檢測實驗室參加畜禽產品中獸藥殘留能力驗證 質量控制探索

滕 爽，呂青骎，包月紅，錢 行，王 瑋

（南京農業大學食品科技學院/農業農村部肉及肉制品質量監督檢驗測試中心（南京），江蘇南京 210095）

能力驗證（Proficiency Testing，PT）是利用實驗室間比對，按照預先制定的準則評價參加者的能 力[1-4]。對于食品檢驗機構來說，能力驗證是重要的外部質量評價活動和實驗室質量監控的重要手段，是實驗室認可機構和實驗室用戶評定食品檢測實驗室檢測能力的主要依據之一，也是食品檢測實驗室進行自我評定的重要尺度[5-8]。食品檢驗機構通過參加能力驗證，可以全面檢驗實驗室的各方面工作，提升檢驗人員的檢測能力和質量體系的管理水平，為實驗室提供評價其出具數據可靠性和有效性的客觀證 據[9-14]。檢測實驗室每年制定質量控制計劃，定期參加能力驗證，是保證檢測能力水平的重要手段，也是資質認定和機構考核的必須要求。

隨著國民經濟水平的提高，人們對畜禽產品的需求日益增多，在促進我國畜禽養殖業發展的同時，因用藥不當等因素，獸藥殘留嚴重危害我國畜禽產品的質量安全，并對消費者的身體健康和生命安全造成了嚴重的危害[15-17]。獸藥主要包括抗生素類、驅腸蟲藥類、生長促進劑類、抗原蟲藥類、滅錐蟲藥類、鎮靜劑類和β-腎上腺素能受體阻斷劑等七大類[18]?；前奉悾⊿ulfonamides，SAs）和氟喹諾酮類（Fluoroquinolones，FQs）藥物，作為廣譜抗菌藥，因其具有抗菌譜廣、抗菌能力強、價格低廉等優點，已被廣泛應用于獸醫臨床和畜牧養殖業中[19-22]。飼養過程中濫用抗菌藥物，會在動物體內造成藥物殘留，經食物鏈進入人體后，對人的身體健康造成嚴重危害，并導致許多細菌產生耐藥性[23-27]。我國2019年發布的《食品安全國家標準 食品中獸藥最大殘留限量》（GB 31650—2019）中明確規定在動物性食品中的磺胺類、氟喹諾酮類獸藥最大殘留限量（Maximum Residue Limits，MRLs）[28]。目 前 檢 測 動 物 源 性食品中的氟喹諾酮和磺胺的標準方法主要為液相 色 譜 法（High Performance Liquid Chromatography，HPLC）和液相色譜-串聯質譜法（High Performance Liquid Chromatography-Mass Spectrometry，HPLCMS/MS），而HPLC法是目前常用的比較經濟實用的檢測手段，既可滿足動物性食品中獸藥殘留的準確定性、定量檢測，也由于價格因素配置普遍，更適用于各類基層檢驗檢測實驗室[29-36]。

為提升和強化檢測實驗室對畜禽產品中的獸藥殘留檢測能力，本實驗室連續多年參加農業農村部農產品質量安全監管司組織的畜禽產品中的獸藥殘留能力驗證?？己隧椖堪u肉中的恩諾沙星（Enrofloxacin，ENR）、環丙沙星（Ciprofloxacin，CIP）、沙 拉 沙 星（Sarafloxacin，SAR）和 達 氟 沙 星（Danofloxacin，DAN），豬 肉中 的 磺 胺 二 甲 基 嘧 啶（Sulfamethazine，SM2）、磺胺間甲氧嘧啶（Sulfamonomethoxine，SMM）、磺 胺 甲 噁 唑（Sulfamethoxazole，SMZ）、磺 胺 二甲氧嘧啶（Sulfadimethoxine，SDM）和磺胺喹噁啉（Sulfamethoxazole，SQ）。本文就2020—2021年參加畜禽產品中的獸藥殘留能力驗證過程、結果進行分析，討論檢測過程中質量控制的關鍵點，總結能力驗證過程中把握關鍵點獲得滿意結果的經驗，以期為各級各類農產品檢驗檢測實驗室通過能力驗證和提升檢測質量提供一定的路徑與參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

豬肉（含磺胺類藥物）能力驗證樣品、雞肉（含氟喹諾酮類藥物）能力驗證樣品由中國獸醫藥品監察所提供；磺胺類藥物陰性生鮮豬肉和氟喹諾酮類藥物陰性生鮮雞肉均由農業農村部肉及肉制品質量監督檢驗測試中心（南京）提供。

標準物質：恩諾沙星、環丙沙星、鹽酸沙拉沙星、甲磺酸達氟沙星、磺胺間甲氧嘧啶、磺胺二甲基嘧啶、磺胺甲惡唑、磺胺二甲氧嘧啶和磺胺喹噁啉（德國Dr. Ehrenstofer公司）。

