“心腦同調(diào)”法電針對焦慮大鼠行為學(xué)及血清相關(guān)因子的影響

許璐凡 王軍 李詩夢 李鳴 惠志遠 楊磊

摘要 目的：觀察“心腦同調(diào)”法電針對焦慮模型大鼠行為學(xué)及血清心房利鈉肽（ANP）、促腎上腺皮質(zhì)激素釋放激素（CRH）、皮質(zhì)酮（CORT）含量的影響，探討針刺治療焦慮障礙的效應(yīng)及部分作用機制。方法：32只SD大鼠隨機分為正常組、模型組、電針組和假針組，每組8只，制備焦慮大鼠模型。15 d后，采用高架十字迷宮實驗與自發(fā)活動開場實驗測試大鼠行為學(xué)變化，酶聯(lián)免疫吸附試驗法檢測血清ANP、CRH、CORT的含量。結(jié)果：與正常組比較，模型組大鼠進入開臂次數(shù)百分比（OE%）、開臂停留時間百分比（OT%）明顯降低（均P<0.01），水平得分、垂直得分明顯下降（均P<0.05），血清ANP、CRH、CORT含量顯著升高（均P<0.01）;與模型組比較，電針組OE%、OT%值明顯升高（均P<0.01），水平得分、垂直得分明顯升高（均P<0.05），血清ANP、CRH、CORT含量顯著降低（均P<0.01）。結(jié)論：焦慮模型大鼠血清中ANP、CRH、CORT含量異常可能是導(dǎo)致其發(fā)病的機制之一;“心腦同調(diào)”法電針可能通過調(diào)節(jié)三者之間的紊亂狀態(tài)而達到對焦慮障礙的治療作用。

關(guān)鍵詞 心腦同調(diào);電針;焦慮模型大鼠;行為學(xué);心房利鈉肽;促腎上腺皮質(zhì)激素釋放激素;皮質(zhì)酮

Effect of Electro-acupuncture for Simultaneous Regulation of the Brain and Heart on Behaviors and Serum-related Factors in Anxiety Model Rats

XU Lufan1，WANG Jun1，LI Shimeng2，LI Ming1，HUI Zhiyuan1，YANG Lei1

（ Department of Acupuncture，Dongzhimen Hospital，Beijing University of Chinese Medicine，Beijing 100700，China; 2 Department of Ophthalmology，Dongfang Hospital，Beijing University of Chinese Medicine，Beijing 100078，China）

Abstract Objective：To observe the effect of electro-acupuncture for simultaneous regulation of the brain and heart on the behaviors and serum content of atrial natriuretic peptide（ANP），coticotropin-releasing hormone（CRH），and corticosterone（CORT） of anxiety model rats and explore the anti-anxiety mechanism.Methods：Thirty-two healthy male SD rats were randomized into normal，model，electro-acupuncture，and sham acupuncture group，with 8 in each group，and chronic unpredictable stress was used to induce anxiety in rats.After 15 days，the elevated plus maze test and open field test were carried out to observe the behavioral changes of rats with anxiety，and the serum levels of ANP，CRH，and CORT were detected by enzyme-linked immunosorbent assay（ELISA）.Results：The percentage of times of entering the open arms（OE%） and percentage of time on open arms（OT%） in the elevated plus maze test were decreased（P<0.01），and the number of squares crossed and the number of rearings in the open field test were reduced（P<0.05） in the model group as compared with those in the normal group.Moreover，the serum levels of ANP，CRH，and CORT in the model group were higher than those in the normal group（P<0.01）.OE% and OT% were raised（P<0.01） and the number of squares crossed and the number of rearings were increased（P<0.05） in electro-acupuncture group compared with those in the model group.The serum levels of ANP，CRH，and CORT in the electro-acupuncture group were lower than those in model group（P<0.01）.Conclusion：Abnormal levels of ANP，CRH，and CORT in serum may be the cause of anxiety in rats.The electro-acupuncture for simultaneous regulation of the brain and heart might exert the therapeutic effect on anxiety by modulating the levels of the three.63C49FE8-8837-41A6-9F96-3E0F71BC7209

