李 燕, 秦夏蓮, 沈 艷

(江蘇省無(wú)錫市第八人民醫(yī)院 皮膚科, 江蘇 無(wú)錫, 214000)

銀屑病為臨床常見(jiàn)皮膚病，激素、免疫抑制劑是其主要治療藥物，但副作用大，復(fù)發(fā)率高。目前，銀屑病的發(fā)病機(jī)制尚未闡明，有學(xué)者[1]認(rèn)為角質(zhì)形成細(xì)胞增殖與銀屑病密切相關(guān)。白芍總苷具有抗炎、止痛及調(diào)節(jié)免疫力的功效，已被用于多種疾病的治療中[2-3]。近年來(lái)研究[4]發(fā)現(xiàn)，白芍總苷對(duì)銀屑病療效顯著(無(wú)論是單獨(dú)用藥還是聯(lián)合用藥)，且副作用小，但確切機(jī)制尚不清楚。外泌體是一種細(xì)胞外囊泡，是微環(huán)境中細(xì)胞間通訊的重要載體，參與細(xì)胞間信息傳遞。相關(guān)研究[5]顯示，銀屑病患者外周血中性粒細(xì)胞分泌的外泌體中炎性因子水平相較中性粒細(xì)胞更高，提示外泌體在銀屑病發(fā)病中可能發(fā)揮著一定作用。本研究探討白芍總苷對(duì)HaCaT細(xì)胞生物學(xué)行為、外泌體分泌的影響及其可能機(jī)制，以期為銀屑病的防治提供新思路。

1 材料與方法

1.1 主要試劑、細(xì)胞株及儀器

白芍總苷(美國(guó)TargetMol 公司), HaCaT 細(xì)胞(美國(guó)Sciencell Research Laboratories); 杜氏改良伊格爾培養(yǎng)基(DMEM)培養(yǎng)液、雙抗、胰蛋白酶(天津中奧天元生物有限公司); 引物序列(蘇州金維智生物有限公司); 兔抗人CD63、CD81、細(xì)胞周期蛋白D1(CyclinD1)、蛋白激酶B(Akt)、磷酸化蛋白激酶B(p-Akt)、磷脂酰肌醇3-激酶(PI3K)、磷酸化磷脂酰肌醇3-激酶(p-PI3K)及β-actin多克隆一抗、鼠抗兔單克隆二抗(Abcam公司，英國(guó)); Transwell小室(美國(guó)Coring公司); 四甲基偶氮唑藍(lán)(MTT)檢測(cè)試劑盒，RNA提取試劑盒(北京Biosharp公司); 聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)試劑盒(大連寶生物有限公司)，蛋白印跡試劑盒(北京索萊寶公司); 酶標(biāo)儀(美國(guó)bio-rad公司), ABI 7900 PCR擴(kuò)增儀(美國(guó)Bio-Rad公司), Tecnai F30 G2型號(hào)場(chǎng)發(fā)射透射電子顯微鏡(美國(guó)賽默飛公司)。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)及分組

用DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)細(xì)胞(37 ℃, 5%CO2培養(yǎng))，當(dāng)細(xì)胞融合度達(dá)到80%后用胰酶消化，離心，每孔100 μL(細(xì)胞密度2×105個(gè)/mL)接種于96孔板中，分別加入50、100、200 μg/L白芍總苷培養(yǎng)液(分別設(shè)為低劑量組、中劑量組、高劑量組)，同時(shí)設(shè)對(duì)照組(加入等量完全培養(yǎng)液)，每組3個(gè)復(fù)孔。

1.3 MTT實(shí)驗(yàn)

按照1×104個(gè)/孔細(xì)胞密度將細(xì)胞于96孔板培養(yǎng)24、48、72 h后，每孔加入20 mL MTT孵育4 h, 去培養(yǎng)液后加入150 μL 二甲基亞砜(DMSO), 水平搖床30 min, 測(cè)量吸光度(A)值，計(jì)算細(xì)胞增殖抑制率。細(xì)胞增殖抑制率=(對(duì)照組A值-白芍總苷組A值)/對(duì)照組A值×100%。

