烷基化修復(fù)蛋白B同源物5調(diào)控果蠅Zeste基因增強子人類同源物2對K562/阿霉素細胞耐藥的影響

陳 莉, 吉慧娟, 任利彬, 張洪峰, 索曉慧, 劉洪峰, 夏利敏

(河北省邯鄲市中心醫(yī)院, 1. 血液內(nèi)一科, 2. 普外科, 3. 科研科, 4. 乳腺外科, 河北 邯鄲, 056001)

白血病是一種侵襲性血液系統(tǒng)惡性腫瘤，其特征是細胞分化停滯和克隆性髓系前體的無限增殖[1]。目前，化療仍是白血病的重要治療方法。然而，伴隨著化療藥物的使用，白血病細胞逐漸產(chǎn)生耐藥性，導(dǎo)致化療失敗[2]。因此，了解白血病的發(fā)病機制對于確定新的有效治療靶點至關(guān)重要。N6-甲基腺苷(m6A)是大多數(shù)真核生物信使RNA(mRNA)中最常見的表觀修飾，越來越多的證據(jù)[3-4]證實m6A修飾可調(diào)節(jié)多種生物學(xué)功能，例如RNA加工、核輸出、翻譯、降解等，而異常的m6A修飾則引起胚胎發(fā)育障礙、腫瘤發(fā)生、穩(wěn)態(tài)失衡等。烷基化修復(fù)蛋白B同源物5(ALKBH5)作為m6A修飾的關(guān)鍵去甲基化酶之一，研究[3]表明ALKBH5以m6A依賴性方式通過酪蛋白激酶2α介導(dǎo)的糖酵解途徑抑制膀胱癌進展并使膀胱癌細胞對順鉑敏感。本研究探討ALKBH5對K562/阿霉素(ADM)細胞耐藥的影響以及其作用機制，現(xiàn)將結(jié)果報告如下。

1 材料與方法

1.1 細胞來源、主要試劑及儀器

人白血病細胞系K562和相應(yīng)的ADM抗性細胞K562/ADM細胞均購自中國科學(xué)院上海細胞庫。pcDNA3.1載體購自武漢淼靈生物科技有限公司; ALKBH5-1干擾序列1(si-ALKBH5-1)、ALKBH5-1干擾序列2(si-ALKBH5-2)及其陰性對照si-NC, pcDNA3.1-ALKBH5-WT、pcDNA3.1-ALKBH5-MUT[5](ALKBH5突變位點為H204A)、pcDNA3.1-EZH2均由華大基因合成; 胎牛血清(FBS)、RPMI-1640培養(yǎng)基、LipofectamineTM2000轉(zhuǎn)染試劑盒均購自美國Bio-Rad公司; CCK-8試劑盒購自武漢默沙克生物科技有限公司; EpiQuik M6A RNA甲基化定量檢測試劑盒(比色法)購自長沙鼎國生物技術(shù)有限公司; RNA免疫共沉淀(RIP)試劑盒、甲基化RNA免疫共沉淀(MeRIP)試劑盒購自廣州伯信生物科技有限公司; BCA試劑盒購自河南天馳生物技術(shù)有限公司; ALKBH5、果蠅Zeste基因增強子人類同源物2(EZH2)、P糖蛋白(P-gp)、多藥耐藥基因1(MDR1)、GAPDH兔多克隆抗體及辣根過氧化物酶(HRP)標(biāo)記的羊抗兔二抗均購自美國Abcam公司; CO2培養(yǎng)箱購自上海知楚儀器有限公司。

1.2 細胞培養(yǎng)與轉(zhuǎn)染

將K562、K562/ADM細胞在含有10% FBS的RPMI-1640 培養(yǎng)基中培養(yǎng)，在培養(yǎng)K562/ADM細胞時還需向培養(yǎng)基中加入1 mg/L ADM以維持細胞的耐藥性，所有細胞均在37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，在實驗前2周采用不含藥物的正常培養(yǎng)基培養(yǎng)。利用LipofectamineTM2000轉(zhuǎn)染試劑盒對K562/ADM細胞進行轉(zhuǎn)染，并分為對照組(未轉(zhuǎn)染的K562/ADM細胞)、si-NC組(轉(zhuǎn)染si-NC)、si-ALKBH5-1組(轉(zhuǎn)染si-ALKBH5-1)、si-ALKBH5-2組(轉(zhuǎn)染si-ALKBH5-2)、空載體組(轉(zhuǎn)染pcDNA3.1)、ALKBH5-WT組(轉(zhuǎn)染pcDNA3.1-ALKBH5-WT, 過表達ALKBH5質(zhì)粒)、ALKBH5-MUT組(轉(zhuǎn)染pcDNA3.1-ALKBH5-MUT, 過表達ALKBH5突變型質(zhì)粒，該突變使其無法發(fā)揮去甲基化酶活性)、si-ALKBH5-2+空載體組(si-ALKBH5-2與pcDNA3.1共轉(zhuǎn)染)、si-ALKBH5-2+pcDNA3.1-EZH2組(si-ALKBH5-2與pcDNA3.1-EZH2共轉(zhuǎn)染)。

