益氣散聚方對肥胖相關腎小球病模型小鼠AMPK信號通路的影響及機制研究

方明珠，徐艷秋，顧耀東

1.上海中醫藥大學附屬岳陽中西醫結合醫院腎內科，上海 200437；

2.上海市第六人民醫院金山分院中醫內科，上海 201599

肥胖相關性腎病多以肥胖為主誘因，機體代謝發生紊亂繼而引發的腎病。其特點為起病隱匿、臨床特征不明顯、大多患者就診時已有顯性蛋白尿現象。AMPK 存在于人類腎臟組織中，并廣泛表達，是調控細胞能量代謝關鍵步驟[1-2]。當抑制AMPK 活性時則會激活腎臟代謝均衡失常性氧化應激反應，此時炎癥反應系統同時啟動，引起腎臟一系列病理特征變化，包括腎臟組織中系膜基質積聚、足細胞肥大、系膜擴張等[3-4]。研究發現，AMPK信號通路異常既是肥胖相關性腎病直接致病因素又是其腎臟并發癥的重要病理基礎。改善AMPK信號通路，對原發病進程阻斷與并發癥預防有重要意義，然而，目前市場上并無相關療效突出的化學藥品。王文健教授基于“聚證理論”創立了益氣散聚方，是治療肥胖相關性腎病的基本方，臨床加減應用在治療中效果顯著，減少肥胖發生，抑制炎癥反應，改善腎臟功能[5-7]。本研究通過觀察益氣散聚方對肥胖相關性腎病模型小鼠AMPK 信號通路的影響，探討AMPK誘發炎癥反應的具體機制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 挑選60 只雄性C57ΒL/6 小鼠，均為6 周齡，每只小鼠體質量相差不大，均約18 g，由北京海淀區實驗動物中心購買，現于我院動物實驗中心飼養。

1.2 主要藥品及試劑 益氣散聚方濃縮顆粒劑：黃芪、黃連、蒲黃、澤瀉、茵陳，天江藥業提供(1 包與原生藥材黃連3 g、黃芪12 g、茵陳7.5 g、澤瀉5 g、蒲黃7.5 g的劑量等同)。石蠟切片糖原染色試劑盒(漢恒科技公司)；Trizol(昆山金城試劑公司)；cDNA 合成試劑盒、熒光定量PCR試劑盒?(賽默飛中國公司)。

1.3 實驗方法

1.3.1 模型制作 將所有C57ΒL/6 雄性小鼠進行為期1 周的適應性飼養后，隨機分為模型組54 只與正常組6只。造模參考文獻[8]，為通過喂養高脂飼料而誘導肥胖的模型。所有小鼠進食、飲水均不受限制，所處室溫在15℃～25℃，濕度(65%±5%)，交替照明周期為12 h。飼料的配方如下：豬油20%、膽固醇2%、食用鹽5%、膽鹽0.5%、脫脂奶粉10%、白砂糖10%、普通飼料53.5%，委托方為北京實驗動物中心。

1.3.2 實驗分組 根據隨機原則對成功造模的54 只小鼠分四組，包括模型組、中藥組、西藥組、中西醫結合組，數量分配中藥組18 只，其余三組每組各分配12只。

1.3.3 藥物干預 用藥時間選擇于造模4周后，喂養劑量：約為成人劑量的20倍灌服藥物，0.5 mL/(次·d)(具體參考人鼠劑量換算)。正常組：生理鹽水。模型組：生理鹽水。中藥組：益氣散聚方(益氣散聚方顆粒，濃度為1.5 g/mL)。西藥組：灌服鹽酸二甲雙胍配成濃度為0.25 g/mL 混懸液(0.5 g/片中美施貴寶制藥，批號：11120165)。中西醫結合組：灌服益氣散聚方+鹽酸二甲雙胍。

