鄭海生, 藍育青, 鐘興武, 周懷勝, 徐家窈

(1. 中山大學中山眼科中心海南眼科醫院/海南省眼科醫院/海南省眼科學重點實驗室 眼科,海南 ?？? 570311; 2. 中山大學附屬孫逸仙紀念醫院 眼科, 廣東 廣州, 510120;3. 廣東省佛山市第二人民醫院 眼科, 廣東 佛山, 528000)

姜黃素是從姜科和天南星科一些植物的根莖中提取的一種二酮類化合物，化學式為C21H20O6, 其具有抗新生血管、抗炎、抗腫瘤、抗氧化等多種療效[1-3]。但姜黃素難溶于水，體內半衰期短，目前姜黃素藥物多以片劑或膠囊等劑型存在，且需要長期、反復用藥，研制姜黃素的新劑型具有重要的臨床意義。納米藥物相對于傳統藥物具有較多優勢[4-7]: 藥物的溶解度增大; 更容易通過血-視網膜屏障; 具有緩釋性、靶向性; 減少副作用等。本研究應用納米技術將姜黃素包載到殼聚糖脫氧膽酸納米微粒中，制作成姜黃素殼聚糖脫氧膽酸納米微粒，希望此納米微粒具有緩慢釋放姜黃素的功能，減少姜黃素的不良反應，長時間維持有效濃度，減少因反復給藥對患者造成的傷害。

姜黃素在防治眼底新生血管性病變中可以發揮其抗新生血管的藥理作用[8]。視網膜色素上皮細胞無論在體內或體外，缺氧均可誘導血管內皮生長因子表達，從而促進眼內血管新生[9]。因此尋找能有效抑制視網膜色素上皮細胞增殖，且毒副作用較小的防治方法尤為重要。本研究觀察姜黃素殼聚糖脫氧膽酸納米微粒對體外培養的人視網膜色素上皮細胞周期的作用，探討其對視網膜色素上皮細胞增殖的影響。

1 材料和方法

1.1 試劑與主要儀器設備

姜黃素(購自SIGMA公司)、胎牛血清(Biological Industries公司)、人視網膜色素上皮細胞(中山眼科中心醫院提供，選第3～6代細胞用于實驗)。光學倒置顯微鏡(德國 Leica MPS-30)、熒光顯微鏡Axioplan2 imaging(德國 Zeiss)。

1.2 實驗方法

1.2.1 姜黃素納米微粒合成: 將20 mg殼聚糖脫氧膽酸放入5 mL 磷酸鹽緩沖液(PBS, pH值6.2)中，不斷攪拌使殼聚糖脫氧膽酸膨脹溶解; 稱量10 mg姜黃素，并用四氫呋喃將其溶解; 將溶解了姜黃素的四氫呋喃溶液緩慢滴加入殼聚糖脫氧膽酸溶液中，接著緩慢滴加蒸餾水，邊攪拌邊升高溫度至40 ℃超過24 h, 以便殘存四氫呋喃揮發; 最后將溶液離心15 min, 下層沉淀為未負載的藥物，上清液即為殼聚糖脫氧膽酸負載的姜黃素納米微粒(此方法已申請國家專利: 201010138 683.9)。

1.2.2 姜黃素納米微粒負載效率與載藥量的測定: 上述液體離心后的下層沉淀為未負載的藥物，將其溶于20.0%乙醇的PBS(pH值6.2)中，采用紫外分光光度法(波長433.0 nm)測定其含量。計算姜黃素納米微粒的負載效率與載藥量的公式: 負載效率=(加入的姜黃素總量-未負載的姜黃素量)/加入的姜黃素總量×100%。載藥量=(加入的姜黃素總量-未負載的姜黃素量)/投入的殼聚糖脫氧膽酸總量×100%, 未負載的姜黃素量為液體離心沉淀干燥后所得。

