免疫親和柱-高效液相色譜法測定食品中 玉米赤霉烯酮的含量

王 燕，林明娥

（貴港市公共檢驗(yàn)檢測中心，廣西貴港 537100）

玉米赤霉烯酮（Zearalenone，ZEN）又稱為F-2毒素，主要是由禾谷鐮刀菌、尖孢鐮刀菌、木賊鐮刀菌和雪腐鐮刀菌等產(chǎn)生的有毒代謝產(chǎn)物，主要存在于易受真菌污染的玉米、小麥、高粱和大米等谷物中[1]。目前，檢測玉米赤霉烯酮的方法有高效液相色譜法（High Performance Liquid Chromatography，HPLC）、高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián) 用 法（High Perfomance Liquid Chromatography-Mass Spectrometry，HPLC-MS）、氣相色譜法（Gas Chromatography，GC）、熒光光度法（Fluorescence Spectrophotometry，F(xiàn)S）、薄層層析法（Thin Layer Chromatography，TLC）和免疫學(xué)檢測法等。其中，免疫學(xué)檢測方法方便、實(shí)用，但可能會(huì)出現(xiàn)假陽性，適合于大規(guī)模樣品的快速檢測[2]；高效液相色譜法和高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法具有準(zhǔn)確度高、靈敏性強(qiáng)、可微量測定等優(yōu)點(diǎn)。《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品中玉米赤霉烯酮的測定》（GB 5009.209—2016）第一法液相色譜法，該法通過免疫親和柱凈化后用熒光檢測器檢測，適用于糧食和糧食制品、酒類、醬油、醋、醬及醬制品、大豆、油菜籽和食用植物油中玉米赤霉烯酮的測定，樣品適用范圍廣，靈敏度高[3]。

1 材料與方法

1.1 樣品

樣品為2021年貴港市食品監(jiān)督抽檢樣品及委托檢驗(yàn)樣品。樣品共7份，種類包括面條、面包、玉米粉、面粉、醬油、花生油和葡萄酒等。

1.2 儀器與試劑

1260B高效液相色譜儀配熒光檢測器（美國安捷倫公司）；Simplicity純水系統(tǒng)（Millipore公司）；Quintix2102-1CN電子天平[賽多利斯儀器（北京）系統(tǒng)有限公司]；可調(diào)移液器（芬蘭百得公司）；Proline Prospenser瓶口分液器（芬蘭百得公司）；自動(dòng)渦旋儀（逗點(diǎn)生物有限公司）；超聲波清洗機(jī)（寧波新芝生物科技股份有限公司）；高速離心機(jī)（Sigma Laborzentrifugen GmgH）；固相萃取儀（上海喬躍電子有限公司）；玉米赤霉烯酮免疫親和柱（青島普瑞邦生物工程有限公司）。

玉米赤霉烯酮標(biāo)準(zhǔn)溶液（Pribolab Pte.Ltd.Singapore.）；甲醇、乙腈（色譜純，上海安譜）；試驗(yàn)用水均為超純水（電阻率為18.25 MΩ·cm）。

1.3 方法

1.3.1 樣品前處理

所有樣品經(jīng)粉碎及混勻后，用電子天平稱取 10 g（精確至0.01 g）置于50 mL聚氟乙烯具塞離心管中，加入1 g氯化鈉和20.00 mL乙腈-水（9+1，V/V）提取液，擰緊瓶蓋，于自動(dòng)渦旋儀渦旋5 min，超聲30 min，6 000 r/min離心5 min，取上清液1.00 mL加入4.00 mL水渦旋混合，6 000 r/min離心5 min，取上清液2.50 mL自然重力緩慢過免疫親和柱，用40 mL超純水分次淋洗，棄去全部流出液后，抽取真空至無液體流出，用5 mL甲醇分次進(jìn)行洗脫，50 ℃下氮?dú)獯蹈桑?.00 mL乙腈-甲醇-水（46∶46∶8，V/V/V）復(fù)溶，待漩渦混合均勻后，過0.45 μm有機(jī)相微孔過濾膜，上機(jī)分析。

1.3.2 儀器條件

色 譜 柱：Eclipse plus C18（100 mm×4.6 mm， 3.5 μm）；柱箱溫度：30.0 ℃；柱流量：0.80 mL/min；進(jìn)樣體積：20.00 μL；檢測器：熒光檢測器，激發(fā)波長λ=274 nm，發(fā)射波長λ=440 nm；流動(dòng)相：乙腈-甲醇-水（46∶46∶8，V/V/V）等度洗脫。保留時(shí)間定性，外標(biāo)法定量。

1.3.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線和精密度試驗(yàn)