1.4 標本采集與檢測

1.4.1 標本獲取 飼養動物攝水、食自由，天平稱取體質量，尾靜脈測血糖，并置小鼠于代謝籠觀察24 h，不予喂食，但飲水自由，對其尿液進行留取，1 d后將小鼠尿液收集起來進行離心5 min處理，3 000 r/min轉速分離上清，冷凍保存。實驗進行第4周末時，依次取不同組別提前標記1～6 號的小鼠歸籠集合并于腹腔內注射4%水合氯醛0.2 mL/20 g，成功麻醉小鼠進行手術準備，沿腹白線使用手術剪將其腹腔逐層打開，取其兩側腎臟并稱重，取左腎下極1/3腎組織，置于配比好濃度福爾馬林固定液內備用，行HE染色，鏡下觀察所取組織病理改變，取右腎及左腎上級2/3 放入離心管，管中提前滴入1.5 mL生理鹽水中，低溫-73℃存放，基因蛋白檢測時備用。實驗進行至8 周末時，取所有剩余小鼠行麻醉取腎臟，方法同上。

1.4.2 一般項目檢測 血糖：禁食1 d 后剪取小鼠尾血，應用血糖儀對小鼠血糖進行測定。體質量：每14 d 通過電子計重器對小鼠的體質量進行稱取并記錄。尿NAG、尿RΒP、尿MA、24 h尿蛋白定量：全制動生化儀化學發光法檢測。

1.4.3 腎臟組織HE 染色 使用Motic Images Advanced 3.2醫學圖像分析系統對其進行統計。每片測量20個腎小球的腎小球直徑，計算均值后記為最終結果。免疫組化半定量法檢驗p-AMPKα蛋白含量。Motic Med 6.0 軟件分析結果，具體分析方法為“點計數法”，每個樣本為完整且不重復的20個腎小球，計數測試系統用點密度代表結果，即陽性面積比/總腎小球襻面積比，計算均值后記為最終結果。通過實時定量PCR 對轉化生長因子β1(TGF-β1)、單核細胞趨化因子(MCP-1)、磷酸化腺苷酸激活蛋白激酶α (PAMPK-α mRNA)的表達進行測定。

1.5 統計學方法 采用SPSS22.0和Graphpad 8.0統計軟件對數據進行分析。計量資料以均數±標準差(±s)表示，符合正態分布的計量資料采用獨立樣本t檢驗，不符合正態分布采用Wilcoxon檢驗，計數資料以頻數表示，采用χ2檢驗。以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 藥物干預第4周末和第8周末各組小鼠體質量比較 正常組、模型組、西藥組、中藥組的小鼠在用藥的第4 周末和第8 周末所測得的體質量均增加，而中西醫結合組小鼠的體質量較中藥組、西藥組、模型組下降，差異均具有統計學意義(P＜0.05)，見表1。

表1 各組小鼠用藥后體質量動態變化(±s，g)

表1 各組小鼠用藥后體質量動態變化(±s，g)

注：與同時間點模型組比較，aP＜0.05；與同時間點中藥組比較，bP＜0.05；與同時間點西藥組比較，cP＜0.05。

組別正常組模型組西藥組中藥組中西醫結合組只數6 12 12 18 12第4周末27.80±0.53 28.93±1.37 29.02±1.57 29.83±1.28 29.38±1.77第8周末30.57±2.11 32.62±2.45 31.93±2.81 32.26±2.20 27.83±5.55abc t值3.118 3.219 2.214 2.864 2.651 P值0.011 0.009 0.041 0.011 0.029體質量

2.2 藥物干預第4周末和第8周末各組小鼠血糖比較 藥物治療第4 周末，各組小鼠測的血糖均有升高，但差異無統計學意義(P＞0.05)；比較正常組與模型組小鼠血糖，發現后者較前者有所升高，但差異無統計學意義(P＞0.05)；藥物治療第8 周末，比較模型組與中西醫結合組、中藥組小鼠血糖，發現中西醫結合組、中藥組小鼠的血糖較模型組有所降低，但差異無統計學意義(P＞0.05)，見表2。

表2 各組小鼠干預后的血糖動態變化(±s，mmol/L)

表2 各組小鼠干預后的血糖動態變化(±s，mmol/L)

組別正常組模型組西藥組中藥組中西醫結合組只數6 12 12 18 12第4周末3.67±2.04 3.32±0.60 3.58±0.44 3.23±1.20 3.73±1.78第8周末2.97±0.47 3.58±0.82 3.82±0.55 3.14±0.80 3.03±0.90 t值0.819 0.626 0.834 0.187 0.859 P值0.431 0.545 0.423 0.853 0.41血糖

