老年科鮑曼不動桿菌耐藥性及外排泵基因研究

侯盼飛, 余九峰, 周素芹

(南京醫科大學康達學院附屬漣水人民醫院, 1. 檢驗科, 2. 藥劑科, 江蘇 漣水, 223400)

鮑曼不動桿菌是一種需氧、非發酵乳糖的革蘭陰性菌，為條件致病菌，易定植在人的皮膚、呼吸道及醫院環境中[1]。老年科患者因患有基礎疾病、長期服用抗菌藥物、免疫功能低下等問題，是醫院感染的高發人群[2]。近年來，鮑曼不動桿菌的耐藥率呈現上升趨勢，因而探討老年科患者鮑曼不動桿菌的耐藥性及耐藥機制具有重要意義。多種菌株耐藥與外排泵系統過度表達有關。本研究分析老年科臨床分離鮑曼不動桿菌對常用抗菌藥物的敏感性及外排泵基因攜帶情況，以期為醫院感染防控和臨床合理用藥提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

1.1.1 菌株: 臨床菌株為2020年1—12月南京醫科大學康達學院附屬漣水人民醫院老年科分離的鮑曼不動桿菌85株; 質控菌株為大腸埃希菌ATCC25922和銅綠假單胞菌ATCC27853。

1.1.2 材料: 藥敏紙片為OXOID公司生產，培養基購自安圖生物工程股份有限公司，聚合酶鏈反應(PCR)試劑盒購自大連寶生物有限公司。

1.1.3 儀器: Vitek2 compact細菌鑒定儀購自生物梅里埃公司, SLAN-96P熒光定量PCR擴增儀購自上海宏石醫療科技有限公司，凝膠成像儀購自北京六一生物科技有限公司。

1.2 方法

1.2.1 藥物敏感性檢測: 用紙片擴散法檢測85株鮑曼不動桿菌對臨床常用的15種抗菌藥物的敏感性。具體方法及結果解釋標準參照臨床實驗室標準化協會(CLSI)的抗菌藥物敏感性試驗性能標準(2020年版, M100-S30)[3]。

1.2.2 外排泵基因檢測: 采用煮沸法提取基因組DNA。adeB-P1引物序列(5′-3′)為TTCGGTATGGTGCTTGCCAT, P2為TCTTGGCTGCCATTGCCATA, 產物916 bp;adeG-P1引物序列(5′-3′)為TGTTCGGGATGGTACTTGCC, P2為CAGGAACGAAACCACCTGGA, 產物528 bp;adeJ-P1引物序列(5′-3′)為TGGTGTTAGCCGCATGCTTA, P2為CCAATACCCGCGTTTTGACC, 產物291 bp。采用25 μL反應體系。PCR產物經1.2%瓊脂糖凝膠電泳觀察特異性擴增條帶，挑選部分陽性產物進行測序。

1.3 統計學分析

采用SPSS 22.0統計學軟件分析數據，計數資料采用百分率表示，采用卡方檢驗對多重耐藥菌和非多重耐藥菌的基因陽性率進行比較,P<0.05為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1 藥敏試驗結果

藥敏試驗結果顯示，鮑曼不動桿菌對多黏菌素B的敏感率為100.0%, 對米諾環素(29.4%)、頭孢哌酮-舒巴坦(35.3%)、阿米卡星(38.8%)和慶大霉素(41.2%)耐藥率較低，對其他檢測藥物的耐藥率均超過50.0%, 見表1。本研究共檢出多重耐藥菌49株，占57.6%。

2.2 外排泵基因檢測

依據藥敏試驗結果，將85株菌株分為多重耐藥組49株和非多重耐藥組36株。49株多重耐藥菌中,adeB、adeG和adeJ外排泵基因的陽性率分別為73.5%、77.6%和71.4%, 非多重耐藥菌對應基因陽性率分別為41.7%、52.8%和52.8%, 2組間差異有統計學意義(P<0.05), 見表2。將測序結果與GenBank數據中的基因序列比對，同源性為99%。部分代表菌株adeB、adeG、adeJ基因電泳圖見圖1。

M: 標準分子量參照物; 1～3: adeB; 4～6: adeJ; 7: 陰性對照; 8～10: adeG。圖1 adeB、adeG和adeJ基因PCR產物電泳圖

3 討 論

鮑曼不動桿菌是一種重要的醫院感染病原菌，已被發現廣泛分布于重癥監護病房、呼吸科、神經外科等科室，但目前針對老年科鮑曼不動桿菌的相關研究[4]尚較少見。陳亞男等[5]對老年患者呼吸機相關性肺炎合并耐藥菌感染情況進行分析，發現鮑曼不動桿菌的檢出率最高，達51.15%。全國細菌耐藥監測網[6]監測結果顯示，近年來老年患者鮑曼不動桿菌檢出率均居前4位，且該菌對亞胺培南和美羅培南的耐藥率均波動在60%左右。本研究結果顯示，南京醫科大學康達學院附屬漣水人民醫院老年科臨床分離的鮑曼不動桿菌對亞胺培南、美羅培南的耐藥率分別為54.1%和55.3%, 除頭孢哌酮/舒巴坦、阿米卡星、慶大霉素、米諾環素外，鮑曼不動桿菌對其他檢測藥物的耐藥率均高于50.0%, 與全國細菌耐藥監測網監測結果[6-7]基本一致。本研究中，所有鮑曼不動桿菌均對多黏菌素B敏感，但該藥物毒副作用大，故很少被應用于老年科患者中[8]。本研究還發現，鮑曼不動桿菌對阿米卡星、慶大霉素的敏感性也較高，故阿米卡星、慶大霉素可作為替代用藥。

相關研究[9]表明，鮑曼不動桿菌一旦對碳青霉烯類抗生素耐藥，常表現為多重耐藥甚至泛耐藥。已有研究[10-11]證實，外排泵過表達是導致鮑曼不動桿菌耐藥的重要機制，目前在鮑曼不動桿菌中發現的外排泵主要包括AdeABC、AdeIJK和AdeFGH等。本研究依據藥敏試驗結果將85株鮑曼不動桿菌分為多重耐藥組和非多重耐藥組并進行外排泵基因檢測，結果顯示，多重耐藥組菌株的adeB、adeJ、adeG基因陽性率均高于非多重耐藥組，差異有統計學意義(P<0.05)。由此表明, AdeABC、AdeIJK和AdeFGH外排泵均是導致鮑曼不動桿菌多重耐藥的重要原因。但外排泵種類繁多，機制復雜，且多種外排泵之間還可能存在相互作用[12], 未來有待進一步深入研究。

綜上所述，老年科鮑曼不動桿菌耐藥形勢較嚴峻，其多重耐藥與攜帶adeB、adeG和adeJ外排泵基因密切有關。進一步探索外排泵的作用機制，開發有效的外排泵抑制劑，研發新的抗菌藥物劑型，或可為多重耐藥菌的治療提供新的方向。