Keywords Simultaneous regulation of the brain and heart; Electro-acupuncture; Anxiety model rats; Ethology; ANP; CRH; CORT

中圖分類號：R245;R277.7文獻標識碼：Adoi：10.3969/j.issn.1673-7202.2022.05.018

焦慮障礙（Anxiety Disorder，AD）是一種以焦慮情緒為主要表現(xiàn)的神經(jīng)癥，常表現(xiàn)為無明顯原因和固定內(nèi)容的擔心，同時伴有自主神經(jīng)功能障礙[1-2]。焦慮障礙的全球發(fā)病率為7.3%[3]。2017年的調(diào)查顯示，我國焦慮障礙的發(fā)病率高達4.98%，且有上升趨勢[4]。目前臨床治療中，口服西藥雖然一直作為治療該病的主要手段，但其引發(fā)的不良反應(yīng)影響了藥物的使用。鑒于西藥治療的短板，針刺治療焦慮障礙療效確切，安全性高，且具有整體調(diào)節(jié)的優(yōu)勢[5]。本課題組前期研究表明，基于“心腦同調(diào)”理論針刺治療焦慮障礙有顯著療效，但針刺治療焦慮障礙的起效機制目前尚不明確[6-7]。臨床研究表明[8]，焦慮障礙患者存在神經(jīng)內(nèi)分泌功能紊亂，主要表現(xiàn)為下丘腦-垂體-腎上腺（Hypothalamic-Pituitary-Adrenal，HPA）軸功能亢進，促腎上腺皮質(zhì)激素釋放激素（Corticotropin-releasing Hormone，CRH）與皮質(zhì)醇（Cortisol，CORT）作為HPA軸首末端重要激素在慢性應(yīng)激過程中起重要作用。有學(xué)者研究表明，心房利鈉肽（Atrial Natriuretic Polypeptide，ANP）與焦慮障礙的發(fā)病密切相關(guān)[9]。本研究從“心腦同調(diào)”角度取穴，觀察電針對焦慮模型大鼠行為學(xué)及血清ANP、CRH、CORT水平的影響，探討針刺治療焦慮障礙的效應(yīng)及可能機制，為臨床治療提供依據(jù)。

材料與方法

1. 材料

1.1. 動物 選用8周齡健康清潔級雄性SD大鼠32只，體質(zhì)量（200±20）g，購自斯貝福（北京）生物技術(shù)有限公司，許可證編號：SCXK（京）2019-0010。實驗室和動物房由北京中醫(yī)藥大學(xué)提供，室溫（24±1）℃，濕度（50±1）%，12 h明暗交替環(huán)境，標準飼料喂養(yǎng)。所有實驗程序遵循中華人民共和國科技部頒布的《關(guān)于善待實驗動物的指導(dǎo)性意見》，均經(jīng)北京中醫(yī)藥大學(xué)動物使用和管理委員會批準（倫理審批號：BUCM-4-2019110601-4088）。

1.1.2 試劑與儀器 華佗牌電子針療儀（蘇州醫(yī)療用品廠有限公司，型號：SDZ-IIB），毫針（北京中研太和醫(yī)療器械有限公司，規(guī)格：0.25 mm×13 mm）;高架十字迷宮（上海欣軟信息科技有限公司，型號：XR-XG201），自發(fā)活動開場實驗箱（上海欣軟信息科技有限公司，型號：XR-XZ301），酶聯(lián)免疫分析儀（無錫華衛(wèi)朗德儀器有限公司，型號：DR-200BS）。CRH ELISA試劑盒（批號：20191112）、CORT ELISA試劑盒（批號：20191112）、ANP ELISA試劑盒（批號：20191112）購自北京華英生物技術(shù)研究所，水合氯醛（上海源葉生物科技有限公司，批號：Z25A10Y86923）。

