中國奶牛牛支原體流行病學調查分析

溫 靖 李 丹 郭 婷 武春霞 周雅坪 田廣原 羅玉霞 郝永清*

(1.內蒙古農業大學 獸醫學院/農業部動物疾病臨床診療技術重點實驗室，呼和浩特 010010；2.內蒙古自治區生態與農業氣象中心，呼和浩特 010052；3.阿拉善左旗農牧區生態管理綜合行政執法局，內蒙古 巴彥浩特 75300)

牛支原體(Mycoplasmabovis)從1960年被發現至今逐漸成為對中國乃至世界養牛業造成巨大損失的動物性病原體。雖然目前仍沒有被列入重大疫病的名單，但是已經引起越來越多的重視。許多報道已經證明牛支原體病呈現世界性分布。由于抗生素的廣泛使用，肺炎球菌、金黃色葡萄球菌等病原體得到了很大程度的控制。M.bovis對抗生素不敏感，臨床診療過程中發現，M.bovis逐步成為引起犢牛肺炎的重要病原體。除此之外，M.bovis也可引起關節炎、乳腺炎、結膜炎和中耳炎[1]。據估測每年1/4到1/3的呼吸系統相關疾病可能與M.bovis感染有關[1]。

2008年，中國首次從犢牛肺臟中分離到M.bovis[2]。雖然已有一些關于M.bovis流行和爆發的報道，但國內尚無長期持續性、大規模監測M.bovis流行情況的研究。目前，關于M.bovis流行情況的相關研究多采用肺臟分離細菌或血清學方法進行檢測[3-6]。雖然從病死犢牛肺臟中分離M.bovis，能夠明確診斷M.bovis的感染情況，但從犢牛肺臟中分離M.bovis需要對犢牛進行剖檢，難以在養殖場中大規模開展。另外由于采樣個數較少，無法對M.bovis在整體牛群中流行情況進行精確評估。血清學方法相對前者雖然較為簡便，但是由于M.bovis存在表面抗原變異，由急性感染轉為慢性感染后血液中抗體水平下降，難以檢測，易出現漏診[7-8]。上述兩種方法，均不能對無癥狀犢牛或攜帶M.bovis的牛群散毒情況進行整體評價。因此，尋找一簡單易行的評估方法是很有必要的。

犢牛支原體肺炎的發病高峰在1～4月齡[1-2，10]，這個階段犢牛的免疫系統尚未發育完全，M.bovis在鼻腔內定植可下行引發牛支原體肺炎。處于感染急性期和恢復期的病牛是M.bovis重要的傳染源，M.bovis在犢牛呼吸系統定植后的2～6 d后開始通過上呼吸道和鼻腔排出M.bovis。感染M.bovis的病牛淚液、鼻腔分泌物、陰道分泌物、乳汁和精液均有可能攜帶M.bovis[10-15]。鼻腔是M.bovis定植的最主要的場所，鼻腔分泌物是最重要的M.bovis傳播介質[5,8，10]。關于M.bovis在上呼吸道定植和排出的相關研究較少[16]。雖然M.bovis的定植并不直接導致動物發病，但在免疫力下降，通風換氣不良，其他呼吸道病原微生物入侵等條件下，定植在鼻腔中的M.bovis可下行至肺臟，引發犢牛肺炎[11-12]。因此，通過鼻腔檢測并評估M.bovis傳播風險是可行的，為預防包括牛支原體肺炎、牛支原體乳房炎和牛支原關節炎的爆發吹響警報[3,5,17-18]，該方法也更容易被養殖戶接受。因此，本研究針對中國六大區域的奶牛場的0～80日齡無癥狀犢牛通過采集鼻腔拭子進行了M.bovis流行情況調查，并分析M.bovis陽性率的時空分布規律，M.bovis陽性率與犢牛日齡的相關性，對中國奶牛養殖地區預防和控制牛支原體相關疾病的發生具有指導意義。

1 材料與方法

1.1 樣本采集與來源

2013—2019年，全國6個區域，西南區以重慶市、四川省、云南省為代表；華南區以廣東省為代表；華東區以江蘇省、安徽省、山東省為代表；華中區以河北省和山西省為代表；華北區以內蒙古自治區為代表；西北區以甘肅省、新疆維吾爾族自治區為代表。隨機對這些區域內存欄奶牛數在5 000頭以上的集約化養殖牧場的0～80日齡無癥狀犢牛進行鼻拭子采樣。2013—2019年，上述地區不同牧場每年連續收集3個月的鼻拭子樣品，每個月采樣15份，3個月共收集45份。最終收集鼻拭子樣品1 878份。