1.4 Transwell實(shí)驗(yàn)

采用無(wú)Matrigel基質(zhì)膠和有Matrigel基質(zhì)膠的Transwell小室分別進(jìn)行細(xì)胞遷移實(shí)驗(yàn)和侵襲實(shí)驗(yàn)。遷移實(shí)驗(yàn): 上室加入200 μL細(xì)胞密度為5×104個(gè)/mL的培養(yǎng)基，下室加入600 μL含10%胎牛血清的培養(yǎng)液，孵育48 h, 4%多聚甲醛固定10 min, 0.5%結(jié)晶紫染色10 min。清洗曬干，計(jì)算細(xì)胞數(shù)量。侵襲實(shí)驗(yàn): 無(wú)血清DMEM: 稀釋基質(zhì)膠為1∶6, 每個(gè)Transwell小室中加40 μL Matrigel基質(zhì)膠, 37 ℃孵育半小時(shí)。去除培養(yǎng)液，其余同遷移實(shí)驗(yàn)。

1.5 外泌體蛋白提取及檢測(cè)

取處理后繼續(xù)培養(yǎng)24 h后的各組細(xì)胞，用胰酶消化，采用超速離心法提取外泌體, 1 500 轉(zhuǎn)/min離心10 min, 棄上清液，用磷酸鹽緩沖液(PBS)洗滌后再以36 000 轉(zhuǎn)/min離心20 min, 220 nm無(wú)菌濾膜過(guò)濾, 30 000 轉(zhuǎn)/min離心90 min, 小心吸盡上清液并丟棄，沉淀即為外泌體。用10 μL細(xì)胞裂解液孵化20 min, 常溫下36 000 轉(zhuǎn)/min離心20 min, 留取上清液，即為外泌體蛋白。

1.6 透射電子顯微鏡觀察外泌體

將細(xì)胞的純化外泌體重懸于PBS中，滴入電子顯微鏡格柵中吸收10 min, 然后將吸收的外泌體用2%磷鎢酸(pH值6.8)進(jìn)行5 min負(fù)染色，于白熾燈下風(fēng)干后，使用透射電子顯微鏡(PHLIPS-TECNAI 10)在120 kV下進(jìn)行電鏡觀察。

1.7 蛋白質(zhì)印跡法(Western Blot)檢測(cè)外泌體相關(guān)指標(biāo)和通路相關(guān)指標(biāo)蛋白表達(dá)量

取處理后繼續(xù)培養(yǎng)24 h后的各組細(xì)胞，加入裂解液，冰浴30 min, 40 ℃ 1 500 轉(zhuǎn)/min離心5 min, 去上清液，離心，取10 μL待測(cè)。取此前提取的外泌體蛋白10μL, 按照說(shuō)明書要求檢測(cè)蛋白濃度。配膠，十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE) 2 h, 清洗，轉(zhuǎn)膜, 3%脫脂牛奶4 ℃封閉2 h, 清洗，依次加入CyclinD1(1∶1 000)、Akt(1∶1 000)、p-Akt(1∶1 000)、PI3K(1∶1 200)、p-PI3K(1∶1 000)、CD63(1∶1 200)、CD81(1∶1 000)及β-actin(1∶1 000), 清洗，加入二抗，孵育2 h, 清洗，增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光法曝光，采用Image J軟件分析處理，結(jié)果用目的蛋白與β-actin灰度值的比值表示。

1.8 實(shí)時(shí)熒光定量PCR法檢測(cè)細(xì)胞中CyclinD1、Akt、p-Akt、PI3K的mRNA表達(dá)

取處理后繼續(xù)培養(yǎng)24 h后的各組細(xì)胞，加入1 mL Trizol, 然后依次加入氯仿、異丙醇等提取RNA, 逆轉(zhuǎn)錄成cDNA, PCR擴(kuò)增，目標(biāo)引物序列見(jiàn)表1。反應(yīng)體系: SYBR?Premix Ex TaqTM(2×)12.5 μL+上下游引物(10 μmol/L)各1 μL, cDNA 2μL, 加焦碳酸二乙酯(DEPC)水至總體積為25 μL。反應(yīng)參數(shù): 95 ℃ 預(yù)變性2 min, 然后進(jìn)行循環(huán)(94 ℃變性15 s、55 ℃退火15 s、68 ℃延伸30 s，共45個(gè)循環(huán)), 75 ℃構(gòu)建溶解曲線。采用2-△△Ct法計(jì)算相對(duì)表達(dá)量。