1.2.3 姜黃素檢測波長的選擇: 稱1.0 mg姜黃素，溶解于100.0 mL 20%乙醇的PBS中，配成10.0 μg/mL的溶液, 20%乙醇的PBS為空白對照，用紫外-可見光分光光度計進行掃描(波長范圍200.0～600.0 nm), 并將數據用Origin7.0分析，從而確定姜黃素的最大吸收波長在433.0 nm(圖1), 所以姜黃素的檢測波長為433.0 nm。

圖1 姜黃素光譜掃描曲線(波峰為433.0 nm)

1.2.4 姜黃素的標準曲線: 準確稱取2.0 mg姜黃素，用20.0%乙醇的PBS溶于100.0 mL容量瓶中，定容后分別量取0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5、4.0、4.5、5.0 mL, 在10.0 mL容量瓶中用上述溶液定容。于433.0 nm波長處測量紫外光吸光度值(空白對照: 含20%乙醇的PBS), 并用Origin7.0分析，得出姜黃素在含20.0%乙醇的PBS(濃度: 1.0～10.0 μg/mL)中的吸光度標準曲線。

1.2.5 姜黃素納米微粒的體外釋放: 考察姜黃素納米微粒在含20.0%乙醇PBS中的釋放特征(動態透析法)。在透析袋中裝入3.8 mL姜黃素納米微粒溶液，將透析袋放于196.2 mL透析介質中(37.0 ℃, 100轉/min), 每間隔一段時間取透析介質溶液1.0 mL, 同時補充1.0 mL介質溶液。采用紫外分光光度法測定藥物的釋放量，藥物釋放率=(藥物釋放量/藥物總量)×100%。

1.2.6 透射電鏡觀察納米微粒形態: 取少量殼聚糖脫氧膽酸納米微粒和姜黃素納米微粒溶液分別滴至銅網支持膜上，用濾紙將多余的液體吸除，待自然干燥后用2%磷鎢酸染色，晾干后在透射電鏡下觀察二者的形態。

1.3 細胞學實驗[10]

1.3.1 CCK-8法檢測殼聚糖脫氧膽酸納米微粒對人視網膜色素上皮細胞增殖的影響: 取處于對數生長期的人視網膜色素上皮細胞，用含10.0%胎牛血清的DMEM-F12培養基制備為細胞懸液(2 500.0個/mL), 在5塊96孔培養板中，每孔加入100.0 μL的細胞懸液進行貼壁培養24 h，直至細胞長為單層后，分別在每塊培養板中加入不同濃度的100.0 μL殼聚糖脫氧膽酸納米微粒溶液(濃度為5.0、10.0、20.0、40.0 μg/mL), 同時設空白對照組(只加培養液)，每組設4個復孔; 再將96孔培養板分別培養24、48 h后，向每孔中加入10.0 μL CCK-8試劑和100.0 μL含胎牛血清的DMEM-F12培養基后，于培養箱內繼續培養3 h; 酶標儀檢測450.0 nm處各孔光密度(OD)值。每組實驗重復3次。同時光學顯微鏡下觀察細胞形態變化。

1.3.2 流式細胞儀測定姜黃素納米微粒和姜黃素原藥對人視網膜色素上皮細胞周期時相的影響: 取對數生長期第3～6代細胞，接種于25.0 mL培養瓶中(密度5.0×105個/mL), 24 h后加含10.0%胎牛血清的DMEM-F12培養基，繼續培養至48 h, 再分別加入姜黃素和姜黃素納米微粒(濃度5.0、10.0、20.0、40.0 μg/mL), 對照組只加培養液, 72 h后收集貼壁細胞進行流式細胞儀分析檢測，完成細胞周期分析。每組實驗重復3次。

