東方蜜蜂微孢子蟲蓖麻毒素B凝集素基因的分子克隆及生物信息學(xué)分析

范元嬋 王 杰 孫明會(huì) 吳 鷹 余岢駿 王心蕊 葉亞萍 錢加珺 張凱遙 王思懿 陳大福，2 郭 睿，2*

(1.福建農(nóng)林大學(xué) 動(dòng)物科學(xué)學(xué)院(蜂學(xué)學(xué)院)，福州 350002；2.福建農(nóng)林大學(xué) 蜂療研究所，福州 350002)

東方蜜蜂微孢子蟲(Nosemaceranae)是一種專性侵染成年蜜蜂中腸上皮細(xì)胞的單細(xì)胞真菌病原[1]，蜜蜂罹患微孢子蟲病可引起蜂群群勢和生產(chǎn)力的較大衰減。東方蜜蜂微孢子蟲以孢子的形式在蜜蜂個(gè)體之間傳播，通過攝食經(jīng)口進(jìn)入宿主中腸，在特殊的理化環(huán)境刺激下以“極絲彈射”將具有感染性的孢原質(zhì)注入上皮細(xì)胞，然后利用宿主細(xì)胞的物質(zhì)和能量滿足增殖所需[1-3]。東方蜜蜂微孢子蟲感染能使蜜蜂宿主的糖消耗量增加、壽命縮短、免疫基因抑制、細(xì)胞凋亡抑制、采集積極性下降以及采集日齡提前[4-5]。目前，由于微孢子蟲的轉(zhuǎn)基因操作技術(shù)體系尚未建立，絕大多數(shù)微孢子蟲的基因功能研究滯后。高通量測序技術(shù)為微孢子蟲的相關(guān)研究提供了有力工具。前人對(duì)東方蜜蜂微孢子蟲進(jìn)行了一些轉(zhuǎn)錄組研究，例如Huang等[6]曾對(duì)東方蜜蜂微孢子蟲侵染的西方蜜蜂工蜂中腸進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測序和分析，發(fā)現(xiàn)病原在宿主細(xì)胞中的增殖受到抑制，且己糖激酶、ABC轉(zhuǎn)運(yùn)體和蓖麻毒素B凝集素(Ricin B-lectin)等毒力因子的基因表達(dá)水平下調(diào)；Rodríguez等[7]將極管蛋白3編碼基因的dsRNA飼喂西方蜜蜂工蜂，結(jié)果表明宿主中腸內(nèi)的孢子載量顯著降低，宿主的天然免疫力提升，其生理性能改善，壽命增加；Paldi等[8]通過飼喂西方蜜蜂與東方蜜蜂微孢子蟲同源的ATP/ADP轉(zhuǎn)移酶基因的dsRNA，可以有效抑制中腸中東方蜜蜂微孢子蟲的數(shù)量，降低蜜蜂對(duì)低濃度糖水的敏感度，這一過程可能僅由病原介導(dǎo)也可能是宿主體內(nèi)有與病原相同的RNA沉默系統(tǒng)。本研究前期對(duì)東方蜜蜂微孢子蟲進(jìn)行了較系統(tǒng)的組學(xué)研究，首次鑒定到204條環(huán)狀RNA(Circular RNA, circRNA)[9]和83條長鏈非編碼RNA(Long non-coding RNA, lncRNA)[10]，并深入解析了東方蜜蜂微孢子蟲侵染意大利蜜蜂(Apismelliferaligustica，簡稱意蜂)工蜂的分子機(jī)制[11-13]。蓖麻毒素是一種異源二聚體蛋白，屬于Ⅱ型核糖體失活蛋白家族，其相對(duì)分子質(zhì)量約為65 ku，由A(RTA)和B(RBL)兩條鏈組成，兩條鏈以鏈間二硫鍵(S-S)相連接[14]。凝集素是識(shí)別聚糖配體的蛋白質(zhì)，其作為眾多病原的毒力因子，具有介導(dǎo)細(xì)胞黏附，可通過干擾細(xì)胞膜氧化還原條件協(xié)助病原侵染宿主[15]。RBL蛋白通過與細(xì)胞表面的糖蛋白結(jié)合介導(dǎo)A鏈進(jìn)入細(xì)胞發(fā)揮毒力作用。在家蠶微孢子蟲(N.bombycis)中已鑒定出21個(gè)RBL蛋白編碼基因，它們以串聯(lián)形式分布在基因組[14]。Liu等[15]研究發(fā)現(xiàn)RBL蛋白可增加家蠶微孢子蟲在侵染家蠶(Bombyxmori)卵巢細(xì)胞(BmN)時(shí)的粘附性。蜜蜂微孢子蟲(N.apis)是東方蜜蜂微孢子蟲的姐妹種，其基因組僅含有1個(gè)RBL基因[16]。RBL蛋白具有多個(gè)半乳結(jié)合位點(diǎn)功能域，能夠與細(xì)胞表面的多糖蛋白及糖脂中的半乳糖殘基結(jié)合從而介導(dǎo)RTA進(jìn)入細(xì)胞，故具有凝集素作用[17]。東方蜜蜂微孢子蟲基因組包含9個(gè)RBL基因[18]，但缺乏深入的研究。本研究前期利用基于鏈特異性cDNA建庫的RNA-seq技術(shù)對(duì)東方蜜蜂微孢子蟲的純凈孢子進(jìn)行深度測序，并基于高質(zhì)量的組學(xué)數(shù)據(jù)分析篩選出東方蜜蜂微孢子蟲NCRBL-081基因。在此基礎(chǔ)上，本研究擬首先對(duì)NCRBL-081基因的進(jìn)行分子克隆，再預(yù)測NCRBL-081基因的開放閱讀框(ORF)及編碼的氨基酸序列，并預(yù)測NCRBL-081蛋白的信號(hào)肽、磷酸化位點(diǎn)和二級(jí)結(jié)構(gòu)，進(jìn)而對(duì)東方蜜蜂微孢子蟲與其他3種微孢子蟲的RBL蛋白進(jìn)行系統(tǒng)進(jìn)化分析，以期解決NCRBL-081基因研究不夠深入的問題，并為NCRBL-081基因及其編碼蛋白的功能研究打下基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