表1 目標(biāo)引物序列

1.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié) 果

2.1 白芍總苷對(duì)細(xì)胞增殖能力的影響

培養(yǎng)0、24 h時(shí), 4組細(xì)胞增殖抑制率比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05); 培養(yǎng)48、72 h時(shí)，細(xì)胞增殖抑制率由高至低排列依次為高劑量組、中劑量組、低劑量組、對(duì)照組，各組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。為進(jìn)一步探討白芍總苷對(duì)細(xì)胞周期的影響，本研究檢測(cè)了周期蛋白CyclinD1的表達(dá)情況，結(jié)果顯示, CyclinD1蛋白表達(dá)量和CyclinD1mRNA相對(duì)表達(dá)量由低至高排列均依次為高劑量組、中劑量組、低劑量組、對(duì)照組，各組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見(jiàn)圖1。

A: 細(xì)胞增殖抑制率; B: CyclinD1蛋白表達(dá)量; C: CyclinD1蛋白的Western Blot結(jié)果; D: CyclinD1mRNA相對(duì)表達(dá)量。與對(duì)照組比較, *P<0.05; 與低劑量組比較, #P<0.05; 與中劑量組比較, △P<0.05。圖1 各組細(xì)胞增殖抑制率、CyclinD1蛋白表達(dá)量及CyclinD1 mRNA相對(duì)表達(dá)量比較

2.2 白芍總苷對(duì)細(xì)胞遷移、侵襲能力的影響

細(xì)胞遷移實(shí)驗(yàn)和侵襲實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，遷移細(xì)胞、侵襲細(xì)胞數(shù)量由低至高排列依次為高劑量組、中劑量組、低劑量組、對(duì)照組，各組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05), 見(jiàn)圖2。

A: 細(xì)胞遷移實(shí)驗(yàn)和侵襲實(shí)驗(yàn)結(jié)果; B: 各組遷移細(xì)胞數(shù)量比較; C: 各組侵襲細(xì)胞數(shù)量比較。與對(duì)照組比較, *P<0.05; 與低劑量組比較, #P<0.05; 與中劑量組比較, △P<0.05。圖2 各組遷移細(xì)胞、侵襲細(xì)胞數(shù)量比較

2.3 各組細(xì)胞外泌體鑒定結(jié)果

電子顯微鏡觀察結(jié)果顯示，外泌體表現(xiàn)出典型的圓盤形態(tài)，見(jiàn)圖3。CD63、CD81蛋白表達(dá)水平由低至高排列均依次為高劑量組、中劑量組、低劑量組、對(duì)照組，各組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05), 見(jiàn)圖4。

圖3 外泌體電鏡掃描結(jié)果(放大倍數(shù)20倍)

A: CD81蛋白表達(dá)量比較; B: CD63蛋白表達(dá)量比較; C: Western Blot結(jié)果。與對(duì)照組比較, *P<0.05; 與低劑量組比較, #P<0.05; 與中劑量組比較, △P<0.05。圖4 各組細(xì)胞外泌體蛋白CD63、CD81表達(dá)

2.4 各組細(xì)胞中Akt、p-Akt、PI3K、p-PI3K蛋白表達(dá)量和Akt、p-Akt、PI3K、p-PI3K mRNA表達(dá)水平

Akt、p-Akt、PI3K、p-PI3K蛋白表達(dá)量和Akt、p-Akt、PI3K、p-PI3KmRNA表達(dá)水平由低至高排列依次為高劑量組、中劑量組、低劑量組、對(duì)照組，各組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見(jiàn)圖5、圖6。

A: Western Blot結(jié)果; B: 各組p-Akt/Akt蛋白表達(dá)量比較; C: 各組p-PI3K/PI3K蛋白表達(dá)量比較。與對(duì)照組比較, *P<0.05; 與低劑量組比較, #P<0.05; 與中劑量組比較, △P<0.05。圖5 各組Akt、p-Akt、PI3K及p-PI3K蛋白表達(dá)水平

A: 各組p-Akt/Akt mRNA相對(duì)表達(dá)量比較; B: 各組p-PI3K/PI3K mRNA相對(duì)表達(dá)量比較。

3 討 論

銀屑病是皮膚科常見(jiàn)病，主要病理改變?yōu)榻琴|(zhì)形成細(xì)胞增殖、侵襲能力增強(qiáng)，凋亡抑制，同時(shí)伴隨炎性細(xì)胞、血管的異常浸潤(rùn)[6]。目前，臨床治療銀屑病的多數(shù)藥物如維A 酸類藥物、甘草酸苷和甲氨蝶呤等均可抑制角質(zhì)形成細(xì)胞增殖[7]。白芍總苷是從白芍中提取的化合物，具有抗炎、抑制腫瘤、調(diào)節(jié)免疫力等功效，對(duì)免疫系統(tǒng)疾病、蕁麻疹及銀屑病等療效顯著[8-9], 但其治療銀屑病的確切機(jī)制目前尚不清楚。

