酶聯免疫吸附法和免疫親和柱-高效液相色譜法在檢測飼料中黃曲霉毒素B1含量中的比對研究

段春宇

摘要： 為了探討酶聯免疫吸附法檢測飼料中黃曲霉毒素B1含量的可行性，試驗采用酶聯免疫吸附法（ELISA法）比對免疫親和柱-高效液相色譜法（IAC-HPLC法），對飼料中黃曲霉毒素B1含量進行了檢測，對檢測結果的準確度、精密度和樣品加標回收率進行了分析。ELISA法線性方程相關系數為0.9952，相對標準偏差（RSD）為1.6%～8.1%，平均加標回收率為105.6%～111.8%。結果表明，ELISA法的準確性、重現性、穩定性好;且ELISA法檢測結果與IAC-HPLC法檢測結果的相對標準偏差（RSD）為5.4%～19.2%，兩種方法的檢測結果的偏差可以接受，表明ELISA法能滿足檢測需求。

關鍵詞：酶聯免疫吸附法;免疫親和柱-高效液相色譜法;飼料;黃曲霉毒素B1

黃曲霉毒素，是黃曲霉菌和寄生曲霉菌分泌的次級代謝產物，主要分為B、G類，其中黃曲霉毒素B1的含量最多，危害性最大，該毒素具有強致癌性、致畸性、致突變性。黃曲霉毒素B1可以侵害畜禽肝臟，導致肝臟變性、壞死等，進而導致畜禽肺臟、腎臟、脾臟、胃、直腸等器官發生病變;導致畜禽的免疫力降低;導致畜禽生長發育遲緩，采食量降低、食物利用率低;母畜不育或產仔少等問題。

黃曲霉毒素B1主要污染糧食作物及其副產品，其中，花生和玉米及其副產品污染最為嚴重，幾乎無法避免，該毒素性質穩定，持續高壓滅菌2h僅能降低其25%～33%的毒力，而且只有在282℃的高溫下才能被裂解，所以世界各國都嚴格設定“限量標準”。黃曲霉毒素B1污染飼料主要源于原料污染、儲存條件不當飼料霉變污染和加工過程污染。要預防黃曲霉毒素B1毒害畜禽，就要及時準確測定飼料原料及飼料成品中黃曲霉毒素B1含量，因而制定準確實用的檢測方案至關重要，進而加強原料的篩選、飼料的品控，更好的保護畜禽健康，發揮畜禽生產性能，將飼料價值充分發揮。

飼料中黃曲霉毒素B1的檢測方法較多，有薄層色譜法、高效液相色譜法、高效液相色譜-質譜聯用法、酶聯免疫吸附法、膠體金免疫層析快速檢測試紙條等，本文采用免疫親和柱-高效液相色譜法和酶聯免疫吸附法檢測飼料原料和成品中黃曲霉毒素B1的含量，并通過比對分析，確定ELISA法檢測飼料中黃曲霉毒素B1含量的可行性。

2 免疫親和柱-高效液相色譜法材料與方法

2.1 試劑與耗材

甲醇（色譜純，默克公司）、黃曲霉毒素B1標準品（Sigma公司）、黃曲霉毒素免疫親和柱（ROMER公司）、氯化鈉（分析純）、玻璃纖維濾紙等。

2.2 主要儀器

Agilent 1260高效液相色譜儀配熒光檢測器、光化學衍生器、高速萬能粉碎機、高速混勻器、固相萃取儀等。

2.3 方法

1）標準溶液的配制 黃曲霉毒素B1標準品（Sigma公司），原液濃度為20μg/mL，用甲醇溶液逐級稀釋成100ng/mL的工作液。再用流動相分別稀釋成0.10、0.50、2.0、5.0、10.0、20.0和50.0ng/mL的標準工作液。

2）樣品前處理 試樣制備參照GB/T 20195—2006，用高速萬能粉碎機研磨后過1mm孔篩，混勻，儲存于封閉容器，避光低溫保存，待檢。稱取50.0g待檢樣品于250mL具塞錐形瓶中，加入5g氯化鈉和125.0mL的甲醇水（70+30）溶液混勻，振蕩器200rpm/min震蕩30min，定量濾紙過濾后，準確移取10.0mL濾液，加入20.0mL超純水稀釋混勻，玻璃纖維濾紙過濾，至濾液澄清，收集濾液于干凈離心管中做上樣液。

將免疫親和柱連接于10.0mL的玻璃定量管下，取15.0mL上樣液，過免疫親和柱，流速1～2drop/s;待柱內液體排干后，分別兩次用10.0mL超純水清洗柱子，流速2～3drop/s;待柱內液體全部排干后，增大泵壓，抽干免疫親和柱內液體，用1.0mL甲醇洗脫柱子，流速自然重力，直至2～3mL空氣通過柱子，收集全部洗脫液于玻璃定量管中，加超純水定容為2.0mL。定容后的洗脫液用0.22μm的有機微孔過濾器過濾到樣品瓶中，待檢。

3）色譜條件 色譜柱：Agilent C18色譜柱（規格：150×4.6mm，粒度5μm）;流動相：超純水+甲醇+乙腈（60+20+20）等度洗脫;流速：1.0mL/min;FLD波長：激發波長360nm，發射波長440nm;柱溫40℃;進樣量：50μL。