東方蜜蜂微孢子蟲的純凈孢子由福建農(nóng)林大學(xué)動(dòng)物科學(xué)學(xué)院(蜂學(xué)學(xué)院)蜜蜂保護(hù)實(shí)驗(yàn)室制備[19-20]。

1.2 東方蜜蜂微孢子蟲的RBL基因來源

本研究前期已利用Illumina測序技術(shù)對(duì)東方蜜蜂微孢子蟲的純凈孢子樣品進(jìn)行測序[12]，基于測序所得高質(zhì)量的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)篩選出9條RBL基因，其中AAJ76_100008081(命名為：NCRBL-081)在東方蜜蜂微孢子蟲侵染意蜂工蜂過程中的表達(dá)量持續(xù)上調(diào)[12]，表明了該基因在病原侵染過程中的潛在重要性。因此，本研究選擇NCRBL-081進(jìn)行分子克隆及相關(guān)生物信息學(xué)分析。

1.3 RBL基因的分子克隆與Sanger測序

利用DNA抽提試劑盒(TaKaRa公司，中國)提取東方蜜蜂微孢子蟲孢子的基因組DNA，作為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR體系包括：模板1 μL，PCR mix 10 μL，上下游引物各1 μL，無菌水7 μL。PCR程序?yàn)椋?4 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃變性50 s，55 ℃退火50 s，72 ℃延伸1 min，34個(gè)循環(huán)；72 ℃再延伸5 min。PCR產(chǎn)物經(jīng)過1.5%的瓊脂糖凝膠電泳分離，在凝膠成像儀(上海培清，中國)下進(jìn)行觀察并對(duì)目的片段進(jìn)行切膠。采用膠回收試劑盒(Vazyme公司，中國)回收目的片段，然后連接到pMD19-T載體(TaKaRa公司，中國)，反應(yīng)體系包括：pMD19-T載體 1 μL，目的片段10 μL，solution 5 μL，無菌水4 μL。在16 ℃金屬浴中進(jìn)行連接反應(yīng)2 h。將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化DH5α感受態(tài)細(xì)胞，并在含氨芐青霉素的LB固體培養(yǎng)基上進(jìn)行涂板，然后放入37 ℃生化培養(yǎng)箱培養(yǎng)過夜，用無菌的牙簽挑取單菌落放入含氨芐青霉素的LB液體培養(yǎng)基，37 ℃震蕩培養(yǎng)12 h，最后取1 mL放入無菌的EP管送至生工生物工程(上海)公司進(jìn)行雙端測序，采用M13引物。

