌中的表達趨勢很可能是一致。

基因多態性與多種腫瘤的發生發展有關[20]。最近的研究發現人白細胞抗原的多態性突變與宮頸癌的進展有關[20]。通過對多個非洲國家(南非、津巴布韋、摩洛哥、蘇丹、突尼斯、塞內加爾)的研究，確定了TGFBT10C、TGFBc509T、HLADRB1、CCR2V6L、IL-10-1082G/A和FasR-1377G的基因多態性與宮頸癌的危險因素相關[21]。本研究中檢測了宮頸癌組織中Trx1與HLA-DR表達以及定位，發現二者均在宮頸癌細胞中表達，且主要定位于細胞質中；通過不同的熒光標記兩種蛋白質，還確定了這兩種蛋白質在宮頸癌細胞中存在共定位現象。這一發現提示了Trx1和HLA-DR很可能存在相互作用。結合已有報道[21]，我們推測Trx1與HLA-DR之間可能存在相互作用，并且對宮頸癌的發生發展起到促進作用。

4 結論

本研究證實了Trx1在宮頸癌中顯著高表達，且與HLA-DR可能存在相互作用，但是兩者之間發生相互作用的機制以及如何影響宮頸癌的發生發展仍不夠清楚。后期將繼續探討它們之間的相互作用是通過哪些信號通路或者中間分子實現的，以及對宮頸癌的增殖轉移等生物學特征產生怎樣的促進作用，以便為宮頸癌的預后判斷以及早期診斷提供新的思路和方法。