1.2 方法

1.2. 分組與模型制備 采用隨機數(shù)字表法將32只大鼠隨機分為正常組、模型組、電針組、假針組，每組8只。各組大鼠在實驗前適應(yīng)性飼養(yǎng)7 d，在此期間實驗者每日撫摸大鼠2 min。參照文獻，采用慢性不可預(yù)見性應(yīng)激刺激法建立焦慮大鼠模型[10]。應(yīng)激刺激方法包括6種：24 h禁食禁水、24 h高密度居住、30 min束縛、10 min夾尾、暖泳（3 ℃，15 min）和冷泳（18 ℃，10 min）、足底電擊15 min。每日隨機給予一種刺激，相同刺激不連續(xù)出現(xiàn)，持續(xù)15 d。正常組每日抓取，不造模，其余各組大鼠均接受應(yīng)激刺激。

1.2.2 干預(yù)方法 電針組于應(yīng)激刺激前 h進行電針干預(yù)。根據(jù)《實驗針灸學(xué)》[11]大鼠標準穴位圖譜，將大鼠用鼠套固定后，選取“百會”“風府”“神門”“內(nèi)關(guān)”進行針刺。“百會”向后平刺2 mm，“風府”向后下方斜刺 mm，“神門”“內(nèi)關(guān)”直刺 mm。“百會”“風府”為一組，“神門”“內(nèi)關(guān)”為一組，分別連接電針治療儀。電針參數(shù)：疏密波，強度為0.15 mA，頻率為20 Hz，留針20 min。于造模當天開始治療，隔日1次，“神門”“內(nèi)關(guān)”每次取單側(cè)穴，左右交替，持續(xù)15 d。假針組參照電針組選穴，于相應(yīng)穴位旁 mm非經(jīng)非穴處淺刺，不連接電針治療儀，治療時間與留針時間同電針組。模型組大鼠于相同時間以鼠套固定20 min，此外不做任何治療。正常組不予以任何治療。

1.2.3 檢測指標與方法

1.2.3. 高架十字迷宮實驗 各組大鼠于實驗第15天，通過高架十字迷宮實驗測試其焦慮水平。將大鼠置于高架十字迷宮的中央?yún)^(qū)且面向開放臂，運用Supermaze軟件記錄5 min內(nèi)大鼠的活動情況，包括進入開臂次數(shù)（OE）、開臂停留時間（OT）、進入閉臂次數(shù)（CE）及閉臂停留時間（CT），根據(jù)上述指標計算進入開臂次數(shù)百分比（OE%）：OE%=OE/（OE+CE）×100%，開臂停留時間百分比（OT%）：OT%=OT/（OT+CT）×100%。每只大鼠測試前均用20%乙醇清除高架十字迷宮的殘留氣味。

1.2.3.2 自發(fā)活動開場實驗 各組大鼠于實驗第15天進行自發(fā)活動開場實驗。自發(fā)活動開場實驗箱為立方形敞箱，80 cm×80 cm×40 cm，將曠場箱底部劃分為面積相等的25個方格。將大鼠放置于箱底部中央方格內(nèi)，運用Supermaze軟件記錄5 min內(nèi)大鼠的探究行為與運動情況。以動物穿越底面的格數(shù)（四爪均進入的方格方可記數(shù)）記錄為水平運動次數(shù)，以雙前肢離開箱底的直立次數(shù)（兩前爪騰空或攀附箱壁）記錄為垂直運動次數(shù)。每只大鼠測試前均用20%乙醇清除自發(fā)活動開場實驗箱的殘留氣味。63C49FE8-8837-41A6-9F96-3E0F71BC7209