2.3 藥物干預第4 周末和第8 周末各組小鼠尿MA比較 模型組小鼠第4周末、第8 周末尿MA較正常組升高，差異具有統計學意義(P＜0.05)；第8 周末中藥組、西藥組、中西醫結合組小鼠尿MA均較模型組降低，差異具有統計學意義(P＜0.05)，且三組中中西醫結合組小鼠尿MA下降最明顯，差異具有統計學意義(P＜0.05)，見表3。

表3 各組小鼠干預后尿MA動態變化(±s，μg/mL)

表3 各組小鼠干預后尿MA動態變化(±s，μg/mL)

注：與時間點模型組比較，aP＜0.01，bP＜0.05。

組別正常組模型組西藥組中藥組中西醫結合組只數6 12 12 18 12第4周末16.71±0.76b 41.60±3.35 44.42±2.70 45.39±3.21 46.23±2.67第8周末16.59±0.61b 47.65±3.12 41.04±2.02b 39.70±3.04b 23.44±2.40a t值0.301 3.237 2.455 3.852 15.549 P值0.769 0.008 0.034 0.001 0.001尿MA

2.4 藥物干預第4 周末和第8 周末各組小鼠尿NAG比較 比較模型組與正常組小鼠在第4周末、第8 周末的尿NAG 值，發現前者高于后者，差異具有顯著統計學意義(P＜0.01)；比較模型組與中藥組、中西醫結合組、西藥組小鼠在第8 周末的尿NAG 值，發現后三組尿NAG值降低，且比模型組下降明顯，差異具有統計學意義(P＜0.05)，見表4。

表4 各組小鼠干預后尿NAG動態變化(±s，U/L)

表4 各組小鼠干預后尿NAG動態變化(±s，U/L)

注：與同時間點模型組比較，aP＜0.01。

組別正常組模型組西藥組中藥組中西醫結合組只數6 12 12 18 12第4周末41.40±15.44a 63.70±9.80 73.05±12.74 73.17±10.92 62.85±13.62第8周末45.30±12.81a 78.82±11.94 35.72±7.09a 37.52±7.78a 36.32±8.87a t值0.476 2.397 6.272 7.977 3.998 P值0.644 0.057 0.001 0.001 0.002尿NAG

2.5 藥物干預第4 周末和第8 周末各組小鼠尿RΒP比較 比較模型組與正常組小鼠在第4周末、第8周末的尿RΒP 值，發現前者較后者增長，但差異無統計學意義(P＞0.05)；比較模型組與中藥組、中西醫結合組、西藥組小鼠在第8周末的尿RΒP值，發現后三組尿RΒP 值均降低，且比模型組下降明顯，差異具有統計學意義(P＜0.05)，見表5。

表5 各組小鼠干預后尿RBP動態變化(±s，mg/L)

表5 各組小鼠干預后尿RBP動態變化(±s，mg/L)

注：與同時間點模型組比較，aP＜0.01。

組別正常組模型組西藥組中藥組中西醫結合組只數6 12 12 18 12第4周末1.78±0.28 1.86±0.34 2.03±0.31 2.06±0.42 2.33±0.37第8周末1.93±0.22 2.81±0.26 1.27±0.21a 0.52±0.19a 0.65±0.26a t值0.586 1.497 3.272 6.677 5.798 P值0.714 0.087 0.002 0.001 0.001尿RΒP

2.6 藥物干預第4周末和第8周末各組小鼠24 h尿蛋白定量比較 模型組小鼠第4周末、第8周末24 h尿蛋白較正常組升高，差異具有統計學意義(P＜0.05)；中藥組、中西醫結合組第8 周末24 h 尿蛋白定量下降(P＜0.05)。中西醫結合組、中藥組比模型組、西藥組降低明顯，差異具有統計學意義(P＜0.05)，見表6。

表6 各組小鼠接受1 d干預后尿蛋白的動態變化(±s，mg/L)

表6 各組小鼠接受1 d干預后尿蛋白的動態變化(±s，mg/L)

