病毒性毛細(xì)支氣管炎患兒血清白細(xì)胞介素-6、酪氨酸激酶/信號傳導(dǎo)及轉(zhuǎn)錄激活因子信號通路與免疫功能的關(guān)系

王雅寧, 崔立業(yè), 陳翼霖, 賈宏超

(1. 河北省保定市第一中心醫(yī)院東院 檢驗科, 河北 保定, 071000;2. 河北省保定市中心血站 檢驗科, 河北 保定, 071000; 3. 河北省望都縣醫(yī)院 檢驗科, 河北 保定, 071003)

毛細(xì)支氣管炎是臨床常見的以嬰幼兒為發(fā)病高峰的呼吸道感染性疾病，多由病毒感染引起，早期治療不及時可遷延發(fā)展，并與成年哮喘有緊密聯(lián)系[1]。臨床治療以抗病毒、抗感染、營養(yǎng)支持、霧化吸入以及對癥處理為主，目前缺乏更高效的干預(yù)靶點，究其原因為疾病發(fā)生的確切機制仍不十分清楚。既往研究[2-3]提出，機體防御機制不完善、早產(chǎn)、人工喂養(yǎng)、環(huán)境刺激、發(fā)育異常、病毒感染、炎癥反應(yīng)等均可能參與了毛細(xì)支氣管炎的發(fā)生和發(fā)展過程，但是缺乏統(tǒng)一認(rèn)識，還有待進一步探討。近期研究[4-5]發(fā)現(xiàn)，由病毒感染誘發(fā)機體炎癥反應(yīng)紊亂和免疫功能障礙可能在毛細(xì)支氣管炎的發(fā)生以及疾病轉(zhuǎn)歸中扮演重要角色。白細(xì)胞介素(IL)-6作為機體重要的促炎介質(zhì)，在介導(dǎo)瀑布樣炎癥級聯(lián)反應(yīng)中發(fā)揮關(guān)鍵作用[6]。同時，細(xì)胞內(nèi)酪氨酸激酶/信號傳導(dǎo)及轉(zhuǎn)錄激活因子(JAK/STAT)信號通路可能是IL-6發(fā)揮促炎作用的重要“橋梁”[7], 但目前還缺乏此方面的基礎(chǔ)和臨床研究。因此，本研究以收治的病毒性毛細(xì)支氣管炎患兒為研究對象，探討患兒外周血清IL-6和JAK/STAT信號通路分子的表達以及免疫功能變化的臨床意義，為疾病治療新靶點提供理論依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 一般資料

采用隨機法選擇2019年9月—2021年3月入院首次確診為病毒性毛細(xì)支氣管炎的患兒112例為研究對象，其中輕度50例(輕度組)、中度40例(中度組)、重度22例(重度組)。呼吸危重評定量表評分<4分為輕度, 4～8分為中度, >8分為重度[8]。納入標(biāo)準(zhǔn): ① 年齡>1個月者; ② 符合毛細(xì)支氣管炎的診斷標(biāo)準(zhǔn)[8]者，血清病毒抗原和病原學(xué)檢測符合病毒感染的證據(jù)，如呼吸道合胞病毒; ③ 病程<7 d者; ④ 患兒經(jīng)臨床治療均康復(fù)出院。排除標(biāo)準(zhǔn): ① 患兒先天發(fā)育異常、圍產(chǎn)期并發(fā)癥、免疫功能障礙; ② 抽血困難患兒。另外選擇30例健康兒童作為對照組。該研究取得受試者監(jiān)護人的知情同意和醫(yī)學(xué)倫理審批。輕度組男28例，女22例; 年齡5個月～3歲，中位年齡1.8歲; 體質(zhì)量6～14 kg, 平均(10.5±3.6) kg。中度組男22例，女18例; 年齡3個月～4歲，中位年齡1.6歲; 體質(zhì)量4～19 kg, 平均(11.6±3.9) kg。重度組男12例，女10例; 年齡4個月～3.5歲，中位年齡1.5歲; 體質(zhì)量4.6～17.0 kg, 平均(10.7±3.7) kg。對照組男16例，女14例; 年齡5個月～3.5歲，中位年齡1.9歲; 體質(zhì)量6.5～20.0 kg, 平均(12.2±4.2) kg。各組性別、年齡和體質(zhì)量比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05), 具有可比性。