1.2.3.3 酶聯(lián)免疫吸附試驗法（ELISA）檢測血清ANP、CRH、CORT含量 實驗第15天造模與治療結(jié)束后，以10%水合氯醛按350 mL/kg劑量腹腔注射麻醉各組大鼠，經(jīng)腹主動脈采血，血液靜置后離心（4 ℃，3 000 r/min，離心半徑10 cm，離心15 min），取上清置于-80 ℃保存。采用ELISA法檢測各組大鼠血清ANP、CRH和CORT含量，嚴格按照試劑盒說明書進行檢測分析。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS 20.0統(tǒng)計軟件進行數(shù)據(jù)分析，計量資料數(shù)據(jù)用均數(shù)±標準差（±s）表示，對所有數(shù)據(jù)進行正態(tài)性檢驗及組間方差齊性檢驗。若均符合要求，則采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD、SNK法;若數(shù)據(jù)不符合正態(tài)分布或方差不齊性，則采用非參數(shù)檢驗。以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2. 宏觀表征 正常組大鼠精神良好，毛順有光澤，行動敏捷，飲食正常，多洗臉、梳頭等修飾行為;模型組大鼠飲水迫切，大便色黑干燥，排便粒數(shù)減少，有相互撕咬行為;電針組大鼠精神漸佳，毛色光澤，飲食漸增，行動靈敏，修飾行為增多;假針組大鼠飲水增加、攝食下降、大便干燥。

2.2 大鼠高架十字迷宮實驗結(jié)果 與正常組比較，模型組大鼠進入開臂次數(shù)百分比（OE%）、開臂停留時間百分比（OT%）明顯降低，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（均P<0.01）;與模型組比較，電針組OE%、OT%值明顯升高，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（均P<0.01），假針組OE%、OT%值有升高趨勢，差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（均P>0.05）;與電針組比較，假針組OT%值明顯降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.01），OE%值有降低趨勢，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05）。見表1，圖1。

2.3 大鼠自發(fā)活動開場實驗結(jié)果 與正常組比較，模型組水平得分、垂直得分明顯下降，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（均P<0.05）;與模型組比較，電針組水平得分、垂直得分明顯升高，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（均P<0.05），假針組水平得分、垂直得分差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（均P>0.05）;與電針組比較，假針組水平得分、垂直得分顯著降低，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（均P<0.05）。見表2，圖2。

2.4 各組大鼠血清ANP、CRH、CORT含量 與正常組比較，模型組大鼠血清ANP、CRH、CORT含量顯著升高，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（均P<0.01）;與模型組比較，電針組大鼠血清ANP、CRH、CORT含量均顯著降低，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（均P<0.01），假針組大鼠血清ANP、CRH、CORT含量差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（均P>0.05）;與電針組比較，假針組大鼠血清ANP、CRH、CORT含量明顯升高，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（均P<0.01）。見表3。

3 討論

中醫(yī)學(xué)認為“焦慮障礙”屬于“郁癥”“不寐”“虛煩”等疾病范疇，多由于素體虛弱，七情內(nèi)傷，或肝失疏泄，氣機郁滯，或思慮過度，耗傷心神[12-13]。其病機為神機被擾，病位多涉及心、腦、肝、脾，其中又與心、腦關(guān)系尤為密切。心藏神，腦為元神之府，人的精神、情志活動由心神與腦神共同支配，若心神被擾、元神失用則會出現(xiàn)精神、情志方面的異常。焦慮障礙存在心腦共患的特點，“心腦同調(diào)”為本病治療的關(guān)鍵[14]。本實驗基于前期臨床研究[6-7]，選取百會、風府治“腦”，神門、內(nèi)關(guān)調(diào)“心”。《靈樞·衛(wèi)氣》曰：“頭氣有街……氣在頭者，止之于腦。”《靈樞·海論》曰：“腦為髓之海，其輸上在于其蓋（百會穴），下在風府。”故治“腦”取百會、風府符合氣街、四海理論。根據(jù)經(jīng)絡(luò)理論，風府為督脈“入腦”之穴，百會為督脈“出腦”之穴，二穴共同調(diào)節(jié)腦髓，奉養(yǎng)腦神。神門為手少陰心經(jīng)的原穴，是心原氣經(jīng)過和留止之處，《靈樞·九針十二原》云：“五臟有疾也，當取之十二原。”內(nèi)關(guān)為手厥陰心包經(jīng)絡(luò)穴，《百證賦》中提及內(nèi)關(guān)有“掃盡胸中之苦悶”之效，提示心包經(jīng)腧穴有治療神志疾病的功效。二穴與心關(guān)系密切，具有寧心安神、寬胸解郁之效。

