口蹄疫O型LPB-ELISA免疫抗體高通量定性檢測技術(shù)的建立

祁君 王麗

摘要：為提高偶蹄動(dòng)物口蹄疫O型液相阻斷酶聯(lián)免疫吸附（LPB-ELISA）免疫抗體檢測效率，優(yōu)化動(dòng)物疫情監(jiān)測策略，提高動(dòng)物疫病防控效能。結(jié)合基層一線對(duì)免疫質(zhì)量評(píng)價(jià)實(shí)際需求及財(cái)力人力等因素，在該試驗(yàn)通用操作步驟基礎(chǔ)上，特對(duì)操作步驟及96孔ELISA板檢測樣品布局進(jìn)行了技術(shù)改進(jìn)。改進(jìn)后的1塊ELISA板可檢測樣品80份，在檢測通量上較試劑盒使用說明書標(biāo)明1塊ELISA板可檢測樣品10～20份增加到4～8倍，在ELISA板檢測樣品利用率上從10.42%～20.83%提高到83.33%，在檢測費(fèi)用、檢測時(shí)效及人力成本上則可壓縮4～8倍。同時(shí)，亦可減少試驗(yàn)廢棄物產(chǎn)生量，有一定的社會(huì)效益及生態(tài)效益。改進(jìn)后的口蹄疫O型LPB-ELISA免疫抗體高通量定性檢測技術(shù)，適用于大樣本情況下以免疫抗體合格率為指標(biāo)的免疫質(zhì)量評(píng)價(jià)工作，尤其對(duì)檢測數(shù)量多、經(jīng)費(fèi)人員配置有限，且要求出結(jié)果快的基層一線，具有很好的現(xiàn)實(shí)操作性和借鑒性。

關(guān)鍵詞：口蹄疫;LPB-ELISA;免疫抗體;高通量;定性檢測

口蹄疫是由口蹄疫病毒引起的偶蹄動(dòng)物急性、熱性、接觸性傳染病，對(duì)畜牧業(yè)健康發(fā)展危害巨大，該病被世界動(dòng)物衛(wèi)生組織列入法定上報(bào)傳染病[1]。2005年5月—2017年1月，我國共發(fā)布了125次口蹄疫疫情，主要為O型和A型，口蹄疫防控形勢依然嚴(yán)峻[2]。目前，我國對(duì)口蹄疫采取強(qiáng)制免疫的防控政策，而提高免疫質(zhì)量無疑是對(duì)該病防控最有力的措施之一。LPB-ELISA試驗(yàn)則是目前用于評(píng)價(jià)免疫質(zhì)量方面普遍采用的技術(shù)，但該試驗(yàn)通用操作步驟較為繁瑣，尤其是被檢血清倍比稀釋次數(shù)多、ELISA板利用率低，在進(jìn)行大量樣品檢測時(shí)，需要配備較多檢測人員及工作經(jīng)費(fèi)，開展工作耗時(shí)費(fèi)力。有研究者就基層實(shí)驗(yàn)存在諸多不利的現(xiàn)實(shí)條件對(duì)獸醫(yī)血清學(xué)試驗(yàn)方法進(jìn)行了改進(jìn)，今后如何在諸多不利條件下更加準(zhǔn)確快速地開展血清學(xué)試驗(yàn)，仍有不斷努力的空間[3]。本文在LPB-ELISA試驗(yàn)通過操作技術(shù)基礎(chǔ)上，參照口蹄疫診斷技術(shù)標(biāo)準(zhǔn)（GB/T18935—2018），以定性需求為主要考量目的，合理設(shè)置被檢血清稀釋度（免疫抗體合格滴度），將被檢血清多步倍比稀釋步驟進(jìn)行一步到位稀釋改進(jìn)，并對(duì)ELISA板檢測布局進(jìn)行了優(yōu)化，建立起了基于以免疫抗體合格率為評(píng)價(jià)指標(biāo)的口蹄疫O型LPB-ELISA免疫抗體高通量定性檢測技術(shù)，為基層開展口蹄疫免疫抗體質(zhì)量評(píng)價(jià)提供一種高效、快速、經(jīng)濟(jì)的檢測方法。