1.2 主要試劑

基礎培養基：PPLO肉湯粉21 g，0.4%酚紅2.5 mL，25%酵母浸液10 mL，充分溶解定容至800 mL，用1 mol/L NaOH調pH至7.6～7.8，121 ℃ 滅菌15 min，4 ℃可保存2周。

完全培養基：基礎培養基使用時加入200 mL的滅活馬血清、終濃度為100 U/mL的青霉素以及終質量濃度為1 g/L的丙酮酸鈉。配制固體培養基時，高壓前再加入10 g瓊脂粉，滅菌后溫度降至50 ℃時再加入后續的添加劑。

1.3 鼻拭子樣品的收集

采用一次性無菌棉簽深入鼻腔10 cm深度進行采樣，采集的樣品置-20 ℃冰箱凍存，集中全程冷鏈運輸，在實驗室進行細菌分離和PCR鑒定。

1.4 牛支原體的分離培養

實驗室進行牛支原體分離培養方法參照文獻[10]，將拭子在支原體液體完全培養基中培養48 h，然后均勻涂布支原體完全培養基平板。所有的培養物均在37 ℃的5% CO2條件下培養。如果連續培養10 d沒有觀察到典型的牛支原體菌落生長，則為陰性。觀察到典型油煎蛋樣牛支原體菌落，挑單菌落接種到液體培養基中增菌培養。

1.5 M.bovis的PCR鑒定

培養結束后離心收集菌體沉淀，用牛支原體DNA提取試劑盒(購于BIOMIGA公司)提取基因組進行PCR鑒定，使用美國典型培養物保藏中心(ATCC)M.bovis標準菌株PG45(保藏號25523)作為陽性對照。無菌水作為陰性對照。引物設計參照Pinnow等[19]M.bovis基因序列特異性引物(PpSM5-1，5’-CCAGCTCACCCTTATACATGA-GCGC-3’；PpSM5-2，5’-TGACTCACCAATTA-GACCGACTATTTCAC-3’)。

PCR反應總體系為25 μL：模板3 μL、2×Taq Master Mix 12.5 μL、對應上下游引物各0.5 μL、ddH2O 8.5 μL。經優化后PCR擴增條件為95 ℃預變性5 min；95 ℃變性30 s，退火1 min；72 ℃延伸1 min，共32個循環；72 ℃延伸10 min，4 ℃條件下保存，電泳觀察結果。

1.6 數據分析

對不同地區犢牛M.bovis陽性率的分析采用多重t檢驗。對不同年份，犢牛M.bovis陽性率的統計學分析采用One-way ANOVA。對于不同季節，M.bovis陽性的分析采用非配對t檢驗。判斷相同年份不同季節，同一地點不同季節，M.bovis的陽性率的統計學分析采用Two-way ANOVA。采用Two-tailed分析判斷犢牛M.bovis陽性率與日齡相關性。當P<0.05時，表示顯著性差異，當P>0.05時，表示無顯著性差異。

2 結果與分析

2.1 部分樣品的M.bovis PCR檢測

用M.bovis特異性引物PCR 檢測犢牛鼻拭子DNA，結果所示612份鼻拭子樣品均擴增出約442 bp大小的片段，與預期擴增片段相符(圖1)。不同來源犢牛鼻拭子M.bovisPCR 檢測結果見表2，陽性檢出率為9.8%～54.1%。從上述的612份陽性病料中共分離得到83株易于在實驗室長期培養的牛支原體。

M，DNA 標準DL2 000；1～19，鼻拭子樣品1～19；20，M.bovis標準菌株PG45；21，空白對照。M， DL2 000 DNA Marker; 1-19, Nasal samples 1-19; 20, M.bovis standard strain PG45; 21, Blank control.圖1 犢牛部分鼻拭子樣品中牛支原體PCR檢測Fig.1 PCR detection of of Mycoplasma bovis in nasal swab samples of calves

