優化頂空固相微萃取-氣相色譜-質譜聯用方法測定蜂蜜揮發性成分的研究

蔡秋萍，陸大鵬

（湛江市食品藥品檢驗所，廣東湛江 524000）

蜂蜜含有特殊的天然芳香氣味，現大多數研究均圍繞蜂蜜的非揮發性成分，如理化性質、生物活性成分等，蜂蜜的重要揮發性成分的鑒定卻鮮少報道。蜂蜜的整體品質是多種性質成分組合的結果，因而有必要對蜂蜜的揮發性成分進行鑒定。

已知報道中，蜂蜜中揮發性成分主要包括烴類、醇類、醛類、酯類、酮類、醚類、苯及其衍生物、呋喃、吡喃和萜烯類等多類物質，這些揮發性物質的含量很低，且對高溫敏感，且之前學者的前處理方法所選參數較多，實驗設計較復雜，使用試劑較多，為簡化實驗，探索更加簡易方便，省時快速的前處理方法，探究合理有效的提取方法提取蜂蜜的揮發性成分很重要[1-7]。本文對頂空固相微萃取法主要條件進行優化，盡可能全面地提取蜂蜜的揮發性成分，并能真實地反映其組成，為后續的研究分析奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

1.1.1 實驗材料

蜂蜜：荔枝蜜，來自廣東佛山順德。

1.1.2 儀器與設備

恒溫水浴振蕩器，SHZ-A，上海躍進醫療器械有限公司；電子天平，Qumintix 224-1CN，賽多利斯科學有限公司；手動固相微萃取裝置，美國Supelco公司；萃取纖維頭：50/30μm DVB/CAR/PDMS（二乙烯基苯/碳分子篩/聚二甲基硅氧烷）、65 μm PDMS/DVB（聚二甲基硅氧烷/二乙烯基苯）、75 μm CAR/PDMS（碳分子篩/聚二甲基硅氧烷）、100 μm PDMS（聚二甲基硅氧烷），美國Supelco公司；凝膠色譜-氣質聯用儀，GDC/GCMS-QP2010，日本島津公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 樣品預處理

蜂蜜從冷藏冰箱取出后放至室溫，搖勻至樣品呈均勻液體狀態，備用。

1.2.2 揮發性成分提取方法

稱取6 g蜂蜜樣品，置于20 mL頂空瓶中密封，頂空瓶置于55 ℃恒溫水浴鍋中，將裝有65 μm PDMS/DVB萃取頭的手動固相微萃取裝置插入頂空瓶中（萃取頭使用前需進行老化），萃取頭不觸碰樣品，55 ℃頂空吸附50 min，250 ℃解吸，進行氣相色譜-質譜聯用（Gas Chromatography-Mass Spectrometry，GC-MS）分析。

1.2.3 單因素實驗條件優化

對1.2.2的揮發性成分提取方法進行單因素實驗條件優化，對萃取頭、萃取溫度、萃取時間、稱樣量進行研究，確定頂空固相微萃取法的前處理參數。

（1）萃取頭的選擇。4個備選萃取頭：50/30 μm DVB/CAR/PDMS、65 μm PDMS/DVB、75 μm CAR/PDMS、100 μm PDMS。準確稱量蜂蜜樣品于頂空瓶中密封，分別用4種萃取頭在水浴中萃取后，進行GC-MS分析。

（2）萃取溫度。稱量蜂蜜樣品于頂空瓶中密封，設置萃取溫度為30 ℃、40 ℃、50 ℃、60 ℃和70 ℃，分別在上述溫度下萃取，進行GC-MS分析。

（3）萃取時間。稱量蜂蜜樣品于頂空瓶中密封，設置萃取時間為10 min、20 min、30 min、40 min、50 min、60 min和70 min，分別按上述時間進行萃取，進行GC-MS分析。

（4）萃取樣品量。設置稱量量為1 g、2 g、4 g、6 g、8 g和12 g，稱取上述重量的蜂蜜樣品于頂空瓶中密封，在50 ℃萃取50 min，進行GC-MS分析。

1.2.4 分析條件

（1）萃取頭的老化。固相微萃取頭在使用前需在氣相色譜的進樣口進行老化，溫度為250 ℃，時間為1 h。

（2）氣相色譜條件。DB-5MS毛細管色譜柱（30 m×250 μm，0.25 μm）；初始溫度40 ℃，保持 1 min，3 ℃/min升到100℃，保持10 min，再以 5 ℃/min升到150 ℃，保持2 min，再以10 ℃/min升至250 ℃，保持5 min。進樣口溫度250 ℃；載氣He，流速1.5 mL/min；不分流進樣。

（3）質譜條件。電離方式：電子轟擊EI；離子源溫度：200 ℃；接口溫度：250 ℃；掃描模式：全掃描；掃描質子范圍：35～500m/z；EI電子能量： 70 eV。各組分經過NIST17.0標準普庫檢索匹配。

2 結果與分析

實驗結果以總峰面積和數量作為指標參數，獲得較佳的頂空固相微萃取條件參數。

2.1 萃取頭的選擇

萃取頭是一根涂有不同色譜固定相或吸附劑的熔融石英纖維，萃取頭是固相微萃取技術的核心，直接影響著固相微萃取的效果。由表1可以看出，盡管4種萃取頭都適用于揮發性成分的萃取，但是各自有不同專攻的應用范圍，在分析香氣成分以及揮發性物質上有著各自的優勢。因此本實驗考察這4種萃取頭在蜂蜜中的應用，選取合適的萃取頭。經GC-MS分析，結果如圖1所示。