1.3 CCK-8法檢測ADM對K562、K562/ADM細胞的半數(shù)抑制濃度(IC50)

取對數(shù)生長期的K562、K562/ADM細胞，調(diào)整細胞濃度為5×103個/孔后接種于96孔板中，置于培養(yǎng)箱中孵育過夜，加入不同濃度的ADM (0～1 000 μmol/L)，每個濃度設(shè)置6個復(fù)孔，在培養(yǎng)箱中繼續(xù)孵育24 h后，向每孔中加入10 μL CCK-8溶液，培養(yǎng)2 h后利用酶標(biāo)儀檢測450 nm處的光密度(OD450 nm), 并計算K562、K562/ADM細胞的IC50。

1.4 m6A含量檢測及CCK-8法檢測細胞活力

嚴(yán)格按照EpiQuik M6A RNA甲基化定量檢測試劑盒(比色法)說明書操作步驟檢測m6A含量。收集各組細胞，調(diào)整細胞濃度為2×105個/孔后接種于96孔板中，每組細胞設(shè)置6個復(fù)孔，在培養(yǎng)箱中孵育24 h后向每孔中加入10 μL CCK-8溶液，孵育2 h后使用酶標(biāo)儀檢測OD450 nm。

1.5 ADM外排測定

根據(jù)ADM自發(fā)熒光強度反映ADM外排程度。調(diào)整各組K562/ADM細胞濃度為1×106個/mL, 加入含有1 mg/L ADM的RPMI-1640培養(yǎng)基在培養(yǎng)箱中培養(yǎng)3 h后，采用PBS洗滌2次，將細胞在37 ℃下培養(yǎng)1 h, 熒光光度計檢測激發(fā)波長為480 nm、發(fā)射波長為570 nm處的熒光強度，并計算相對熒光強度值。

1.6 Western blot檢測蛋白表達

采用RIPA裂解緩沖液提取細胞中的總蛋白質(zhì)，通過BCA試劑盒測定蛋白質(zhì)濃度。將提取的蛋白質(zhì)置于上樣緩沖液中, 95 ℃煮沸10 min, 上樣至每孔(每孔30 μg); 采用10%十二烷基硫酸鈉(SDS)聚丙烯酰胺凝膠電泳(PAGE)分離蛋白質(zhì)，將分離的蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移至聚偏二氟乙烯(PVDF)膜上，將膜在5%脫脂牛奶中封閉1 h, 然后與一抗ALKBH5(1∶2 000)、EZH2(1∶1 000)、P-gp(1∶1 000)、MDR1(1∶2 000)、GAPDH(1∶1 000)在4 ℃下孵育過夜; 采用TBST沖洗3次，再加入HRP標(biāo)記的山羊抗兔IgG二抗(1∶1 000)在室溫下孵育2 h, 通過化學(xué)發(fā)光試劑顯色，以GAPDH為內(nèi)參，使用Image J軟件對目的蛋白條帶進行灰度值分析。

1.7 RIP實驗驗證ALKBH5與EZH2 mRNA的相互作用

使用RIP試劑盒進行RIP分析，將細胞用RIPA裂解緩沖液裂解，細胞裂解物在4 ℃下用抗ALKBH5抗體或IgG抗體(對照)免疫沉淀過夜。純化RNA后，進行RT-PCR和qRT-PCR 以測量ALKBH5或IgG免疫復(fù)合物中EZH2mRNA的水平。

1.8 MeRIP檢測

對于m6A RNA結(jié)合實驗，分離各組細胞的RNA, 并用RNase I處理。通過在冰水混合物上超聲處理10 s使RNA片段化。使用預(yù)先在RIPA緩沖液中與磁性Life Technologies Dynabeads結(jié)合的抗m6A抗體進行免疫沉淀，并與片段化的RNA一起孵育，然后在42 ℃下用20 mg/mL蛋白酶K處理beads 2 h。隨后使用苯酚/氯仿/異戊醇提取RNA, 并使用EZH2的引物，以β-actin為內(nèi)參，對EZH2m6A水平進行qRT-PCR。引物:EZH2正向引物為5′-AAGAAGAAGAAGAGAAGAA-3′, 反向引物為5′-ATAGTAAGTGCCAATGAG-3′;β-actin正向引物為5′-CTCCATCCTGGCCTCGCTGT-3′, 反向引物為5′-GCTGTCACCTTCACCGTTCC-3′。