1.2 方法

毛細(xì)支氣管炎患兒入院24 h內(nèi)用藥，治療前抽取外周靜脈血5 mL, 對照組抽取空腹外周靜脈血5 mL, 經(jīng)室溫靜置后以2 000轉(zhuǎn)/min離心10 min, 分別分裝上清液和下層細(xì)胞沉淀，于-80 ℃保存集中送檢。采用酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)檢測血清IL-6, Western blot法檢測外周血單個核細(xì)胞(PBMCs)中磷酸化酪氨酸激酶 (p-JAK)、磷酸化信號轉(zhuǎn)導(dǎo)激活轉(zhuǎn)錄因子 (p-STAT)蛋白相對表達量，免疫透射比濁法檢測血清免疫球蛋白(Ig)A(IgA)、IgG和IgM, 流式細(xì)胞術(shù)檢測CD4+和CD8+百分比。IL-6試劑盒購自美國Sigma公司, IgA、IgG和IgM試劑盒購自美國Beckman Coulter公司，流式細(xì)胞儀購自美國BD公司，根據(jù)說明書步驟進行，同批次試劑間變異以及不同批次間變異度均小于10%。每例樣本均分別獨立檢測3次，結(jié)果取平均值。由副高以上專職人員獨立完成。

PBMCs采用密度梯度離心法進行層析、分離并提純，加入含胎牛血清的RPMI-1640液重懸，調(diào)整細(xì)胞濃度為1×106個/mL; 然后接種于6孔板上，每孔1 mL, 每組設(shè)置3個復(fù)孔; 將細(xì)胞培養(yǎng)板置于37 ℃ 5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)6 h, 結(jié)束后用PBS液洗滌2次，每次10 min; 每孔加入200 μL蛋白裂解液置于冰上孵育，然后12 000轉(zhuǎn)/min離心30 min得到上清液即總蛋白。取10 μL樣品蛋白加入PBS液稀釋至總體積100 μL, 調(diào)整終濃度為0.5 mg/mL; 向酶標(biāo)孔中加入BCA工作液200 μL搖勻靜置30 min; 然后1 h內(nèi)在酶標(biāo)儀上測定吸光度值，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線并計算蛋白濃度。根據(jù)電白電泳程序完成蛋白電泳、帶電轉(zhuǎn)膜、封閉抗體，滴加兔抗人p-JAK和p-STAT一抗4 ℃孵育過夜，洗滌后滴加羊抗兔二抗室溫下孵育1 h; 最后加入顯色液顯影，拍照保存，以目標(biāo)蛋白與內(nèi)參蛋白β-actin電泳條帶的灰度值比值表示目的蛋白的相對表達量，采用Image J軟件自動分析。

1.3 統(tǒng)計學(xué)處理

采用SPSS 20.0統(tǒng)計軟件對數(shù)據(jù)進行處理，符合正態(tài)分布的計量資料采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，多組間比較采用單因素ANOVA分析，兩兩組間比較采用LSD-t法檢驗; 計數(shù)資料的比較采用χ2檢驗;P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 IL-6、p-JAK和p-STAT比較

與對照組比較，輕度組、中度組和重度組IL-6、p-JAK和p-STAT升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05); 重度組IL-6、p-JAK和p-STAT水平高于輕度組、中度組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05); 輕度組和中度組上述指標(biāo)比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05), 見表1。

表1 各組IL-6、p-JAK和p-STAT比較

2.2 IgA、IgG和IgM比較

與對照組比較，輕度組、中度組和重度組的IgA、IgG和IgM水平較低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05); 與輕度組、中度組比較，重度組IgA、IgG和IgM水平降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05); 輕度組、中度組患兒上述指標(biāo)差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05), 見表2。

g/L

2.3 CD4+和CD8+百分比及CD4+/CD8+比較

與對照組比較，輕度組、中度組和重度組CD4+和CD8+百分比降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05); 與輕度組、中度組比較，重度組CD4+和CD8+百分比降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05); 輕度組、中度組CD4+和CD8+百分比比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。各組間CD4+/CD8+比較，差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05), 見表3。

表3 各組CD4+和CD8+百分比及CD4+/CD8+比較

3 討 論

毛細(xì)支氣管炎的主要臨床表現(xiàn)是喘憋和呼吸困難，病理顯示其多累及肺泡和肺泡間質(zhì)，也被稱為喘憋性肺炎[9]。致病菌以呼吸道合胞病毒最常見，臨床治療以解除氣管痙攣為主，治療不及時極易形成重癥肺炎、心力衰竭等嚴(yán)重并發(fā)癥，危及患兒生命[10]。