1 材料與方法

1.1 材料

診斷試劑：10塊裝口蹄疫O型LPB-ELISA抗體檢測試劑盒（內(nèi)含：口蹄疫O型病毒抗原、口蹄疫O型豚鼠抗體工作液、兔抗豚鼠IgG-HRP工作液、口蹄疫O型陽性對(duì)照血清、口蹄疫陰性對(duì)照血清、25倍PBST濃縮液、終止液、TMB底物A溶液、TMB底物B溶液、兔抗包被ELISA板、U型96孔抗原抗體反應(yīng)板、移液槽、封板膜），由蘭州獸研生物科技有限公司生產(chǎn)，自制去離子水或蒸餾水;主要器材：酶標(biāo)儀、洗板機(jī)、微量振蕩器、生化恒溫培養(yǎng)箱、冷藏柜、96孔血清稀釋板（加樣槽）、量筒（10、100、1，000mL等不同規(guī)格）、微量可調(diào)移液器（5、10、50、100、200、300、1，000μL等不同規(guī)格）、吸水紙巾、錫紙;被檢樣品：偶蹄動(dòng)物血清。

1.2? 方法

1）試劑準(zhǔn)備。稀釋PBST濃縮液：將25倍PBST濃縮液用去離子水或蒸餾水稀釋成1倍PBST（1份濃縮液加24份去離子水或蒸餾水進(jìn)行稀釋），用于洗板或稀釋血清和病毒抗原。

2）試驗(yàn)程序。①稀釋被檢血清：被檢血清稀釋布局如圖1所示，在96孔血清稀釋板第1～10列每孔各加315μL的1倍PBST，每孔再各加5μL的被檢血清后混勻，此時(shí)每孔被檢血清的稀釋度為1：64。

②平移稀釋后的被檢血清并稀釋陰陽性對(duì)照血清。將稀釋度為1：64的被檢血清以50μL/孔的量，從96孔血清稀釋板按次序平移至U型抗原抗體反應(yīng)板上。在U型抗原抗體反應(yīng)板第11列每孔各加50μL的1倍PBST，在第11列A11孔加50μL的陽性對(duì)照血清，然后吹打3次，以50μL/孔沿列連續(xù)倍比稀釋至H11孔后棄去50μL液體，由于陽性對(duì)照血清在廠家生產(chǎn)時(shí)已預(yù)先作了8倍稀釋，此時(shí)第11列8個(gè)孔的陽性對(duì)照血清稀釋度則為1：16～1：2048。在第12列A12到B12兩個(gè)孔每孔各加50μL的1倍PBST，在A12孔加50μL的陰性對(duì)照血清，然后吹打3次以50μL/孔連續(xù)倍比稀釋至B12孔后棄去50μL液體，此時(shí)A12到B12兩個(gè)孔陰性對(duì)照血清的稀釋度則為1：2～1：4。

③加病毒抗原。將病毒抗原用1倍PBST稀釋至工作濃度后，以50μL/孔的量加入到U型抗原抗體反應(yīng)板上的被檢血清、陰陽性對(duì)照血清的稀釋孔內(nèi)。如圖2所示，由于加入了等量的病毒抗原液體，此時(shí)被檢血清的稀釋度則從1：64變?yōu)?：128，陽性對(duì)照血清的稀釋度則從1：16～1：2048變?yōu)?：32～1：4096，陰性對(duì)照血清的稀釋度則從1：2～1：4變?yōu)?：4～1：8。同時(shí)，在第12列E12到H12四個(gè)孔每孔僅加100μL稀釋至工作濃度的病毒抗原。封板震蕩，4℃靜置過夜或37℃孵育90min。

④平移U型板內(nèi)液體。將U型板內(nèi)各孔液體以50μL/孔的量按次序平移至兔抗包被ELISA板上，封板，37℃孵育60min。

⑤洗板加豚抗。洗ELISA板6次，在吸水紙巾上甩拍干，以50μL/孔的量均加口蹄疫O型豚鼠抗體工作液，封板，37℃孵育60min。

⑥洗板加兔抗。洗ELISA板6次，在吸水紙巾上甩拍干，以50μL/孔的量均加兔抗豚鼠IgG-HRP工作液，封板，37℃孵育60min。

⑦洗板加底物溶液。洗ELISA板6次，在吸水紙巾上甩拍干，將TMB底物A溶液和B溶液以1：1比例混勻，以50μL/孔的量均加混勻后的底物溶液，封板，37℃溫育15min進(jìn)行顯色反應(yīng)。