注：與同時間點模型組比較，aP＜0.05，bP＜0.01；與同時間點西藥組比較，cP＜0.01。

組別正常組模型組西藥組中藥組中西醫結合組只數6 12 12 18 12第4周末0.67±0.19a 1.98±0.39 2.07±0.57 2.18±0.61 2.21±0.5737第8周末0.96±0.24a 2.63±0.62 2.44±0.66 1.35±0.31ac 1.62±0.47bc t值1.153 1.091 0.464 2.861 2.173 P值1.153 1.091 0.464 2.861 2.173 24 h尿蛋白定量

2.7 藥物干預第4周末和第8周末腎臟病理改變

2.7.1 基本腎臟病理改變 模型組、中藥組、西藥組、中西醫結合組治療4周后腎小球體積增大，腎小球囊腔變小，固有細胞無增生，系膜區未見明顯增生，腎小管間質正常，未見細胞浸潤，腎血管未見異常，見圖1。

圖1 各組小鼠腎臟H&E染色(×200)

2.7.2 腎小球直徑變化 模型組小鼠第4 周末、第8 周末腎小球直徑較正常組升高，差異具有統計學意義(P＜0.05)；中藥組、中西醫結合組第8 周末腎小球直徑下降，兩組較模型組、西藥組均降低，但差異無統計學意義(P＞0.05)。中藥組治療8 周后腎小球直徑顯著下降，差異具有統計學意義(P＜0.05)，見表7。

表7 各組小鼠腎小球直徑變化(±s，μm)

表7 各組小鼠腎小球直徑變化(±s，μm)

注：組內比較，aP＜0.05；與同時間點模型組比較，bP＜0.05。

組別正常組模型組西藥組中藥組中西醫結合組只數6 12 12 18 12第4周末49.78±2.79b 60.05±3.07 56.57±1.81 69.06±3.44 61.83±1.54第8周末48.64±3.06b 64.44±1.65 61.50±1.01 60.27±4.64a 56.97±3.47 t值0.674 3.085 5.826 4.565 3.136 P值0.515 0.011 0.001 0.001 0.011腎小球直徑

2.7.3 腎臟組織PAMPK-α的變化 各組小鼠腎臟組織PAMPK-α免疫組化光鏡下可見顯色后的PAMPK-α呈棕褐色，主要在腎臟組織毛細血管內皮細胞和腎小管上皮細胞表達。模型組第4周末、第8周末腎臟組織PAMPK-α表達較正常組比較明顯下降，差異有顯著統計學意義(P＜0.01)；中藥組、西藥組、中西醫結合組第8 周末PAMPK-α表達較模型組比較有明顯升高，差異有顯著統計學意義(P＜0.01)，見表8、圖2。

圖2 各組小鼠腎臟免疫組化(×200)

表8 各組PAMPK-α陽性面積比較(±s)

表8 各組PAMPK-α陽性面積比較(±s)

注：與模型組比較，aP＜0.01。

組別正常組模型組西藥組中藥組中西醫結合組只數6 12 12 18 12第4周末779.89±100.31a 338.22±25.22 303.00±78.01 379.44±123.61 369.33±119.50第8周末785.89±63.90a 281.33±24.29 452.89±47.15a 482.22±39.45a 497.56±46.58a t值0.123 3.979 4.027 2.376 2.448 P值0.904 0.002 0.002 0.030 0.034 PAMPK-α陽性面積

2.8 藥物干預第4 周末和第8 周末各組小鼠的TGF-β1mRNA、MCP-1 mRNA、PAMPK-α mRNA 的表達 模型組小鼠第4周末、第8周末MCP-1 mRNA、TGF-β1mRNA 表達較正常組升高，PAMPK-α mRNA較正常組下降，差異具有統計學意義(P＜0.05)；第8周末中西醫結合組、中藥組的TGF-β1、MCP-1 mRNA均下降，且與模型組比較發現中西醫結合組、中藥組均降低，差異有統計學意義(P＜0.05)；第8周末西藥組的MCP-1 mRNA含量降低，與模型組進行比較，發現西藥組較模型組有所下降，但差異無統計學意義(P＞0.05)；第8周末西藥組的TGF-β1mRNA含量升高，與模型組進行比較差異具有統計學意義(P＜0.05)；中藥組、西藥組、中西醫結合組的小鼠第8周末PAMPK-α mRNA升高，三組較模型組均升高，差異具有統計學意義(P＜0.05)，見表9、表10。MCP-1、TGF-β1、PAMPK-α基因PCR擴增動力學曲線見圖3～圖6。