研究[10]發(fā)現(xiàn)，白芍總苷可以抑制角質(zhì)形成細(xì)胞的增殖及血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子的分泌。角質(zhì)形成細(xì)胞在銀屑病進(jìn)展中發(fā)揮重要作用，HaCaT細(xì)胞也稱為表皮角質(zhì)形成細(xì)胞系，其是由角質(zhì)形成細(xì)胞培育而來(lái)，保留了角質(zhì)形成細(xì)胞分化能力的永生細(xì)胞。本研究觀察了白芍總苷對(duì)HaCaT細(xì)胞增殖、遷移及侵襲能力的影響，結(jié)果表明，白芍總苷可抑制HaCaT細(xì)胞的增殖、遷移及侵襲能力，且抑制作用隨著濃度的升高而增強(qiáng)。本研究還檢測(cè)了周期蛋白CyclinD1的表達(dá)水平，結(jié)果顯示，白芍總苷可抑制細(xì)胞CyclinD1蛋白、CyclinD1mRNA表達(dá)水平，且抑制作用隨著濃度的升高而逐漸增強(qiáng)，進(jìn)一步印證了白芍總苷對(duì)HaCaT細(xì)胞增殖的抑制作用。由此推測(cè)，白芍總苷通過(guò)抑制角質(zhì)形成細(xì)胞的增殖、遷移等達(dá)到治療銀屑病的目的。

外泌體是一種杯狀、脂質(zhì)雙層的膜囊泡，也是細(xì)胞間信息交流的載體[11]。外泌體中有微小RNA、蛋白質(zhì)和脂質(zhì)，這些物質(zhì)被轉(zhuǎn)運(yùn)到其他細(xì)胞內(nèi)后發(fā)揮著重要的作用。本研究采用超速離心法分離出HaCaT細(xì)胞外泌體，檢測(cè)其特異性蛋白表達(dá)情況，結(jié)果顯示，白芍總苷可抑制外泌體蛋白CD63、CD81的表達(dá)，且具有劑量依賴性，說(shuō)明白芍總苷能夠抑制HaCaT細(xì)胞外泌體的釋放，從而抑制細(xì)胞惡性生物學(xué)行為。

研究[12]顯示, Akt與P13K形成P13K/Akt信號(hào)通路。Akt通路的激活能夠抑制細(xì)胞凋亡，促進(jìn)細(xì)胞增殖，多種腫瘤的發(fā)生發(fā)展與Akt通路異常有關(guān)[13]。銀屑病發(fā)生發(fā)展過(guò)程中, HaCaT細(xì)胞的增殖和凋亡失衡發(fā)揮重要的作用[14]。CHAMCHEU J C等[15]發(fā)現(xiàn)，在咪奎莫特誘導(dǎo)的鼠淀粉樣皮炎模型中, PI3K/Akt信號(hào)活性是增強(qiáng)的，且抑制PI3K/Akt信號(hào)通路可緩解咪奎莫特誘導(dǎo)的鼠淀粉樣皮損。JEON Y J等[16]報(bào)道，抑制PI3K/Akt信號(hào)通路可以緩解皮膚的炎癥反應(yīng)。王昊等[17]利用免疫組化法檢測(cè)尋常型銀屑病組織中角質(zhì)形成細(xì)胞內(nèi)PI3K、Akt蛋白表達(dá)情況，結(jié)果顯示, PI3K、Akt蛋白在尋常型銀屑病組織中高表達(dá)，與抑制凋亡蛋白Survivin表達(dá)呈正相關(guān)。本研究結(jié)果顯示, 3種劑量白芍總苷組HaCaT細(xì)胞PI3K、Akt蛋白表達(dá)水平均低于對(duì)照組，且隨著白芍總苷濃度的升高，蛋白含量越來(lái)越低，提示白芍總苷通過(guò)PI3K/Akt信號(hào)通路抑制HaCaT細(xì)胞的生物學(xué)行為。

綜上所述，白芍總苷能夠抑制HaCaT細(xì)胞分泌外泌體，并抑制HaCaT細(xì)胞增殖、侵襲及遷移，其作用機(jī)制可能與下調(diào)PI3K/Akt信號(hào)通路有關(guān)，具體的分子機(jī)制有待進(jìn)一步研究。