表1 4種萃取頭的型號和推薦應用描述

在相同的萃取條件下，不同萃取頭的萃取效果如圖1（a），萃取蜂蜜中的揮發性成分總峰面積最大的萃取頭規格是65 μm PDMS/DVB，萃取總峰面積最小的是50/30 μm DVB/CAR/PDMS規格的萃取頭，理論上萃取頭吸附材料的填充厚度與吸附容量為正相關關系，但實驗結果表明，吸附材料的膜填充量大并不代表萃取的物質的量就多，原因在于蜂蜜的揮發性成分復雜，而萃取頭的固定相具有選擇性。

圖1 4種萃取頭萃取對總峰面積和峰數量的影響圖

結合表1的萃取頭推薦應用描述，可知蜂蜜的揮發性物質中氣體分子和小分子量化合物的比例較小，MW 30～275型萃取頭不足以涵蓋蜂蜜揮發性成分的范圍，更多的物質的量應該在MW 275以上。

僅從總峰面積來評價萃取頭的吸附效果不夠全面，總峰面積能表明萃取頭吸附是否充分，可能情況是對蜂蜜中的揮發性單一成分或者其中的幾種成分有較充分的吸收，但不能體現吸附的揮發性成分的種類是否齊全，所以需要評價峰數量指標。從圖 1（b）中可以看出，萃取蜂蜜揮發性成分峰數量較多的萃取頭規格是65 μm PDMS/DVB，峰數量達到84個，其次是50/30 μm DVB/CAR/PDMS，峰數量達到60個，而75 μm CAR/PDMS和100 μm PDMS吸附的峰數量相對較少，僅為32個和41個。峰數量越多表明吸附的揮發性成分種類越多，吸附的揮發性成分數量與萃取頭的固定相有關。實驗結果表明，萃取頭含有DVB這種固定相材料更有利于提取蜂蜜中的揮發性成分。

結合總峰面積和峰數量綜合評價萃取頭，4種萃取頭規格中適合蜂蜜中揮發性成分分析的為65 μm PDMS/DVB。

2.2 萃取溫度的優化

在本方法中，蜂蜜沒經過復雜的預處理，或是溶劑萃取，因此溫度對萃取效率的影響尤為重要。選擇合適的溫度是確保最佳萃取速度和靈敏度的關鍵。實驗結果如圖2所示。

圖2 萃取溫度對總峰面積和峰數量的影響圖

從圖2（a）的結果顯示，蜂蜜在同等的萃取條件下，隨著溫度的升高，萃取物質的總峰面積整體呈現遞增趨勢，這與隨著溫度的上升有關，分析物熱運動加強，揮發性成分在頂空空間中分配系數變大，而且可能產生新的物質，所以總峰面積總體是遞增的趨勢。而圖2（b）中萃取溫度對峰數量的影響是正向的，在50 ℃時峰數量達94個，50～70 ℃的峰數量基本一致。綜合評價總峰面積和峰數量，需要找到一個合適的溫度既能真實充分體現蜂蜜揮發性物質的種類，有足夠的物質的量進行分析，又盡量不產生新的物質，在50～60 ℃選擇，本實驗考慮使用60 ℃為較好的萃取溫度。

2.3 萃取時間的優化

頂空固相微萃取的萃取過程是一個動力學平衡的過程，選擇合適的時間十分重要。實驗結果如圖3所示。

圖3 萃取時間對總峰面積和峰數量的影響圖

圖3 中是萃取時間對蜂蜜萃取的影響，可以看到隨著時間的延長，蜂蜜萃取的總峰面積和峰數量都呈現著遞增的趨勢，且在40～70 min，總峰面積和峰數量趨于相同，在60 min達到總峰面積最高和峰數量最多。基于在頂空微萃取優化實驗已得到較佳萃取頭、萃取溫度的前提下設計了萃取時間的實驗，為得到較好的萃取效果，在確保萃取效果的情況下，應選擇較短的分析時間，本實驗所選擇的萃取時間為60 min。

2.4 萃取樣品量的優化

在頂空固相微萃取中，頂空空間體積直接影響著頂空吸附的效率，頂空空間體積與樣品取樣量及頂空裝置的比例有關。本次實驗結果如圖4所示。

圖4 稱樣量對總峰面積和峰數量的影響圖

從圖4可以看出，隨著取樣量的遞增，總峰面積和峰數量的變化規律是一致的，均呈現先上升再下降的趨勢。在較少取樣量時（1 g、2 g、4 g），總峰面積和峰數量變化不明顯且均在較低水平，樣品量為6 g和8 g時，總峰面積和峰數量均達到較高水平，之后隨著取樣量遞增（10 g、12 g），萃取效果顯著變差。因此，取樣量8 g時樣品的頂空空間體積與樣品量的比例較合適，本實驗選擇8 g為蜂蜜的取樣量。

3 結論

對頂空固相微萃取-氣相色譜-質譜聯用法的前處理條件進行優化，實驗結果以總峰面積和峰數量為指標進行比較，得到頂空固相微萃取的最佳參數為蜂蜜稱樣量為8 g，使用65 μm PDMS/DVB的萃取頭，在60 ℃下萃取60 min，且本實驗設計簡單、快速、環保，能真實有效地反映蜂蜜中的揮發性成分的含量情況。本研究為蜂蜜揮發性成分的研究提供一定的理論依據。