表9 各組小鼠接受干預后TGF-β1、MCP-1 mRNA的動態變化(±s)

表9 各組小鼠接受干預后TGF-β1、MCP-1 mRNA的動態變化(±s)

注：與同時間點模型組比較，aP＜0.05。

組別正常組模型組西藥組中藥組中西醫結合組只數6 12 12 18 12第4周末0.40±0.13a 1.74±1.04 1.80±0.93 1.03±0.23 0.63±0.10第8周末0.41±0.05a 1.99±1.01 1.64±0.18 0.87±0.48a 0.37±0.45a t值0.175 0.422 0.414 3.698 2.887 P值0.894 0.682 0.688 0.002 0.042 MCP-1第4周末0.29±0.08a 0.53±0.35 0.96±0.36 0.44±0.30 0.62±0.10第8周末0.39±0.11a 0.71±0.66 1.56±0.89a 0.22±0.13a 0.59±0.14a t值1.801 0.59 1.531 2.237 0.427 P值0.102 0.568 0.157 0.047 0.678 TGF-β1

表10 各組小鼠干預后PAMPK-α mRNA動態變化(±s)

表10 各組小鼠干預后PAMPK-α mRNA動態變化(±s)

注：與同時間點模型組比較，aP＜0.05。

組別正常組模型組西藥組中藥組中西醫結合組只數6 12 12 18 12第4周末4.06±0.10a 3.44±0.12 3.55±0.26 3.63±0.19 3.50±0.57第8周末4.09±0.72a 3.42±0.05 4.84±0.24a 4.78±0.36a 4.81±0.51a t值0.101 0.376 8.93 8.475 4.195 P值0.904 0.002 0.002 0.030 0.034 PAMPK-α基因表達

圖3 b-actin mRNA基因擴增曲線

圖4 TGF-β1 mRNA基因擴增曲線

圖5 MCP-1 mRNA基因擴增曲線

圖6 p-AMPKa mRNA基因擴增曲線

3 討論

肥胖患者脂肪堆積脂肪細胞增生肥大并受多元因素影響，多是由于攝能量多而消耗能不足，能量代謝紊亂性慢性代謝性疾病。根據發病機制與病因肥胖可分繼發性肥胖、單純性肥胖兩類。單純性肥胖隸屬于生活方式不當而引起的脂肪過度增生的一種慢性疾病，其與運動缺乏、營養不均、行為偏差密切相關，不曾患有內分泌疾病、無其他可誘發肥胖的疾病的單純性肥胖患者人數超過肥胖總人數的95%。本研究中肥胖相關性腎病是由單純性肥胖引發，尿液分析可見微量白蛋白尿，大量蛋白尿較為罕見，并可于鏡檢發現腎小球病理變化包括：肥大、節段性腎小球硬化等。諸多中醫腎病學領域專家認為肥胖相關性腎病致病關鍵因素為“痰、濕、瘀”，病位為脾臟，脾虛為本，痰濕內盛，互結為瘀，其肥胖發生本源為“脾虛化失調，無法升清泌濁，濁氣日久停聚體內生痰濕瘀血，謂之為肥胖之本源”。王文健教授認為本病治則為：“益氣祛濕，健脾化瘀”，并由此為指導創立了益氣散聚方。該方包括黃芪、澤瀉、黃連、蒲黃，其中黃芪具有補中益氣的作用，為君藥；澤瀉善于利水且滲濕泄熱性強，其性味甘寒，可佐助黃連清熱之功；黃連燥濕瀉火，性味苦寒，為臣藥；蒲黃味甘且性微寒，既入血分……滯者可行，故為佐使。此方共奏益氣散聚之功。本實驗研究結果提示：予以藥物4 周治療后動物體質量變化方面發現中西醫結合組較其他各組降低明顯，揭示了益氣散聚方可顯著改善小鼠肥胖屬性。中藥組、西藥組、中西醫結合組小鼠予以給藥4 周后24 h 尿蛋白定量，尿液含量中的RΒP、MA、NAG 較模型組減少顯著，其中中藥組治療更具有優勢，揭示益氣散聚方有效改善肥胖導致的腎損害，與之同時可降低蛋白尿。