乙腈、甲醇、正己烷（色譜純，美國Fisher公司）；磷酸（H3PO4）、氫氧化鈉（NaOH）、三乙胺（C6H15N）、磷酸二氫鉀（KH2PO4）、冰乙酸（CH3COOH）、正丙醇（C3H7OH）和無水硫酸鈉（Na2SO4）（分析純，國藥集團化學試劑有限公司）；實驗用水均為一級水。

1.2 儀器與設備

2695高效液相色譜儀（配2489紫外檢測器、2475熒光檢測器）、堿性氧化鋁固相萃取柱 （2 g/6 mL，美 國Waters公 司）；XS105電 子 天平（感 量0.01 mg，瑞士Mettler-Toledo公司）；PRACTUM612-1CN電 子 天 平（感 量0.01 g）、advance EDI& pro VF純水儀、D-16C臺式冷凍離心機（德國Sartorious公司）；VORTEX GENIUS3渦旋混勻器、HS 501數顯型混勻器（德國IKA公司）；STAR A221 pH測定儀、Syncronis C18色譜柱（250 mm× 4.6 mm， 5 μm）（美國Thermo公司）；Bond Elut C18固相萃取柱（200 mg/3 mL，美國Agilent公司）。

1.3 實驗方法

根據能力驗證文件規定，各單位可自行選擇現行有效，且有檢測限和（或）定量限以及回收率規定的方法。因此，本實驗室分別采用農業部1025號公告-14-2008《動物性食品中氟喹諾酮類藥物殘留檢測 高效液相色譜法》和農質發〔2014〕5號文附件8《磺胺類藥物在動物可食性組織中殘留的高效液相色譜檢測方法》，進行雞肉中氟喹諾酮類獸藥殘留和豬肉中磺胺類獸藥殘留考核。

1.3.1 氟喹諾酮類藥物殘留檢測前處理

稱取2.00 g樣品（精確到0.01 g）于50 mL離心管中（能力驗證樣品使用領樣的離心管，無需轉移，以免損失和污染），加10.0 mL 0.1 mol/L磷酸鹽緩沖溶液（pH=7），渦旋振蕩1 min，使肉樣完全分散，超聲萃取5 min后，280 r/min中速振蕩20 min， 4 ℃下10 000 r/min離心5 min，取上清液于另一新的 50 mL離心管中。殘渣中加入10.0 mL 0.1 mol/L的磷酸鹽緩沖溶液（pH=7），渦旋1 min，280 r/min中速振蕩10 min，4 ℃下10 000 r/min離心5 min，合并2次上清液，混勻，備用。

取5.00 mL上清液，經過依次用2 mL甲醇、 2 mL磷酸鹽緩沖溶液預洗的Bond Elut C18固相萃取柱；用1 mL一級水淋洗，擠干；再用2.00 mL 0.05 mol/L磷酸溶液∶三乙胺-乙腈（82∶18，v∶v）洗脫，擠干，收集洗脫液；經0.45 μm濾膜過濾后作為試樣溶液。

1.3.2 磺胺類藥物殘留檢測前處理

稱取5.00 g樣品（精確到0.01 g）于50 mL離心管中（能力驗證樣品使用領樣的離心管，無需轉移，以免損失和污染），加入4 g無水硫酸鈉，15 mL乙腈，渦旋1 min，使肉樣完全分散，混勻器上280 r/min振蕩20 min，4 ℃下8 000 r/min速度離心5 min，將上層溶液轉移至另一離心管中，下層殘渣加15 mL乙腈，渦旋混勻1 min，4 ℃下8 000 r/min速度離心 5 min，合并2次上清液于同一離心管中，加入10 mL 正己烷，280 r/min振蕩5 min，4 ℃下8 000 r/min速度離心5 min，取下層液體，加入5 mL正丙醇， 50 ℃旋轉蒸發至近干，加3 mL 95%乙腈溶液，渦旋混合1 min，超聲2 min，作為備用液。

將上述備用液全部經過3 mL 95%乙腈溶液活化的堿性氧化鋁小柱，用5 mL 95%乙腈溶液洗滌雞心瓶后過柱，擠干；用10 mL 70%乙腈溶液洗脫，收集洗脫液；加入5 mL正丙醇，50 ℃旋轉蒸發至干，加入2.00 mL乙腈∶甲醇∶水∶冰醋酸（2.0∶2.0∶9.0∶0.2，v∶v∶v∶v）溶解，渦旋混合1 min，過0.45 μm濾膜后，采用高效液相色譜法（High Performance Liquid Chromatography，HPLC）測定。