1.4 RBL基因的生物信息學(xué)分析

根據(jù)NCRBL-081的核酸序列，利用NCBI網(wǎng)站(www.ncbi.nlm.nih.gov/orffinder/)上的ORF工具預(yù)測NCRBL-081編碼的氨基酸序列。再根據(jù)蛋白質(zhì)的氨基酸序列，利用ExPASy網(wǎng)站(https:∥web.expasy.org/protparam/)上的Protparam、ProtScale、HMMTOP、SignalP 4.1 Server、NetPhos 3.1 Server、SOPMA和SWISS-model等軟件預(yù)測NCRBL-081編碼蛋白的理化性質(zhì)、跨膜結(jié)構(gòu)域、信號(hào)肽、磷酸化位點(diǎn)、二級(jí)和三級(jí)結(jié)構(gòu)模型。

1.5 4種微孢子蟲RBL蛋白的系統(tǒng)進(jìn)化樹構(gòu)建及分析

從NCBI數(shù)據(jù)庫(https:∥www.ncbi.nlm.nih.gov)中查詢和下載東方蜜蜂微孢子蟲所有RBL蛋白的氨基酸序列，以及家蠶微孢子蟲、蜜蜂微孢子蟲和兔腦炎微孢子蟲(Encephalitozooncuniculi)的RBL蛋白的氨基酸序列。通過Clustalx軟件[21]將上述4種微孢子蟲的RBL蛋白的氨基酸序列進(jìn)行多重比對(duì)。再利用MEGA-X軟件[22]構(gòu)建和分析微孢子蟲的RBL蛋白系統(tǒng)進(jìn)化樹，使用軟件默認(rèn)參數(shù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 NCRBL-081的分子克隆

PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的電泳結(jié)果顯示，擴(kuò)增片段大小(約700 bp)符合預(yù)期(圖1)。Sanger測序結(jié)果顯示克隆出的NCRBL-081的核酸序列與轉(zhuǎn)錄組測序結(jié)果中該基因的核酸序列一致性為100%，說明成功克隆到東方蜜蜂微孢子蟲的NCRBL-081基因。

1: NCRBL-081; 2: 無菌水 (陰性對(duì)照); M: DNA標(biāo)準(zhǔn)分子量標(biāo)記。1: NCRBL-081; 2: Sterile water (negative control); M: DNA marker.圖1 PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的瓊脂糖凝膠電泳Fig.1 Agarose gel electrophoresis for PCR amplification products

2.2 NCRBL-081編碼蛋白的預(yù)測和分析

NCRBL-081共含有630個(gè)核苷酸，可編碼209個(gè)氨基酸，氨基酸序列為MLIFFRVISKMLILFLFSAIYSEELQFLVKGFGMYICTKDGYTLYGCSDKSYISKFLLEYDNNGKLFIISPKYNKIFDIANNESLILWPKHGGPNQVFELNWINNKEFMLMNREKCVVYNDVTNKFDYKDCKLGSERNKLFKVGPDEERPEQLTRPSLISPTHDNEHAEDDSCSCFDEPIRRKRRHRHHIDDPHYRRRGGHRHYRPMKR。該編碼蛋白的分子式為C1123H1700N312O312S12，相對(duì)分子質(zhì)量約為25 ku，等電點(diǎn)為8.93，親水性為-0.682。此外，該編碼蛋白為親水性蛋白。

NCRBL-081編碼蛋白中含有1個(gè)典型的信號(hào)肽，說明其為分泌型蛋白(圖2(a))。磷酸化位點(diǎn)預(yù)測結(jié)果顯示，NCRBL-081編碼蛋白還包含9個(gè)絲氨酸磷酸化位點(diǎn)、6個(gè)酪氨酸磷酸化位點(diǎn)和1個(gè)蘇氨酸磷酸化位點(diǎn)(圖2(b))。二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測結(jié)果顯示該編碼蛋白含有20.10%的α螺旋，8.61%的β折疊，25.84%的延伸鏈及45.45%的無規(guī)卷曲，在11-29個(gè)氨基酸的位置有1個(gè)跨膜結(jié)構(gòu)域(圖2(c))。該編碼蛋白的三維結(jié)構(gòu)表現(xiàn)出外顯β-1,3-半乳聚糖酶1,3Gal43A的晶體結(jié)構(gòu)，是Ⅱ型核糖體失活蛋白家族的典型特征(圖2(d))。

