二代測序技術檢測胸腔積液中細胞沉淀物及上清液中DNA的價值

周金梅，熊柳冰，黃 浩

（惠東縣人民醫院腫瘤內科，廣東 惠東 516300）

從癌細胞中提取DNA 是檢測表皮生長因子受體（EGFR）突變的“金標準”。但手術前患者組織樣本的獲取十分困難，對臨床治療的指導具有滯后性[1]。許多研究者逐漸采用胸腔積液等易獲取的樣本替代組織樣本進行DNA 分析，但存在較高的誤診率。由于EGFR 突變分析通常是在細胞學診斷中的免疫染色之后進行，而惡性胸腔積液一般屬于滲出液，因此可用于EGFR 突變分析的沉淀物較為有限[2]。同時，當沉淀物中癌細胞很少時，EGFR 突變分析會產生假陰性的結果[3]。此外，采用胸腔積液標本檢測EGFR 突變狀態與細胞學診斷之間的關系尚不清楚。因此，我們猜測聯合檢測胸腔積液中細胞沉淀物DNA 和無細胞上清液基因組DNA（cell-free DNA，ccfDNA）可能比單獨使用細胞沉淀物DNA 或上清液ccfDNA檢測更能有效診斷EGFR 突變狀態。基于此，本研究探討采用二代測序技術檢測胸腔積液中細胞沉淀物DNA 及上清液ccfDNA 的臨床價值。

1 資料和方法

1.1 基線資料

選取2016 年1 月至2020 年10 月我院收治的156 例肺腺癌患者作為研究對象。其納入標準是：經病理學檢查或細胞學檢查明確診斷患有肺腺癌，且癌細胞存在遠處轉移；出現胸腔積液；知曉本研究內容，并簽署了知情同意書。其排除標準是：存在其他類型的惡性腫瘤；合并有免疫系統疾病、炎性疾病等可能產生胸腔積液的疾病；基因檢測前已接受放化療等抗腫瘤治療；病歷資料缺失。在156 例肺腺癌患者中，有45 例（28.8%）患者檢測出EGFR 突變（EGFR 突變采用TaqMan 突變檢測法進行檢測）。將45 例EGFR 突變型肺腺癌患者作為EGFR 突變組，另選同期我院收治的29例野生型EGFR 且上清液樣本充足的肺腺癌患者作為EGFR 野生組。兩組患者的基線資料見表1。

表1 兩組患者基線資料的比較

1.2 方法

1.2.1 組織標本、胸腔積液標本的收集 收集患者的胸腔積液細胞學標本，在800 g 條件下離心10 min，收集上清液后立即保存在-80℃的冰箱中，直到提取DNA。取標本中的細胞沉淀物，將細胞沉淀物浸泡在固定液中至少30 min。每個液基細胞學（liquid based cytology，LBC）涂片都采用SurePathTM 系統進行處理，然后將LBC 玻片用Papanicolaou 法染色以進行細胞學診斷。液基胸腔積液細胞學檢查中肺腺癌的典型細胞學表現見圖1。同時，在胸腔鏡下夾取適量組織標本，并通過細胞抽吸或在術后病理組織中獲取轉移的腫瘤標本。

圖1 液基胸腔積液細胞學檢查中肺腺癌的典型細胞學表現

1.2.2 高通量二代測序分析 采用TaqMan 突變檢測法或F-PHFA 法檢測EGFR 基因第19 號外顯子（DelE746A750）和第21 號外顯子（L858R）突變的情況。提取胸腔積液中LBC 涂片的細胞沉淀物和上清液基因組DNA（cell-free DNA，ccfDNA），DNA 含量用生物光度計進行檢測。從惡性細胞涂片中提取DNA，利用NextSeq 500 高通量測序平臺，采用二代測序技術檢測組織、細胞等樣本中基因變異序列的數目及EGFR 基因變異的情況。

1.3 觀察指標

觀察采用胸腔積液中細胞沉淀物DNA、上清液ccfDNA 單獨檢測及聯合檢測評估EGFR 突變的結果。

1.4 統計學方法

用SPSS 20.0 軟件處理本研究中的數據，計量資料用±s表示，用t檢驗，計數資料用% 表示，用χ2 檢驗，P＜0.05 表示差異有統計學意義。

2 結果

2.1 胸腔積液中細胞沉淀物DNA、上清液ccfDNA單獨檢測評估兩組患者EGFR 突變的情況

EGFR 野生組患者胸腔積液中所有細胞沉淀物DNA、上清液ccfDNA 單獨檢測的結果均顯示EGFR 突變呈陰性，EGFR 突變組患者胸腔積液中細胞沉淀物DNA、上清液ccfDNA 單獨檢測的結果均顯示原發灶和相應轉移灶EGFR 基因第19 號、21 號外顯子的突變情況無差異。