1.3.3 標準溶液的配制

（1）氟喹諾酮標準儲備液。精密稱取恩諾沙星、環丙沙星、鹽酸沙拉沙星各50 mg（精確至0.01 mg），甲磺酸達氟沙星10 mg（精確至0.1 mg）于50 mL容量瓶中，用0.03 mol/L NaOH溶液溶解并稀釋定容，分別得到質量濃度為1 mg/mL的恩諾沙星、環丙沙星、沙拉沙星和質量濃度為0.2 mg/mL的達氟沙星的單支標準儲備液。

（2）氟喹諾酮混合標準工作液。準確移取質量濃度為1 mg/mL的恩諾沙星、環丙沙星、沙拉沙星和質量濃度為0.2 mg/mL的達氟沙星的標準儲備液各100 μL于100 mL容量瓶中，乙腈稀釋并定容，配制成質量濃度為1.00 μg/mL的恩諾沙星、環丙沙星、沙拉沙星和質量濃度為0.2 μg/mL的達氟沙星的氟喹諾酮混合標準工作液。

（3）磺胺標準儲備液。精密稱取磺胺二甲基嘧啶、磺胺間甲氧嘧啶、磺胺甲噁唑、磺胺二甲氧嘧啶和磺胺喹噁啉各10 mg（精確至0.01 mg）于10 mL容量瓶中，用甲醇溶解并稀釋定容，分別得到質量濃度為1 mg/mL的5種磺胺單支標準儲備液。

（4）磺胺混合標準工作液。準確移取5種磺胺儲備液100 μL于10 mL容量瓶中，甲醇稀釋并定容，得到質量濃度為10 μg/mL的磺胺混合標準 工作液。

1.3.4 色譜條件方法建立

（1）氟喹諾酮類獸藥殘留的測定。流動相A： 0.05 mol/L磷酸溶液-三乙胺∶乙腈（82∶18，v∶v）；流速：0.8 mL/min；熒光檢測器：激發波長280 nm；發射波長450 nm；進樣量：20 μL；柱溫：30 ℃。

（2）磺胺類獸藥殘留的測定。流動相B：乙腈∶甲醇∶水∶冰醋酸（2.0∶2.0∶9.0∶0.2，v∶v∶v∶v）；流速：1 mL/min；紫外檢測器：檢測波長270 nm；進樣量：20 μL；柱溫：30 ℃。

1.3.5 標準曲線的制定

（1）氟喹諾酮標準曲線。準確量取1.3.3中配制的恩諾沙星、環丙沙星、沙拉沙星和達氟沙星混合標準工作液，用流動相A將恩諾沙星、環丙沙星、沙拉沙星稀釋成質量濃度為5 ng/mL、10 ng/mL、 20 ng/mL、50 ng/mL和100 ng/mL和達氟沙星質量濃 度 為1 ng/mL、2 ng/mL、4 ng/mL、10 ng/mL和 20 ng/mL系列混合標準溶液。

（2）磺胺標準曲線。準確量取1.3.3中配制的適量磺胺混合標準工作液，用流動相B稀釋成質量 濃 度 為0.05 μg/mL、0.10 μg/mL、0.50 μg/mL、 1.00 μg/mL和5.00 μg/mL系列混合標準溶液。

以上溶液現用現配，以峰面積為縱坐標，對應的標準溶液濃度為橫坐標，Empower軟件繪制標準曲線。

1.3.6 精密度和加標回收實驗

（1）精密度。畜禽產品中獸藥殘留能力驗證考核樣品均為平行雙樣，在同等條件下進行樣品處理，每個樣品重復測定3次，計算平均值，并根據平行樣品的檢測結果計算精密度。

（2）加標回收實驗。在空白雞肉中分別添加 40 μg/kg、100 μg/kg共2個水平的氟喹諾酮類獸藥混合標準品，在空白豬肉中分別添加50 μg/kg、100 μg/kg 2個水平的磺胺類獸藥混合標準品，每個濃度設3個平行，以平均回收率（Recovery）評價本批次試驗的準確度，并根據平行樣品的相對標準偏差（Relative Standard Deviation，RSD）評價精密度。