1.9 統(tǒng)計學(xué)分析

采用SPSS 17.0統(tǒng)計軟件進行數(shù)據(jù)處理，符合正態(tài)分布的計量資料采用均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，多組間的比較使用單向方差分析，進一步的2組間比較行SNK-q檢驗; 2組間比較采用獨立樣本t檢驗; 不符合正態(tài)分布的計量資料采用中位數(shù)(四分位數(shù))[M(P25,P75)]表示，采用非參數(shù)檢驗,P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 K562和K562/ADM細胞的ADM耐藥性

K562細胞的IC50為(18.35±1.69) μmol/L, K562/ADM細胞的IC50為(296.67±4.68) μmol/L, 差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05), K562/ADM細胞對ADM的耐藥性是K562細胞的16.17倍。

2.2 K562、K562/ADM細胞中ALKBH5蛋白及m6A含量比較

與K562細胞比較, K562/ADM細胞中ALKBH5蛋白表達水平升高, m6A含量降低，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01), 見圖1、表1。

圖1 Western blot檢測細胞中ALKBH5蛋白表達

表1 K562、K562/ADM細胞中ALKBH5蛋白及m6A含量比較

2.3 ALKBH5在K562/ADM細胞中發(fā)揮去甲基化酶功能

與對照組、si-NC組比較, si-ALKBH5-1組、si-ALKBH5-2組細胞中ALKBH5蛋白表達水平降低, m6A含量升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05); 與對照組、空載體組比較, ALKBH5-WT組細胞中ALKBH5蛋白表達水平升高, m6A含量降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05); 與對照組、空載體組比較, ALKBH5-MUT組細胞中ALKBH5蛋白表達水平升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05), 而m6A含量無顯著變化。見圖2、表2。

圖2 Western blot檢測各組細胞中ALKBH5蛋白表達

表2 各組細胞中ALKBH5蛋白及m6A含量比較

2.4 沉默ALKBH5對K562/ADM細胞活力及耐藥性的影響

與對照組、si-NC組比較, si-ALKBH5-1組、si-ALKBH5-2組細胞OD450 nm值、P-gp、MDR1蛋白表達水平降低，細胞內(nèi)熒光強度升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05), 見圖3、表3。

圖3 Western blot檢測各組細胞中P-gp、MDR1蛋白表達

表3 沉默ALKBH5對K562/ADM細胞活力及耐藥性的影響

2.5 ALKBH5與EZH2的相互作用

m6A2Target網(wǎng)站(http://m6a2target.canceromics.org/#/perturbation)預(yù)測發(fā)現(xiàn)ALKBH5可調(diào)控EZH2。RIP結(jié)果表明，在K562/ADM細胞中, ALKBH5蛋白能與EZH2mRNA相互作用，見圖4。與對照組、si-NC組比較, si-ALKBH5-1組、si-ALKBH5-2組細胞中EZH2 m6A水平升高, EZH2蛋白表達水平降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05); 與對照組、空載體組比較, ALKBH-WT組細胞中EZH2m6A水平降低, EZH2蛋白表達水平升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05), 見圖5、表4。

圖5 Western blot檢測各組細胞中EZH2蛋白表達

表4 各組細胞中EZH2蛋白、EZH2 m6A表達

2.6 EZH2過表達逆轉(zhuǎn)了沉默ALKBH5對K562/ADM細胞活力及耐藥性的影響

與對照組、si-NC組比較, si-ALKBH5-2組細胞OD450 nm值、EZH2、P-gp、MDR1蛋白表達水平降低，細胞內(nèi)熒光強度升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05); 與si-ALKBH5-2組、si-ALKBH5-2+空載體組比較, si-ALKBH5-2+pcDNA3.1-EZH2組細胞OD450 nm值、EZH2、P-gp、MDR1蛋白表達水平升高，細胞內(nèi)熒光強度降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。見圖6、表5。