2.2 2013—2019年全國奶牛養殖六大地區犢牛M.bovis陽性率及其時空分布規律

全國奶牛養殖六大地區犢牛M.bovis陽性率檢測結果見表2。2013—2019年，M.bovis陽性率平均值由高到低分別是西北區(38.7%)、華東區(35.6%)、華北區(33.6%)、華中區(30.8%)、華南區(29.9%)和西南區(27.1%)(圖2 (a))。中國奶牛養殖地區M.bovis陽性率在30%～40%波動。經統計學分析發現，六大奶牛養殖地區M.bovis陽性率不具有顯著性差異(P>0.05)。

(a)M.bovis陽性率的空間分布；(b)M.bovis陽性率的時間分布；(c)M.bovis陽性率的季節性分布；(d)季節和年份雙因素對M.bovis陽性率的影響；(e)地區和季節雙因素對M.bovis陽性率的影響。(a) Spatial distribution of M.bovis positive rate; (b)Time distribution of M.bovis positive rate; (c) Distribution of M.bovis positive rate in different seasons; (d) Effects of seasons and years on the positive rate of M.bovis; (e) Effects of regions and seasons on the positive rate of M.bovis.圖2 2013—2019年中國六大奶牛養殖地區M.bovis陽性率時空分布Fig.2 Time and space distribution of positive rate of M.bovis in six major dairy farm areas from 2013 to 2019 in China

全國奶牛養殖地區犢牛M.bovis陽性率2013—2019年陽性率平均值為32.6%(圖2 (b))。2013—2015年，M.bovis陽性率維持在40%以上，2013—2015年M.bovis陽性率平均值由高到低分別為2014年(48.6%)、2015年(48.1%)、2013年(47.0%)。2013—2015年M.bovis陽性率平均值為47.9%，三年間M.bovis陽性率無顯著性差異。2016—2019年M.bovis陽性率下降，在20%～30%波動，由高到低分別為2019年(26.5%)、2017年(20.9%)、2016年(20.4%)、2018(16.7%)。2016—2019年M.bovis陽性率平均值為21.1%，四年間M.bovis陽性率無顯著性差異。2013—2015年M.bovis陽性率顯著高于2016—2019年(P<0.05)。表明M.bovis陽性率波動可能存在一定的周期性，需要進一步驗證。

通過研究不同季節M.bovis流行情況發現，冬春季節(10～次年3月)M.bovis陽性率(33.9%)平均值略高于夏秋季節(4～9月)(31.3%)，但差異不顯著(P>0.05)(圖2(c))。針對季節和年份因素對M.bovis陽性率進行統計學分析，2019年冬春季節(34.6%)和夏秋季節M.bovis陽性率(22.5%)存在統計學差異(P<0.05)，其余年份不同季節M.bovis陽性率不存在顯著性差異(圖2(d))。除華南地區冬春季節與夏秋季節，M.bovis陽性率存在顯著性差異外(P<0.05)，參與調查的華東、華北、西北、西南和華中地區，冬春季節和夏秋季節均不存在顯著性差異(P>0.05)(圖2(e))。

2.3 不同日齡犢牛與犢牛群中M.bovis陽性率的相關性分析

按照日齡對犢牛進行分組，分為0～20、20～40、40～60和60～80日齡組。對M.bovis流行情況進行研究，Two-tailed法分析發現M.bovis陽性率與犢牛日齡具有顯著性關聯(P<0.01)。其中0～20日齡組，M.bovis陽性率為7.4%。20～40日齡組，M.bovis陽性率為25.4%。40～60日齡組，M.bovis陽性率43.2%。60～80日齡組，M.bovis陽性率為54.5%(表3)。犢牛鼻腔中M.bovis陽性率與日齡呈線性正相關(Y=0.795 5X-7.175，R2=0.99)。表明隨著犢牛日齡的增加，犢牛生活范圍的擴大，接觸、定植和感染牛支原體的風險增加。

表3 不同日齡組犢牛M.bovis陽性率分析Table 3 Analysis of positive rate of M.bovis in calves of different age groups