2.2 胸腔積液中細胞沉淀物DNA、上清液ccfDNA聯合檢測評估兩組患者EGFR 突變的情況

在EGFR 突變組患者中，細胞沉淀物DNA 中EGFR 突變與上清液ccfDNA 中EGFR 突變的符合率為35.6%（16/45），表明這兩種標本在EGFR突變檢測中經常表現出不一致。對這兩種標本進行聯合檢測后發現，聯合檢測可將EGFR 突變檢測的敏感度提高至60.0%。詳見表2。

表2 胸腔積液中細胞沉淀物、上清液ccfDNA 聯合檢測評估兩組患者EGFR 突變的情況[ 例（%）]

3 討論

胸腔積液或血漿中的游離DNA 可用來檢測EGFR 突變，這不僅有助于肺癌治療方案的制定，還有利于動態監測患者的治療效果。研究證實，胸腔積液標本中的EGFR 突變篩查對于預測肺癌患者的預后十分有效[4]。Karlovich 等[5]通過PCR檢測發現，從液體標本上清液中提取的ccfDNA 中可檢測到激活的EGFR 突變，這可能是一種通過形態學和DNA 分析實現對肺癌快速診斷的敏感方法。本研究中我們發現，經胸腔積液中細胞沉淀物DNA 和上清液ccfDNA 聯合檢測，共在27 個樣本中發現EGFR 突變，檢測的敏感性為60.0%。提示采用二代測序技術同時對胸腔積液中細胞沉淀物DNA 和上清液ccfDNA 進行基因分析對于準確檢測EGFR 突變具有重要的意義。近年來，已有多項研究發現原發性非小細胞肺癌EGFR 突變與相應轉移灶的EGFR 突變不一致。Zhao 等[6]報道，原發性肺癌EGFR 的狀態不能完全正確地預測相應轉移灶中EGFR 的狀態。也有學者研究發現，雖然腫瘤組織樣本中EGFR 的突變率略高于胸腔積液樣本中EGFR 的突變率，但二者相比無統計學差異。本研究中，細胞沉淀物和細胞培養上清液中EGFR 突變型的檢出率并不完全一致。從樣本中提取的DNA 質量不佳或腫瘤細胞存在異質性可能是導致兩個樣本中EGFR 突變型檢出率不一致的原因。而聯合檢測細胞沉淀物DNA 和上清液ccfDNA，可提高原發腫瘤與相應轉移瘤中EGFR 突變的符合率。在臨床上，術前獲取患者的腫瘤組織樣本比較困難，這促使研究者開始使用血漿或胸腔積液等體液樣本進行DNA 分析，而這些樣本中通常含有循環中的無細胞DNA。在以往的無細胞DNA 研究中，研究人員研發了多種肺癌患者血漿/ 血清樣本中EGFR 突變的檢測技術，如擴增阻滯突變系統、高效液相色譜等，報告的檢測靈敏度在43.1%～91.7%之間。在本研究中，我們主要采用二代測序法來檢測胸腔積液中細胞沉淀物DNA 和上清液ccfDNA 中的EGFR 突變，因此報告的陽性率比以往的研究更高。在非惡性細胞標本的上清液ccfDNA 中無法檢測到EGFR突變，因此我們認為腫瘤細胞未侵犯支氣管的肺癌患者上清液中的無細胞DNA 不在支氣管內循環。相比之下，晚期肺癌患者通常會出現胸腔積液，這些患者的無細胞DNA 可能在全身循環，而不僅僅是在支氣管內循環[7]。盡管導致EGFR 突變陽性標本出現假陰性的原因尚不清楚，但在細胞學上，這些非小細胞肺癌病例的癌細胞可能較小，且有更多的單細胞核或未成熟的未分化細胞，這些細胞在大小、染色程度或形態上可能與典型非小細胞肺癌患者的癌細胞不同。

綜上所述，采用二代測序技術對胸腔積液中細胞沉淀物DNA 和上清液ccfDNA 進行聯合檢測可有效提高原發腫瘤和相應轉移瘤之間EGFR 突變的符合率。