采用外標法，根據樣品峰保留時間進行定性，峰面積進行定量分析。

3 酶聯免疫吸附法材料與方法

3.1 試劑與耗材

黃曲霉毒素B1酶聯免疫試劑盒（ROMER公司）、超純水、針式過濾器。

3.2 主要儀器

酶標測定儀：內置450nm濾光片、回旋振蕩器、渦旋振蕩器、微量移液器等。

3.3 方法

1）樣品前處理 稱取20.0g樣品于250mL具塞錐形瓶中，加入100.0mL甲醇水（70+30）溶液提取，置于回旋振蕩器上震蕩萃取3min，靜置樣品，定性濾紙過濾。用1mol/L的NaOH和HCl微調濾液pH 6～8，如果樣品酸性比較強，可以使用高濃度的酸堿進行調節，盡量減少酸堿的用量。用試劑盒提供分析緩沖液1：1稀釋濾液，于1mL離心管中，用渦旋振蕩器混勻，待測。

2）試劑盒操作過程 實驗室溫度控制在20～25℃，從冰箱中拿出試劑盒，取出試劑盒中所有試劑回溫2～3h;用八道移液器取（綠色瓶蓋）酶聯偶合物200μL，放入綠色預混合板中;單道移液器分別取100μL各濃度標準品和樣品，放入以上預混合板中，用八道移液器混合四次（注意溶液不要溢出，防止各孔污染）;將孔板進行編號，以便記錄標準品、樣品位置，用八道移液器將上述混合液100μL轉移至抗體包被的孔中，室溫避光孵育15min，轉移過程中不要有氣泡;蒸餾水清洗4次拍干（清洗時各孔不要相互污染），用洗瓶沖洗時，不要直接沖洗孔，側著清洗，防止底部的物質沖出，清洗后輕甩一下，在吸水紙上快速拍干孔板，不要大幅度用手甩板，孔板中沒有液滴即可;拍干后，用八道移液器每孔加入（藍色瓶蓋）底物100μL;室溫光孵育5min;時間到后，用八道移液器每孔加入（紅色瓶蓋）終止液100μL，輕輕搖勻后檢測;將孔板轉移到酶標儀450nm（帶630nm示差波長）讀取每孔的吸光度值。

4 結果與分析

4.1 結果

本研究選用空白玉米進行加標回收試驗，樣品名稱加標1、加標2和加標3，黃曲霉毒素B1添加濃度分別為10.0、20.0和50.0μg/kg，選取花生粕、玉米胚芽粕、奶牛配合飼料樣品各一個，分別用IAC-HPLC法和ELISA法各重復3次試驗。結果見表1。

1）免疫親和柱-高效液相色譜法的工作曲線、準確度、精密度 標準系列經上機檢測，以測得峰面積為縱坐標，標準品濃度為橫坐標，得到黃曲霉毒素B1標準品的峰面積（Y）的線性方程Y=10.00282X-1.71180，相關系數為0.99976，表明在0.10 ～50.0ng/mL范圍內，線性關系良好。加標回收試驗和重復性試驗是驗證方法準確度和精密度的重要手段。按上述IAC-HPLC法試驗方法，測試結果見表1。本結果的平均加標回收率為93.0%～99.0%，相對標準偏差（RSD）為0.8%～4.8%。說明此方法準確度高，穩定性好。黃曲霉毒素B1的標準樣品色譜圖及待檢樣品色譜圖分別見圖1和圖2。

2）酶聯免疫吸附法的準確度、精密度 試劑盒標準系列經上機檢測，在ROMER公司提供計算軟件上計算結果，線性方程相關系數為0.9952，表明在0.10 ～50.0ng/mL范圍內，線性關系良好。按上述ELISA法試驗方法，測試結果見表1。本結果的平均加標回收率為105.6%～111.8%，RSD為1.6%～8.1%。ELISA法的準確度高，穩定性可以接受。ELISA法檢測結果與IAC-HPLC法檢測結果的RSD為5.4%～19.2%，兩種方法結果的偏差表明ELISA法準確度可以接受。

4.2 分析

使用IAC-HPLC法和ELISA法分別對飼料樣品進行檢測，通過表1數據結果可以看出，IAC-HPLC法測值均小于ELISA法，IAC-HPLC法前處理過程需要過免疫親和柱，在過柱過程中，黃曲霉毒素B1沒有全部收回，有微量損失，從而導致整體檢出率偏低。ELISA法檢測結果與IAC-HPLC法檢測結果的RSD為5.4%～19.2%，其中當樣品中黃曲霉毒素B1含量≥10μg/kg時，兩種方法結果的RSD為5.4%～9.0%，只有奶牛配合飼料黃曲霉毒素B1含量較低時，兩種方法結果的RSD值偏差較大，分析原因一是IAC-HPLC方法在過柱過程中，黃曲霉毒素B1有損失對檢測結果影響較大，二是ELISA法檢測低含量黃曲霉毒素B1時，存在假陽性的情況。而且隨著黃曲霉毒素B1濃度增加，兩種方法結果的重復性呈現良好趨勢。因此，ELISA法檢測飼料中黃曲霉毒素B1含量準確度較高，可以用于飼料中黃曲霉毒素B1批量檢測。

5 結論

綜上所述，ELISA法準確度高、穩定性好，能夠滿足日常監測的需求。與IAC-HPLC法相比，ELISA法不需要對樣品進行免疫親合柱過柱等復雜的前處理，且ELISA法可以同時檢測多個樣品，有效的提高了檢測效率，節省了檢測成本，可以作為日常批量監測的首選方法。因IAC-HPLC法檢測結果可靠性強、可以有效避免樣品檢測的假陽性情況，因此，在實際檢測過程中可以采用ELISA法對大批量飼料樣品中黃曲霉毒素B1進行初篩快速測定，再采用IAC-HPLC法對疑似超標陽性樣品進行定量確認檢測。