本研究顯示，輕度組、中度組IL-6、p-JAK和p-STAT表達高于對照組，重度組高于輕度組、中度組，提示IL-6和JAK/STAT信號通路激活可能參與了毛細(xì)支氣管炎的發(fā)生和發(fā)展。但是，本研究不能明確IL-6和JAK/STAT是促進毛細(xì)支氣管炎發(fā)生的前提，還是疾病發(fā)生過程中的一種表現(xiàn)，下一步可以通過復(fù)制毛細(xì)支氣管炎動物模型來分析內(nèi)在作用機制。BERTRAND P等[11]通過提取毛細(xì)支氣管炎患兒的鼻咽抽吸物和支氣管肺泡灌洗液(BALF)檢測發(fā)現(xiàn), BALF中Th2細(xì)胞因子(IL-3、IL-4、IL-10和IL-13)、促炎細(xì)胞因子和趨化因子[IL-1β、IL-6、腫瘤壞死因子-β(TNF-β)和IL-8]水平高于對照組，并且IL-3和IL-12水平升高與反復(fù)喘息的發(fā)生有直接關(guān)系。BELACHEW N等[12]研究也表明，閉塞性細(xì)支氣管炎(BO)患者的肺功能參數(shù)中用力肺活量、第1 秒用力呼氣量、25%肺活量時最大呼氣流速明顯降低，肺清除指數(shù)顯著高于健康對照組，除了總細(xì)胞和中性粒細(xì)胞數(shù)量增加引起的大量氣道炎癥外, IL-6和IL-8水平也顯著升高，上述研究均提示，以ILs為核心的炎癥反應(yīng)在毛細(xì)支氣管炎的發(fā)生中發(fā)揮重要作用。IL-6是十分重要的前沿促炎因子，不僅可以大量招募白細(xì)胞、肥大細(xì)胞、單核巨噬細(xì)胞以及淋巴細(xì)胞向氣道感染處聚集，而且可以進一步刺激炎癥細(xì)胞大量釋放CRP等炎癥介質(zhì)，誘導(dǎo)機體炎癥不斷升級，使疾病早期快速擴散，加快疾病進展[13-15]。

DONG M等[16]研究發(fā)現(xiàn)，在BO中miR-27a-3p的潛在作用靶點有Smad2和sprouty2, 并且可間接激活樹突狀細(xì)胞(DC)中的細(xì)胞外調(diào)節(jié)蛋白激酶(ERK), 增加IL-10的表達，進而通過正反饋環(huán)路即IL-10/JAK/STAT3途徑維持DCs的未成熟狀態(tài)，引起Foxp3+CD4+T細(xì)胞數(shù)量和轉(zhuǎn)化生長因子(TGF)-β水平的增加。ZHU Z Z等[17]進行了一項多中心前瞻性隊列研究，對毛細(xì)支氣管炎患兒進行鼻咽氣道代謝譜分析，證實毛細(xì)支氣管炎是一種高度異質(zhì)性疾病，與5歲時患哮喘風(fēng)險有一定的縱向關(guān)系。

本研究顯示，與對照組比較，輕度組、中度組和重度組CD4+和CD8+百分比降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05); 與輕度組、中度組比較，重度組CD4+和CD8+百分比降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。以上研究結(jié)果提示，毛細(xì)支氣管炎患兒存在明顯的體液和細(xì)胞免疫功能下降。PBMCs富含淋巴細(xì)胞和自然殺傷細(xì)胞，是參與機體免疫應(yīng)答的重要細(xì)胞類型[18-19]。呼吸道病毒入侵并定植于氣道上皮黏膜后，單核-巨噬細(xì)胞系統(tǒng)通過表面識別受體與病毒配體進行特異性結(jié)合，進而啟動以體液和細(xì)胞免疫為主的主動應(yīng)答過程[20-21]。單核-巨噬細(xì)胞表面可大量表達IL-6受體，與細(xì)胞外IL-6配對特異性結(jié)合，進而激活細(xì)胞內(nèi)JAK/STAT信號通路，調(diào)節(jié)免疫細(xì)胞功能[22]。

綜上所述，病毒性毛細(xì)支氣管炎患兒體內(nèi)IL-6高表達和JAK/STAT信號通路激活可能參與了病毒性毛細(xì)支氣管炎的發(fā)生和發(fā)展，并與患兒的體液和細(xì)胞免疫功能紊亂密切相關(guān)，因此可為未來尋找疾病治療新的干預(yù)靶點提供理論參考依據(jù)。