2 結 果

2.1 姜黃素納米微粒合成及其負載效率和載藥量的測定

所合成的姜黃素納米微粒溶液為淡黃色，并可見Tyndall現象(圖2)。經紫外-可見光譜法測定所合成的姜黃素納米微粒的負載率為55.0%, 載藥量為27.5%。

A: 合成的淡黃色姜黃素納米微粒溶液; B: 納米微粒溶液的Tyndall現象。

2.2 姜黃素在20.0%乙醇PBS中的標準曲線

用Origin 7.0進行分析，得出在濃度為1.0～10.0 μg/mL的20.0%乙醇PBS中姜黃素的吸光度標準曲線方程如下:Y= 0.007 67+0.032 62×X(X的范圍是1.0～10.0 μg/mL;R=0.994 94)。

2.3 姜黃素納米微粒的體外釋放

姜黃素納米微粒在溶液中的釋放行為見圖3。藥物從納米微粒中的釋放在96 h后可達到平衡，藥物的累積釋放量為31.6%。

圖3 姜黃素納米微粒的體外釋放

2.4 透射電鏡觀察納米微粒形態

透射電鏡下可見未負載姜黃素藥物的殼聚糖脫氧膽酸納米微粒呈類球形或球形，粒徑30～50 nm, 大小較為均一(圖4A); 而負載姜黃素藥物的殼聚糖脫氧膽酸納米微粒的粒徑則明顯增大為70～100 nm (圖4B)。

A: 未負載姜黃素藥物的殼聚糖脫氧膽酸納米微粒，粒徑30.0～50.0 nm; B: 負載姜黃素的殼聚糖脫氧膽酸納米微粒，載藥量27.5%, 粒徑70.0～100.0 nm。

2.5 CCK-8法檢測殼聚糖脫氧膽酸納米微粒對人視網膜色素上皮細胞增殖的影響

不同濃度的殼聚糖脫氧膽酸納米微粒作用于人視網膜色素上皮細胞24、48 h后的OD值與對照組(只加培養液)相比，差異無統計學意義(F=0.381、0.281,P>0.05)。見表1。光鏡下s觀察細胞形態未發生變化，提示單純殼聚糖脫氧膽酸納米微粒對人視網膜色素上皮細胞無毒性，安全性良好。見圖5。

A: 24 h; B: 48 h; C: 殼聚糖脫氧膽酸納米微粒作用于人視網膜色素上皮細胞前細胞形態。圖5 殼聚糖脫氧膽酸納米微粒作用于人視網膜色素上皮細胞后細胞形態(放大倍數100倍)

表1 不同濃度殼聚糖脫氧膽酸納米微粒作用于人視網膜色素上皮細胞24、48 h OD值

2.6 流式細胞儀測定姜黃素及姜黃素納米微粒對人視網膜色素上皮細胞的細胞周期影響

在5.0～40.0 μg/mL濃度范圍內，姜黃素及姜黃素納米微粒作用于人視網膜色素上皮細胞均出現S期細胞百分比下降，而G0～G1期細胞百分比上升，說明人視網膜色素上皮細胞進入細胞增殖期減少。見圖6。

A: 對照; B: 姜黃素納米微粒5.0 μg/mL; C: 姜黃素納米微粒10.0 μg/mL; D: 姜黃素納米微粒20.0 μg/mL; E: 姜黃素納米微粒40.0 μg/mL; F: 姜黃素 5.0 μg/mL; G: 姜黃素 10.0 μg/mL; H: 姜黃素 20.0 μg/mL; I: 姜黃素40.0 μg/mL。圖6 流式細胞儀檢測姜黃素納米微粒及姜黃素對人視網膜色素上皮細胞周期的影響結果