圖4 RIP驗證ALKBH5與EZH2 mRNA的相互作用

圖6 Western blot檢測各組細胞中EZH2蛋白表達

表5 EZH2過表達逆轉(zhuǎn)了沉默ALKBH5對K562/ADM細胞活力及耐藥性的影響

3 討 論

表觀遺傳調(diào)控的異常(如DNA甲基化、組蛋白乙酰化和RNA甲基化)在白血病的發(fā)生與發(fā)展中發(fā)揮著重要的作用[6]。作為真核生物中最常見的mRNA甲基化類型, m6A修飾受到越來越多的關(guān)注[7]。m6A甲基化的過程是可逆的，并且受甲基轉(zhuǎn)移酶、去甲基化酶和效應(yīng)蛋白的動態(tài)調(diào)控[8]。ALKBH5是一種核酸加氧酶，是第2種被發(fā)現(xiàn)的m6A去甲基化酶，參與mRNA的加工及降解，在多種生命活動中具有重要的調(diào)控作用[9]。ALKBH5的異常表達與腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)，例如ALKBH5通過增強乳腺導(dǎo)管癌細胞的上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化和血管生成促進乳腺浸潤性導(dǎo)管癌的侵襲和轉(zhuǎn)移[10]; ALKBH5的高表達與肺腺癌的惡性進展密切相關(guān)，沉默ALKBH5的表達具有抑制肺腺癌細胞克隆形成的作用[11]; ALKBH5 通過轉(zhuǎn)錄后調(diào)節(jié)其關(guān)鍵靶標(biāo)轉(zhuǎn)錄相關(guān)酸性卷曲蛋白3(TACC3)在白血病中發(fā)揮腫瘤促進作用[12]; ALKBH5通過降低長鏈非編碼RNA(LncRNA)核富集轉(zhuǎn)錄體1(NEAT1)的甲基化促進胃癌的侵襲和轉(zhuǎn)移[13]。本研究結(jié)果顯示，K562/ADM細胞對ADM的耐藥性顯著高于K562細胞; 與K562細胞比較，K562/ADM細胞中ALKBH5蛋白表達水平顯著升高, m6A含量顯著降低; 沉默ALKBH5可增加K562/ADM細胞中m6A含量，過表達野生型ALKBH5可降低m6A含量，而過表達突變型ALKBH5(H204A)對m6A含量無顯著影響，說明ALKBH5在K562/ADM細胞中發(fā)揮去甲基化酶功能。

白血病細胞對化療藥物產(chǎn)生耐藥性的最經(jīng)典機制就是MDR1基因的激活,MDR1mRNA編碼的P-gp能夠利用水解三磷酸腺苷(ATP)的能量將化療藥物從細胞內(nèi)轉(zhuǎn)運到細胞外，進而降低細胞內(nèi)藥物的濃度而產(chǎn)生耐藥[14]。研究[15]報道，綠原酸在體外可有效逆轉(zhuǎn)K562/ADM細胞多藥耐藥，其分子機制與抑制P-gp表達有關(guān); 穩(wěn)定干擾ENO1表達能有效逆轉(zhuǎn)K562/A02細胞耐藥性，提高其對藥物的敏感性，其機制與MDR1基因表達相關(guān)[16]。本研究結(jié)果顯示，沉默ALKBH5可抑制K562/ADM細胞活力、ADM外排及MDR1、P-gp蛋白表達，提示沉默ALKBH5可增強K562/ADM細胞對藥物的敏感性。

EZH2是多梳抑制復(fù)合物 2 的催化亞基之一[17]。相關(guān)文獻[18]報道,EZH2的高表達與子宮內(nèi)膜癌的不良預(yù)后顯著相關(guān)，沉默EZH2可增強癌細胞對常用化療藥物的敏感性; EZH2蛋白通過促進細胞周期進展及腫瘤增殖能力來誘導(dǎo)非小細胞肺癌對順鉑產(chǎn)生耐藥[19]; 過表達miR-101-3p可通過靶向抑制EZH2表達來降低子宮內(nèi)膜癌細胞株Ishikawa對順鉑的耐藥性[20]。本研究通過m6A2Target網(wǎng)站預(yù)測發(fā)現(xiàn)ALKBH5可調(diào)控EZH2, RIP分析發(fā)現(xiàn)ALKBH5蛋白能與EZH2mRNA相互作用，推測ALKBH5可能以m6A依賴的方式調(diào)控EZH2的表達。為了驗證該假設(shè)，采用MeRIP 及Western blot實驗分析發(fā)現(xiàn)，沉默ALKBH5可上調(diào)K562/ADM細胞中EZH2m6A水平，下調(diào)EZH2蛋白表達水平，過表達野生型ALKBH5可下調(diào)K562/ADM細胞中EZH2m6A水平，上調(diào)EZH2蛋白表達水平，表明沉默ALKBH5通過促進EZH2的甲基化來下調(diào)EZH2的表達。最后，本研究通過EZH2回復(fù)實驗證明了EZH2過表達逆轉(zhuǎn)了沉默ALKBH5對K562/ADM細胞活力及耐藥性的影響。

綜上所述，沉默ALKBH5通過促進EZH2的甲基化來下調(diào)EZH2的表達，進而降低K562/ADM的耐藥性。由于本研究僅簡單分析了ALKBH5調(diào)控EZH2對K562/ADM細胞活力及耐藥性的影響，關(guān)于其具體作用機制及逆轉(zhuǎn)耐藥的機制仍需要從多種受試細胞株、動物實驗以及逆轉(zhuǎn)耐藥評價指標(biāo)等多角度、多方面開展研究。