(c)藍(lán): α螺旋; 紅: 延伸鏈; 綠: β折疊; 紫: 無規(guī)則卷曲。(c) blue: α helix; red: extended chain; green: β corner; purple: irregular curl.圖2 NCRBL-081編碼蛋白的信號(hào)肽(a)、磷酸化位點(diǎn)(b)、二級(jí)結(jié)構(gòu)(c)和三級(jí)結(jié)構(gòu)(d)Fig.2 Signal peptide (a), phosphorylation site (b), secondary structure (c) and tertiary structure (d) of NCRBL-081 encoding protein

2.3 4種微孢子蟲RBL蛋白的系統(tǒng)進(jìn)化樹

如表1所示，東方蜜蜂微孢子蟲基因組含有9個(gè)RBL基因，而蜜蜂微孢子蟲僅含有1個(gè)RBL基因[23]，家蠶微孢子蟲[24]和兔腦炎微孢子蟲[25]分別含有16和4個(gè)RBL基因。將上述4種微孢子蟲的RBL基因編碼蛋白進(jìn)行多重比對(duì)，系統(tǒng)進(jìn)化分析結(jié)果顯示同一個(gè)微孢子蟲物種的不同RBL蛋白進(jìn)化距離較近，而不同微孢子蟲物種RBL蛋白進(jìn)化距離較遠(yuǎn)；此外，AAJ76_100008081與NCER_100581聚為一支，表現(xiàn)出較近的親緣關(guān)系(圖3)。

各分支上的數(shù)字為自舉值(1 000次重復(fù)抽樣檢驗(yàn))。Numerals on each node represent bootstrap values from 1 000 replicates.圖3 4種微孢子蟲的RBL蛋白的系統(tǒng)進(jìn)化樹Fig.3 The phylogenetic tree of RBL proteins of four microsporidian species

表1 4種微孢子蟲的蓖麻毒素B凝集素編碼基因Table 1 Ricin B-lectin encoding genes in four microsporidian species

3 討論與結(jié)論

微孢子蟲僅在宿主細(xì)胞內(nèi)增殖，在體外以休眠態(tài)的孢子形式存在[1]。東方蜜蜂微孢子蟲專性寄生成年蜜蜂中腸上皮細(xì)胞，但迄今尚沒有來源于蜜蜂組織或器官的體外傳代培養(yǎng)細(xì)胞系供東方蜜蜂微孢子蟲侵染，因而無法在細(xì)胞水平對(duì)東方蜜蜂微孢子蟲進(jìn)行轉(zhuǎn)基因操作。2009年，Cornman等[26]測序并公布了東方蜜蜂微孢子蟲的基因組。Huang等[27]曾利用small RNA-seq技術(shù)探究了東方蜜蜂微孢子蟲感染1～6 d的西方蜜蜂工蜂的微小RNA(MicroRNA, miRNA)應(yīng)答，發(fā)現(xiàn)宿主差異表達(dá)miRNA(Differentially expressed miRNA, DEmiRNA)可能通過調(diào)控物質(zhì)代謝和能量代謝相關(guān)基因表達(dá)進(jìn)行侵染應(yīng)答。Dussaubat等[28]對(duì)受東方蜜蜂微孢子蟲脅迫的西方蜜蜂工蜂中腸轉(zhuǎn)錄組分析發(fā)現(xiàn)病原侵染抑制了參與腸道組織內(nèi)穩(wěn)態(tài)和更新的通路及基因，推測這是導(dǎo)致蜜蜂宿主在侵染早期死亡的原因之一。