AD的發(fā)病機制目前尚不明確，受遺傳和環(huán)境因素的共同影響。同時研究發(fā)現(xiàn)，神經(jīng)內(nèi)分泌功能紊亂是焦慮障礙的重要發(fā)病機制，HPA軸是經(jīng)典的神經(jīng)內(nèi)分泌閉合環(huán)路，HPA軸的異常改變是焦慮障礙發(fā)病的關(guān)鍵機制之一[15]。本實驗主要觀察ANP、CRH、CORT在焦慮障礙發(fā)病及治療中的可能作用。ANP及其相關(guān)受體是利鈉肽系統(tǒng)中最為重要的組成成員。ANP在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中分布較為廣泛，具有調(diào)節(jié)應(yīng)激反應(yīng)和焦慮等情緒狀態(tài)的作用[9]。研究顯示，焦慮障礙患者血漿ANP出現(xiàn)異常，認為是將心臟和焦慮行為聯(lián)系起來的重要物質(zhì)基礎(chǔ)[16]。應(yīng)激狀態(tài)時下丘腦室旁核產(chǎn)生CRH，經(jīng)垂體門脈系統(tǒng)進入垂體前葉，刺激促腎上腺皮質(zhì)激素（Adrenocorticotrophic Hormone，ACTH）的釋放，ACTH作用于腎上腺皮質(zhì)，促進CORT的分泌，形成HPA軸而發(fā)揮生物學(xué)作用[17]。CORT作用廣泛，其中之一就有發(fā)揮免疫抑制作用。研究表明，應(yīng)激過程中，CORT分泌增多是應(yīng)激性免疫抑制的主要原因。目前研究發(fā)現(xiàn)，血清ANP升高可能通過促進腎上腺髓質(zhì)的腎上腺細胞釋放兒茶酚胺，使CORT的釋放增多，導(dǎo)致HPA軸功能亢進，引起焦慮的發(fā)生[18]。

慢性應(yīng)激可引起大鼠行為學(xué)變化，高架十字迷宮實驗和自發(fā)活動開場實驗是動物焦慮行為學(xué)研究中較為經(jīng)典的測試。高架十字迷宮實驗用于焦慮程度的評估，大鼠穿梭開放臂的頻次及時間的所占百分比表達了大鼠的焦慮狀態(tài)存在與否及其水平高低，大鼠穿梭開放臂以及閉合臂的總頻次則表達出鼠科動物在運動方面具備的能力高低。結(jié)果表明，模型組大鼠OE%和OT%值顯著降低，表現(xiàn)出明顯的焦慮行為，而“心腦同調(diào)”法電針顯著提高焦慮大鼠的OE%和OT%值，明顯改善大鼠的焦慮行為，且優(yōu)于假針組。自發(fā)活動開場實驗用于評估嚙齒類動物的自發(fā)活動與探究行為，結(jié)果表明，焦慮模型大鼠水平得分與垂直得分顯著降低，自發(fā)活動與探究行為明顯受到抑制。“心腦同調(diào)”法電針顯著增加大鼠的自發(fā)活動與探究行為，且效果明顯優(yōu)于假針組。通過以上行為學(xué)評價結(jié)果證實本實驗造模成功，“心腦同調(diào)”法電針對焦慮大鼠行為學(xué)有較好的干預(yù)調(diào)節(jié)效應(yīng)。63C49FE8-8837-41A6-9F96-3E0F71BC7209