3 討 論

病原學和血清學方法均已證明M.bovis目前在世界上和中國范圍均廣泛流行。Brice等[20]在早期研究中發現荷蘭等國家的育肥牛場中M.bovis流行率高達20%以上，而僅有極少一部分牛是完全健康的。英國被檢測的養殖場中，50%的場區有感染M.bovis的情況，被感染的牛群表現出生長性能下降等特點[20]。歐洲每年約有25%～33%的犢牛肺炎是由M.bovis引起的[20-21]。美國每年單個牛場M.bovis流行率甚至高達70%，M.bovis引起的牛呼吸道疾病和乳腺炎對美國造成巨大的經濟損失[22]。日本流行率相對較低，只有平均4.8%的牧場發現存在M.bovis感染[23]。比利時的流行率也相對較低，檢測的200個牧場中只有3個牧場發現M.bovis感染[24]。李巖等[25]在2013年對新疆地區15個規模化奶牛場中牛支原體的感染情況調查發現437份血清中牛支原體抗體陽性率為40.0%；44份肺臟、關節液、鼻腔黏液樣本中牛支原體陽性率為40.9%。謝建華等[26]從2008年到2013年持續對重慶地區牛支原體感染情況檢測發現，血清中抗體陽性率在40.3%～75.0%。其中奶牛養殖場(61.8%)高于規模化肉牛場(51.3%)高于散養戶(44.7%)。郭澍強等[27]對銀川地區12個規模化牛場的230份奶牛血清進行檢測發現牛群平均陽性率為26.5%，牛場陽性率為100%。上述的研究結果表明牛支原體在中國規模化牛場中的流行十分普遍。

M.bovis可以引起乳房炎、肺炎和關節炎等疾病。目前，對M.bovis引起犢牛肺炎的調查多集中在某一牧場爆發犢牛肺炎后，通過對死亡病牛進行剖檢，分離造成犢牛肺炎的病原或通過收集血清后利用免疫學方法檢測抗牛支原體抗體，得到關于M.bovis在牧場中流行情況的數據。對比前兩種方法，在牛鼻腔拭子或犢牛鼻液中分離、鑒定M.bovis，簡便易行，可操作性強，易于被養殖戶接受，可以在牧場中大面積推廣。

本研究表明，2013—2019年M.bovis在中國集約化牧場長期流行。2013—2015年M.bovis陽性率無顯著性差異，平均值顯著高于2016—2019年M.bovis陽性率，提示M.bovis的傳播和流行可能存在一定的周期性。2016—2019年M.bovis陽性率相對較低，可能與2013—2015年M.bovis流行期間，大量病畜淘汰和死亡，其余家畜均獲得免疫有關。我國M.bovis感染情況高于日本和比利時等國，感染水平接近歐洲和美國。由于2020年新冠肺炎疫情影響，人員的流動和生物制品的運輸受到影響，本實驗室未收集到2020年牧場的送檢樣品。M.bovis在中國集約化牧場流行情況的長期監測受到了中斷。摸清M.bovis傳播和流行的周期性特點需要長期的、持續的進行M.bovis流行情況監測。本實驗室會繼續監測中國奶牛養殖地區M.bovis流行情況，為M.bovis的傳播和流行的規律性研究提供數據支持。

從空間上，六大奶牛養殖地區M.bovis陽性率無顯著性差別。雖然不同季節，M.bovis陽性率差異不顯著，冬春季節M.bovis平均陽性率略高于夏秋季節。推斷可能與低溫有利于M.bovis在奶牛養殖場飼養環境中存活有關[28]。目前尚無媒介昆蟲機械性攜帶M.bovis有利于其傳播的報道。統計學結果也證實除華南地區以外，同一地區不同季節，M.bovis平均陽性率差異不顯著。研究試圖分析牧場中M.bovis陽性率與當地溫度和濕度的關系，尚未發現任何統計學意義的結果。由于參與流行病學調查的牧場多為半開放圈舍，犢牛舍中的溫度、濕度常年波動范圍變化不大。故未將溫度、濕度分析結果列出。

M.bovis為條件致病菌，長期定植于犢牛的上呼吸道中。M.bovis在牛群中陽性率隨著日齡的增長而升高，在7～10 d中，M.bovis陽性率為1%以下，到80日齡時，M.bovis陽性率為60%～80%，總體陽性率32.6%。隨著日齡的增長，犢牛的活動范圍變大，接觸M.bovis污染的水、飼料、器具和其他患病動物的機會增加，可能是陽性率增加的主要原因，且該結果與Soehnlen等[18]研究結果相同。

4 結 論

從2013—2019年，我國六大奶牛養殖地區犢牛鼻腔中M.bovis陽性率為9.8%～54.1%。不同地區，陽性率不同，但不具有顯著性差異。其中2013—2015年M.bovis流行情況較為嚴重，陽性率顯著高于2016—2019年。另外，不同季節M.bovis陽性率差異不顯著，且M.bovis陽性率與犢牛日齡呈正相關。