⑧加終止液并讀值。以50μL/孔的量均加終止液，混勻后在酶標(biāo)儀上讀取OD450nm值。

3）試驗(yàn)成立條件。每塊ELISA板設(shè)4孔病毒抗原對(duì)照，病毒抗原對(duì)照至少兩孔OD450nm值在1.0～2.0范圍內(nèi)，陽性血清對(duì)照抗體滴度應(yīng)在1：512～1：2048之間，陰性血清對(duì)照抗體滴度應(yīng)小于1：4。

4）結(jié)果判定。以病毒抗原對(duì)照OD450nm平均值的50%為臨界值（對(duì)照值），被檢血清稀釋孔OD450nm值大于臨界值的為陰性孔，小于或等于臨界值的為陽性孔。被檢血清抗體滴度大于或等于1：128判為陽性（免疫抗體合格），被檢血清抗體滴度小于1：128判為陰性（免疫抗體不合格）。

2 結(jié)果與分析

從表1可看出，在檢測通量上，改進(jìn)后的1塊ELISA板可檢測樣品份數(shù)較試劑盒使用說明書原有布局增加到4～8倍，在檢測樣品ELISA板利用率上則大幅度提高到83.33%。同時(shí)，在檢測試劑盒費(fèi)用、檢測時(shí)效及人力成本上則可壓縮4～8倍，也可減少診斷液及相關(guān)耗材等試驗(yàn)廢棄物產(chǎn)生量，有較為積極的社會(huì)效益及生態(tài)效益。

3 討論

3.1 關(guān)于定性檢測與定量檢測的適用性

就目前基層一線對(duì)口蹄疫免疫質(zhì)量評(píng)價(jià)而言，主要是基于農(nóng)業(yè)農(nóng)村部所要求的免疫抗體合格率這一指標(biāo)來評(píng)價(jià)偶蹄動(dòng)物口蹄疫免疫質(zhì)量的。免疫抗體合格率大于等于70%的畜群，則表明免疫質(zhì)量較高，一定范圍內(nèi)建立起了有效的免疫屏障，在免疫期內(nèi)牲畜對(duì)口蹄疫疫病具有較強(qiáng)的免疫持久性和保護(hù)力。免疫抗體合格率小于70%的畜群，則表明畜群免疫質(zhì)量較差，存在較大的疫病傳播風(fēng)險(xiǎn)，提示需強(qiáng)化免疫。因此，在此評(píng)價(jià)指標(biāo)和實(shí)際工作考量下，合格或不合格則是免疫抗體檢測的關(guān)鍵，此評(píng)價(jià)只需定性結(jié)果，無需具體抗體滴度。本文所建立的口蹄疫O型LPB-ELISA免疫抗體高通量定性檢測技術(shù)，則能很好地適用于基于此指標(biāo)下大樣本的定性檢測需求，也類比適用于A型和亞洲I型LPB-ELISA免疫抗體的定性檢測。一個(gè)好的疫病防控路線，一定是綜合權(quán)衡技術(shù)、財(cái)力、人力、推行難易程度等社會(huì)各個(gè)因素來制定的，而不是單純只考慮某一因素，從這個(gè)角度來說，本定性檢測技術(shù)也是與基層一線實(shí)際情況緊密結(jié)合，是基層用于口蹄疫免疫質(zhì)量評(píng)價(jià)很好的選擇。也有研究者針對(duì)地方外調(diào)畜數(shù)量大、檢測量多的實(shí)際情況，以另一個(gè)思路對(duì)口蹄疫LPB-ELISA方法進(jìn)行了改進(jìn)，也取得類似本文改進(jìn)后的良好效果[4]。湯天元等[5]對(duì)5塊裝口蹄病毒O型LPB-ELISA抗體檢測試劑盒操作步驟進(jìn)行了改進(jìn)，改進(jìn)后的每份樣品檢測成本由原來32～16元降低到4元，這也與本文改進(jìn)后可壓縮檢測費(fèi)用4～8倍相吻合。而對(duì)于研究分析免疫抗體消漲、抗體滴度高低分布及小樣本的檢測等工作時(shí)，則適宜選擇試劑盒說明書中的定量檢測技術(shù)。