蓖麻毒素是一種細(xì)胞毒素蛋白，包含A鏈和B鏈，其中A鏈具有細(xì)胞毒素的作用，可導(dǎo)致核糖體失活；而B鏈屬于凝集素，能與細(xì)胞膜表面半乳糖受體結(jié)合進(jìn)而協(xié)助A鏈進(jìn)入細(xì)胞[29]。人們已在很多物種中鑒定到與蓖麻毒素B鏈結(jié)構(gòu)相近的蛋白，這類蛋白統(tǒng)稱為RBL蛋白家族[30-31]。此前，東方蜜蜂微孢子蟲蓖麻毒素基因雖有少量報(bào)道，但都是基于生物信息學(xué)方法的預(yù)測結(jié)果，缺少更深入的研究。在前期研究基礎(chǔ)上，本研究通過PCR對(duì)東方蜜蜂微孢子蟲的的NCRBL-081基因進(jìn)行擴(kuò)增，Sanger測序結(jié)果證實(shí)克隆出的序列確為NCRBL-081基因。這為進(jìn)一步開展NCRBL-081基因的功能研究提供了必要基礎(chǔ)。另外，上述結(jié)果也說明基于Illumina HiSeq平臺(tái)得到的轉(zhuǎn)錄組測序數(shù)據(jù)具有較高的準(zhǔn)確性，可作為基因克隆的重要資源，這與前人的研究報(bào)道一致[33-35]。李能章[14]曾對(duì)家蠶微孢子蟲的21個(gè)RBL基因進(jìn)行鑒定和分析，發(fā)現(xiàn)多數(shù)RBL基因主要以串聯(lián)形式分布在第6號(hào)和463號(hào)Scaffold上，其中9個(gè)RBL基因的N端含有真核生物典型的信號(hào)肽[2]，但只有2個(gè)RBL蛋白含有跨膜結(jié)構(gòu)域。Liu等[15]研究發(fā)現(xiàn)RBL蛋白能夠增強(qiáng)家蠶微孢子蟲對(duì)BmN細(xì)胞的粘附性。東方蜜蜂微孢子蟲孢子經(jīng)極絲彈射將具有感染性的孢原質(zhì)注入宿主細(xì)胞，隨后進(jìn)入增殖周期，利用宿主的物質(zhì)和能量進(jìn)行增殖，孢子的數(shù)量逐漸增多，最終導(dǎo)致宿主細(xì)胞破裂，釋放出大量的成熟孢子，進(jìn)而侵染周圍的正常細(xì)胞，或隨食物殘?jiān)懦鲶w外，繼續(xù)感染同一蜂群的其他蜜蜂個(gè)體或臨近的其他蜂群[1]。本研究發(fā)現(xiàn)NCRBL-081編碼蛋白在11～29個(gè)氨基酸的位置區(qū)域有1個(gè)跨膜結(jié)構(gòu)域，同時(shí)1～21個(gè)氨基酸為1個(gè)信號(hào)肽。鑒于在翻譯過程中蛋白質(zhì)的信號(hào)肽通常會(huì)切割掉，推測NCRBL-081編碼蛋白并不是膜蛋白，但該編碼蛋白在宿主細(xì)胞中合成后被分泌到胞外，協(xié)助成熟孢子粘附和侵染其他細(xì)胞。

在自然環(huán)境中，東方蜜蜂微孢子蟲的毒力比蜜蜂微孢子蟲更強(qiáng)，導(dǎo)致后者逐漸被前者取代[4]。本研究中，通過查詢和比較發(fā)現(xiàn)蜜蜂微孢子蟲僅含有1個(gè)RBL基因，而東方蜜蜂微孢子蟲含有9個(gè)RBL基因，更多的RBL基因或許是東方蜜蜂微孢子蟲具有更強(qiáng)毒力的原因之一。系統(tǒng)進(jìn)化分析結(jié)果顯示東方蜜蜂微孢子蟲的AAJ76_100008081與NCER_100581聚為一支，推測在長期進(jìn)化過程中該基因發(fā)生了復(fù)制，東方蜜蜂微孢子蟲侵染蜜蜂宿主的意義值得進(jìn)一步研究。

綜上，本研究成功克隆了東方蜜蜂微孢子蟲的NCRBL-081基因，并對(duì)該基因的編碼蛋白進(jìn)行了生物信息學(xué)分析，研究結(jié)果揭示了NCRBL-081蛋白的分子特征，并為深入開展NCRBL-081基因及其編碼蛋白的功能研究打下了基礎(chǔ)。