準(zhǔn)確吸取濃度為100.1 μg/mL的玉米赤霉烯酮標(biāo)準(zhǔn)溶液1.00 mL于100 mL容量瓶中，用乙腈-甲醇-水（46∶46∶8，V/V/V）流動(dòng)相定容至100 mL，搖勻，即得1.001 μg/mL的玉米赤霉烯酮標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液。用流動(dòng)相稀釋配制5.00 ng/mL、10.00 ng/mL、15.00 ng/mL、20.00 ng/mL、30.00 ng/mL和50.00 ng/mL的標(biāo)準(zhǔn)使用系列溶液，以濃度為橫坐標(biāo)，峰面積為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。計(jì)算結(jié)果時(shí)需扣除空白值，檢測結(jié)果以2次測定值的算術(shù)平均值表示。所有樣品按雙平行測定，以重復(fù)性條件下獲得的2次獨(dú)立測定結(jié)果的絕對差值不得超過算術(shù)平均值的15%，考查檢測方法的精密度。試樣中玉米赤霉烯酮含量的計(jì)算公式如下：

式中：X為試樣中玉米赤霉烯酮的含量，μg/kg；m為試樣的質(zhì)量，g；ρ為試樣測定液中玉米赤霉烯酮的濃度，ng/mL；V1為試樣提取液體積，mL；V2為過柱凈化試樣提取液體積，mL；V3為測定液最終定容體積，mL；1 000為單位換算常數(shù)。

1.3.4 添加回收率試驗(yàn)和檢出限

加標(biāo)樣品處理方法為在樣品中分別加入1.00 mL和2.00 mL的1.001 μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液，兩個(gè)濃度水平進(jìn)行水平行加標(biāo)，按照樣品處理方法制備。分別做平行測定，考查測定方法的準(zhǔn)確性。以3倍信噪比，考慮稱樣量及體積計(jì)算實(shí)際檢出限。檢出限計(jì)算公式如下：

式中：LOD為檢出限，μg/kg；ρ為標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度，ng/mL；m為試樣的質(zhì)量，g；f為稀釋倍數(shù)；S/N為儀器測定的信噪比。

2 結(jié)果與分析

2.1 條件優(yōu)化

本試驗(yàn)采用免疫親和前處理技術(shù)提取食品中的玉米赤霉烯酮，與《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品中玉米赤霉烯酮的測定》（GB 5009.209—2016）檢測方法相比，本方法檢測糧食樣品質(zhì)量由40 g降低為10 g，提取容器采用的是50 mL具塞離心管，便于離心分離，采用離心方式進(jìn)行固液分離，而非濾紙過濾分離也縮短了分離時(shí)間，提高了檢測效率，適合大批量樣品同時(shí)進(jìn)行提取。

2.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線及線性關(guān)系

試驗(yàn)結(jié)果顯示，該方法檢測玉米赤霉烯酮保留時(shí)間在5.809 min，在5.00～50.00 ng/mL具有良好的線性關(guān)系，y=0.021 33x+0.002 95，標(biāo)準(zhǔn)曲線的相關(guān)系數(shù)為0.999 91，具體見圖1、圖2。

圖1 標(biāo)準(zhǔn)曲線及線性關(guān)系結(jié)果

圖2 標(biāo)準(zhǔn)品的色譜圖

2.3 檢出限

該方法的實(shí)際檢出限為3.89 μg/kg。標(biāo)準(zhǔn)方法中對糧食和糧食制品中玉米赤霉烯酮的檢出限為 5 μg/kg，定量限為17 μg/kg；酒類中玉米赤霉烯酮的檢出限為20 μg/kg，定量限為66 μg/kg；醬油、醋、醬及醬制品中玉米赤霉烯酮的檢出限為50 μg/kg，定量限為165 μg/kg；大豆、油菜籽、食用植物油中玉米赤霉烯酮的檢出限為10 μg/kg，定量限33 μg/kg。該方法的檢出限均小于標(biāo)準(zhǔn)方法中的檢出限。

2.4 樣品檢測結(jié)果

本次抽檢的7份樣品中，按低于檢出限為未檢出，樣品均未檢出玉米赤霉烯酮。

2.5 加標(biāo)回收率及精密度

在樣品中按100.1 ng/kg及200.2 ng/kg的水平加入玉米赤霉烯酮標(biāo)準(zhǔn)溶液，計(jì)算該方法的回收率，均進(jìn)行平行測定。結(jié)果顯示，該方法的樣品回收率為83.9%～95.9%，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為0.2%～8.7%，表明該方法準(zhǔn)確度高，精密度好。結(jié)果見表1。

表1 樣品檢測結(jié)果及加標(biāo)回收試驗(yàn)結(jié)果

3 結(jié)論

本研究優(yōu)化了各類食品中玉米赤霉烯酮的免疫親和-高效液相色譜檢測方法。該方法標(biāo)準(zhǔn)曲線線性良好，濃度范圍寬，靈敏度高，樣品適用范圍廣，具有較高的精密度和準(zhǔn)確度，檢出限較低，檢測效率高，能同時(shí)處理大批量樣品，對大部分檢測實(shí)驗(yàn)室均適用。隨著檢測技術(shù)的不斷提升，氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用、液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)可實(shí)現(xiàn)多種毒素的同時(shí)檢測，檢測的靈敏度、結(jié)果穩(wěn)定性、重現(xiàn)性進(jìn)一步提高，但檢測儀器價(jià)格昂貴。因此，應(yīng)根據(jù)實(shí)際需求選擇合理的檢測方法[4-5]。