肥胖的發生部位為脂肪組織，其本質為炎癥性疾病，炎癥的特點為慢性、低度、持續性。在體內能量代謝不協調時，脂肪細胞、巨噬細胞可分泌多個種類的脂肪細胞相關炎癥因子，如TGF-β1、MCP-1 等，肥胖引發的較低水平的炎癥反應與此類相關炎癥因子密切相關，在與肥胖有關腎病的進程中起到重要的作用，腎小球病變關鍵因子即TGF-β1，在腎臟組織中廣泛存在，也是一種致纖維化因子，于腎臟組織中，對腎臟細胞肥大起促進作用，同時加速系膜細胞外基質的增生速率，而對細胞外基質降解起抑制的作用，從而致使肥胖相關腎病患者的腎小球發生硬化；MCP-1的過表達促使單核細胞和巨噬細胞浸潤加速，加速釋放了TNF-α、IL-6、TGF-β1等炎癥因子，促使腎組織炎性變態反應和組織纖維化程度日趨加重。本研究可知：予以4 周藥物治療后中藥組、中西醫結合組實驗動物中MCP-1 mRNA、TGF-β1mRNA表達呈減少趨勢，兩組較模型組均降低，說明益氣散聚方能夠降低炎癥因子的表達，改善肥胖相關腎組織炎細胞浸潤及纖維化進程。

肥胖相關性腎炎是一種慢性疾病進程。本研究的主題是肥胖和高胰島素血癥引起的腎小管損傷等與其他損害腎功能的常見因素有明顯差異。本研究是從炎癥因子的表達來討論肥胖相關性腎炎的病理機理。而AMPK 信號通路活性降低可激活炎癥反應進而引發腎損傷。AMPK 通常在腎臟中表達，包括足細胞、系膜細胞、內皮細胞和腎小管損傷的上皮細胞。基于抑制人體炎癥、體細胞生長和蛋白質合成的作用，它可以控制腎臟的各種功能及病理狀態。本研究的結果表示：治療1個月后，比較模型組與中西醫結合組、西藥組、中藥組的PAMPK-α表達情況，發現后三組升高明顯，其PAMPK-α mRNA含量增加顯著，表明益氣散聚方通過提高AMPK 在血清和腎臟組織中的表達抑制炎癥因子，改善肥胖相關腎小球肥大和腎間質纖維化進程。

肥胖相關腎臟損傷與機體炎癥反應密切相關，而在炎癥反應介導進程中，AMPK信號轉導通路起關鍵作用。AMPK 可促進合成巨噬細胞進而抑制炎性細胞因子白介素-10、TNF-α的合成，進而抑制脂肪細胞TGF-β1、白介素-10 合成進程[8-10]。AMPK可抑制腎小球內皮細胞核因子κΒ(nuclear factor-κΒ，NF-κΒ)表達來減少MCP-Ⅰ表達[11]。實驗室中益氣散聚方可活化AMPK，抑制炎癥因子TGF-β1、MCP-1、IL-6、TNF-α等的表達，改善肥胖相關腎小球肥大和腎間質纖維化進程。

AMPK 的抑炎機制是通過抑制JNK 激酶而表現出來的[12]。JNK 激酶調控下游轉錄因子核因子NF-κ Β，加速釋放促炎性因子。NF-κΒ 信號發揮主要作用的過程為激活先天免疫與適應性免疫系統肥胖時游離脂肪酸FFA(free fatty acid)通過脂肪細胞表面的Toll 樣受體4 介導，啟動NF-κΒ炎癥信號通路，引發炎癥反應。實驗室發現AMPK 活化對抑制NF-κΒ 信號表達對抑制炎癥因子分泌起重要作用。然而對于腎組織內AMPK 調控炎癥因子關系尚未明確，需深入研究。