在應(yīng)激條件下，機體通過改變HPA軸各個層面激素的表達，維持機體內(nèi)穩(wěn)態(tài)。下丘腦室旁核分泌CRH，刺激垂體前葉釋放ACTH，ACTH通過體循環(huán)到達腎上腺，刺激腎上腺皮質(zhì)合成并釋放CORT，從而形成一個完整的HPA軸系統(tǒng)[17]。在正常情況下，CORT對HPA軸有負反饋調(diào)節(jié)作用[19]。在慢性應(yīng)激條件下，CRH分泌過多，導(dǎo)致ACTH、CORT過量釋放，過量的CORT不能有效抑制HPA軸的活性，HPA軸負反饋調(diào)節(jié)失常，CRH、ACTH、CORT持續(xù)升高，表現(xiàn)為HPA軸功能持續(xù)亢進，最終導(dǎo)致焦慮的發(fā)生[20]。臨床研究發(fā)現(xiàn)，廣泛性焦慮障礙患者的血漿CORT水平顯著升高，且CORT水平與焦慮嚴重程度正相關(guān)[21];創(chuàng)傷后應(yīng)激障礙焦慮患者血漿CRH水平明顯升高[22]。各種應(yīng)激誘導(dǎo)的焦慮動物模型也表現(xiàn)出明顯的HPA軸功能紊亂。研究顯示，慢性不可預(yù)見性應(yīng)激條件下，大鼠表現(xiàn)出明顯焦慮行為，血漿CRH、CORT水平顯著提高，HPA軸功能亢進[23]。近年來，有學(xué)者發(fā)現(xiàn)，ANP可通過調(diào)節(jié)HPA軸的活動影響焦慮行為[24]。Raha等[25]通過實驗發(fā)現(xiàn)，ANP可促進腎上腺髓質(zhì)兒茶酚胺的釋放，從而提高CORT水平。有實驗發(fā)現(xiàn)，焦慮大鼠血漿ANP、CORT水平異常升高，而腎上腺皮質(zhì)利鈉肽受體A的表達無異常改變，提示ANP并非直接作用于腎上腺皮質(zhì)刺激CORT的釋放[18]，進一步驗證了Raha等[25]的實驗結(jié)果。因此，過高的血清ANP可能通過促進腎上腺髓質(zhì)的腎上腺細胞釋放兒茶酚胺，使CORT的釋放增多，導(dǎo)致HPA軸功能亢進，引起焦慮的發(fā)生。

本實驗研究結(jié)果提示，焦慮模型大鼠血清ANP、CRH、CORT呈高水平表達，這與相關(guān)報道一致[18，21-23，25]。而“心腦同調(diào)”法電針可調(diào)節(jié)這一紊亂狀態(tài)，且電針組調(diào)節(jié)效果明顯優(yōu)于假針組。其作用機制可能是通過糾正血清ANP紊亂，繼而影響CORT與CRH的釋放，抑制HPA軸亢進，從而發(fā)揮抗焦慮效應(yīng)。

綜上所述，焦慮模型大鼠血清中ANP、CRH、CORT水平異常可能是導(dǎo)致焦慮模型大鼠發(fā)病的機制之一，“心腦同調(diào)”法電針可能通過調(diào)節(jié)三者之間的紊亂狀態(tài)而達到對焦慮障礙的治療作用。本研究為基于“心腦同調(diào)”理論針刺抗焦慮的機制研究提供了依據(jù)，但本研究結(jié)論仍須進一步的臨床及實驗研究加以驗證。

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（2020-06-11收稿 本文編輯：王明）63C49FE8-8837-41A6-9F96-3E0F71BC7209