3 討 論

高分子化合物是制備納米控釋系統的主要載體材料，常以天然的大分子體系和合成的可生物降解的聚合物體系為主。本研究中所用的殼聚糖是一種天然高分子聚合物，其具有良好的黏附性、生物相容性及可降解性[11-12]。本研究所合成的姜黃素殼聚糖脫氧膽酸納米微粒選用了殼聚糖脫氧膽酸作為姜黃素的載體，該聚合物在水溶液中可形成納米微粒[13]。本研究通過CCK-8法比較對照組和不同濃度殼聚糖脫氧膽酸納米微粒組的細胞增殖抑制率，結果得出各濃度殼聚糖脫氧膽酸納米微粒組與對照組差異無統計學意義(P>0.05), 同時在倒置顯微鏡下觀察人視網膜色素上皮細胞的形態未發生變化，說明殼聚糖脫氧膽酸納米微粒對人視網膜色素上皮細胞的生長無影響，提示殼聚糖脫氧膽酸對人視網膜色素上皮細胞無毒性，可作為本研究的藥物納米載體。研究[14]發現，包載姜黃素的殼聚糖/聚己內酯納米微粒在人宮頸癌細胞Hela細胞和人脈絡膜黑色素瘤細胞OCM-1細胞中的細胞毒性與游離姜黃素無顯著差異。納米藥物的緩釋機制有[15]: ① 吸附或連接于粒子表面的藥物與納米粒脫離; ② 納米膠束內的藥物不斷向外擴散; ③ 納米膠束本身不斷被降解，藥物不斷從膠束內部被釋放出來。本研究發現，姜黃素納米微粒的載藥量為27.5%, 與LI J J等[16]采用脫絨法制備的姜黃素白蛋白納米顆粒載藥量24.0%較為接近。藥物從納米微粒中的釋放在96 h后可達到平衡，藥物的累積釋放量為31.6%。體外擴散釋放實驗證明，本研究所合成的姜黃素殼聚糖脫氧膽酸納米微粒具有緩慢釋放功能。

目前，姜黃素已被作為一種抗癌新藥[17]。同時已有學者[18-19]對姜黃素的藥物代謝動力學及癌癥治療的生物有效劑量進行了相關研究。姜黃素在眼科的應用研究主要集中于其抗新生血管的作用，可能對糖尿病視網膜病變和角膜堿燒傷等疾病發揮重要的治療作用[8, 20]。龔凌等[21]、SHUKLA S等[22]發現姜黃素可顯著抑制人胚胎視網膜色素上皮細胞增殖。凋亡是抑制細胞增殖的重要原因[22-24], 本研究結果顯示，在5.0～40.0 μg/mL濃度范圍內，姜黃素及姜黃素納米微粒作用于人視網膜色素上皮細胞均出現G0～G1期細胞百分比上升, S期細胞百分比下降，提示人視網膜色素上皮細胞進入細胞增殖期減少，姜黃素可以阻滯人視網膜色素上皮細胞周期于S期，可能是姜黃素抑制細胞增殖的重要原因之一[25], 而姜黃素納米微粒可以提高其阻滯能力。李松霖等[26]將相同濃度的姜黃素納米微粒和姜黃素作用于Lewis肺癌細胞24 h后，姜黃素納米微粒組、姜黃素組和陰性對照組Lewis肺癌細胞的凋亡率分別為67.69%、7.43%和4.94%, 同時發現姜黃素可以阻滯Lewis肺癌細胞周期于S期，與本研究結果一致。但本研究僅研究了殼聚糖脫氧膽酸納米微粒與細胞在不同時間內的相互作用的關系，及姜黃素納米微粒對人視網膜色素上皮細胞周期的影響; 殼聚糖脫氧膽酸及姜黃素納米微粒與人視網膜色素上皮細胞的相互作用關系，及對人視網膜色素上皮細胞的增殖的影響還需開展更深入的研究進行明確。

綜上所述，殼聚糖脫氧膽酸包載的姜黃素納米微粒能持續釋放出姜黃素，具有較好的緩釋功能，載藥材料殼聚糖脫氧膽酸對人視網膜色素上皮細胞的安全性及生物相容性較好。本研究為進一步探討姜黃素納米微粒對人視網膜色素上皮細胞增殖的影響提供了依據。