3.2 關(guān)于血清稀釋比例及抗體滴度合格值的設(shè)定

考量到微量移液器精度、吸頭質(zhì)量、血清稀釋板孔容量、基層單位操作人員嫻熟程度等，將被檢血清稀釋設(shè)定為315μL的1倍PBST加5μL的被檢血清，一步將血清稀釋到1：64，此稀釋方案適合于基層普通操作人員和操作設(shè)備。也可將血清的稀釋設(shè)定為157.5μL的1倍PBST加2.5μL的被檢血清，此血清稀釋方案則對(duì)操作人員和設(shè)備提出的要求較高，對(duì)基層來說不宜采用，而對(duì)于各方面條件成熟者，亦可嘗試采用此稀釋方案。對(duì)于630μL的1倍PBST加10μL的被檢血清的稀釋方案，則稀釋液體體系過大，對(duì)血清稀釋板孔容量有較高的要求，且操作不便，不宜采用。另外，參照國標(biāo)，將1：128設(shè)定為抗體滴度合格值，對(duì)于大樣本下的定性檢測現(xiàn)實(shí)工作來說，介于1：128～1：64之間的疑似結(jié)果極少，從統(tǒng)計(jì)學(xué)的角度來說，極少的疑似結(jié)果對(duì)免疫抗體合格率的統(tǒng)計(jì)影響可忽略不計(jì)，從提高免疫質(zhì)量的角度來說，即使有較多樣品免疫抗體滴度處于疑似區(qū)、游走于合格線附近，表明免疫對(duì)象免疫抗體水平衰減厲害，免疫質(zhì)量不高，對(duì)疫病起不到很好的保護(hù)力，亦需強(qiáng)化免疫。因此，未設(shè)定疑似血清稀釋滴度，對(duì)于血清免疫抗體滴度小于1：128的，直接判定為免疫抗體不合格。

3.3 關(guān)于試驗(yàn)操作注意的關(guān)鍵點(diǎn)

LPB-ELISA試驗(yàn)操作繁瑣，周期長，需要注意的事項(xiàng)多，操作中稍有不慎就會(huì)導(dǎo)致試驗(yàn)結(jié)果發(fā)生偏差或試驗(yàn)失敗[6]。在檢測前，要將試劑盒和被檢血清恢復(fù)至室溫狀態(tài)，打開ELISA板真空包裝膜后需盡快用完，在操作中要保持ELISA板底部不被臟物污染，確保酶標(biāo)儀讀數(shù)準(zhǔn)確，要避免同一廠家不同批次、不同廠家的試劑混合使用;有研究者對(duì)該試驗(yàn)的測量不確定度在嚴(yán)格控制反應(yīng)時(shí)間、反應(yīng)溫度等因素下進(jìn)行了評(píng)估，找出影響檢測質(zhì)量的主要因素為酶標(biāo)儀的測量和1：128稀釋倍數(shù)下的樣品濃度，其對(duì)不確定度影響最大[7]，而本文一步稀釋法所加入的被檢血清只有5μL，量極少，易導(dǎo)致加樣量不準(zhǔn)，因此要嚴(yán)格加樣操作，且在加入后要充分混勻，保證稀釋比例準(zhǔn)確，對(duì)于酶標(biāo)儀要定期檢定校準(zhǔn)，加強(qiáng)日常維護(hù)管理，規(guī)范操作，在檢測時(shí)可提前打開酶標(biāo)儀運(yùn)行數(shù)分鐘待穩(wěn)定后再行檢測;TMB底物溶液的保存、配置、加樣等環(huán)節(jié)須做好避光措施，且現(xiàn)用現(xiàn)配，如出現(xiàn)溶液變色則棄之勿用;眼觀底物顯色情況，結(jié)合操作經(jīng)驗(yàn)，靈活掌握顯色時(shí)間，可對(duì)其進(jìn)行適當(dāng)調(diào)整，顯色時(shí)間過長或過短，都可能會(huì)導(dǎo)致試驗(yàn)條件不成立;終止反應(yīng)后，要盡快對(duì)ELISA板讀值，一般情況下拖延讀值時(shí)間不宜超過30min。

4 結(jié)論

口蹄疫O型LPB-ELISA免疫抗體高通量定性檢測技術(shù)，一塊ELISA板可定性檢測樣品80份，能很好地服務(wù)于檢測數(shù)量多、且要求出結(jié)果快的基層一線，對(duì)基層技術(shù)人員具有很好的實(shí)用性和借鑒性。同時(shí)，可大幅度節(jié)約檢測費(fèi)用、降低人力成本，對(duì)保護(hù)環(huán)境也具有積極作用。

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