1.3.7 結果計算

根據保留時間定性，外標法定量。試樣中氟喹諾酮類含量按式（1）計算：

式中：X為氟喹諾酮類殘留量，μg/kg；c為經標準曲線計算氟喹諾酮殘留的濃度，ng/mL；m為樣品質量，g。

試樣中磺胺類含量按式（2）計算：

式中：X為磺胺類殘留量，μg/kg；c為經標準曲線計算磺胺殘留的濃度，μg/mL；m為樣品質量，g。

計算結果需扣除空白值，測定結果用平行測定的算術平均值表示。

2 結果與分析

2.1 能力驗證樣品測定

能力驗證樣品經前處理后上機檢測，按照1.3.5繪制標準曲線，氟喹諾酮類獸藥在5～100 ng/mL（其中達氟沙星1～20 ng/mL）、磺胺類獸藥在0.05～5.00 μg/mL，所有獸藥目標物標準曲線相關系數（Correlation Coefficient，R）均達到0.999，能夠準確地進行外標法定量。由表1和表2可知，雞肉能力驗證樣品中分別檢出恩諾沙星（60.0 μg/kg）和環丙沙星（70.0 μg/kg），RSD≤4.040%；豬肉能力驗證樣品中分別檢出磺胺二甲氧嘧啶（110.0 μg/kg）和磺胺喹噁啉（105.0 μg/kg），RSD≤1.540%。

表1 雞肉中氟喹諾酮能力驗證的檢測結果

表2 豬肉中磺胺能力驗證的檢測結果

2.2 加標回收實驗

為驗證能力驗證試驗的準確度和精密度，檢測考核樣時同批次進行2個濃度水平的陽性添加試驗。由表3和表4可知，雞肉中恩諾沙星回收率為85.0%～92.0%，RSD≤2.620%；環丙沙星回收率為84.0%～90.0%，RSD≤1.580%。豬肉中磺胺二甲氧嘧啶回收率為80.4%～92.0%，RSD≤3.810%；磺胺喹噁啉回收率為80.8%～91.8%，RSD≤4.460%。本試驗獸藥殘留檢出的回收率均高于80%，RSD小于7.000%，滿足HPLC法檢測獸藥殘留的準確度和精密度要求，檢測過程中準確度較高。

表3 空白雞肉中四種氟喹諾酮類藥物添加回收率及精密度（n=3）

表4 空白豬肉中五種磺胺類藥物添加回收率及精密度（n=3）

3 討論與結論

3.1 質量控制措施

為確保能力驗證檢測結果的準確性，實驗室在試驗準備、實施過程、結果報送中分別按照以下7個方面進行質量控制。

3.1.1 人員

實驗室人員需經過培訓和考核后方可上崗工作，并通過各類培訓、內部考核、質量監督等方式持續提高和考核其業務能力。實驗室在多年能力驗證的考核中采用骨干引領和以老帶新模式，不斷為實驗室的持續發展培養人才。

3.1.2 儀器與耗材

能力驗證試驗中使用的液相色譜儀、電子天平、移液器等儀器，對于檢測結果有重要影響，必須在檢定校準有效期內，可以正常使用。除常規儀器外，色譜柱作為HPLC法分離的核心，其型號的選擇也十分重要，有助于提高實驗室分析效率。實驗室在本項能力驗證中選用Syncronis C18色譜柱（美國Thermo Fisher公司），其保留時間和峰面積的重現性優異，能滿足HPLC法測定畜禽產品中獸藥殘留的檢測要求。此外，為保證能力驗證中色譜柱的分離選擇性能，實驗室的色譜柱專項專用。

3.1.3 樣品

能力驗證考核樣品應置于低溫、密封條件下保存。若收到樣品無法立即進行檢測時，應將其置于 -20 ℃下儲存。試驗中質量控制需要進行空白對照和陽性添加，實驗室需準備空白樣品作為空白基質。實驗室在能力驗證實驗前應對準備的新鮮雞肉、豬肉空白基質進行儀器確證為陰性，同時還要確保試劑、環境、儀器設備對檢測結果無干擾，以確保能力驗證工作的順利開展。

3.1.4 標準物質

實驗室為確保出具數據的準確性、公正性和權威性，應使用有證標準物質進行分析測定，可以量值溯源到國家基準。實驗室從保存期和穩定性角度考慮，首選固體標準物質，待使用時將其配制成標準儲備溶液，再逐步稀釋成標準工作溶液，以便獲得準確的定量結果。此外，實驗室在計算固體標準物質配制成標準儲備液的質量濃度時，需以折鹽和含量后的藥物單體計算。

3.1.5 方法

實驗室采用的檢測方法應同時滿足適應能力驗證要求和本實驗室實際情況。實驗室在能力驗證中為獲得穩定和準確的定量結果，在HPLC-MS/MS和HPLC方法中，選擇了可避免基質效應的HPLC法。

3.1.6 平行試驗

平行試驗結果是判斷檢測結果準確性的重要依據之一。本能力驗證考核組織單位提供2個平行樣品，每個樣品經前處理后上機測定，需重復測定3次，以獲得該樣品的檢測值，并計算RSD，以考察其精密度是否滿足檢測要求。

3.1.7 加標回收

加標回收檢測結果是判斷同批次其他樣品檢測質量的依據。加標回收試驗一般在空白樣品中進行添加，添加量為定量限（Limit of Quantitation，LOQ）1～5倍質量濃度。實驗室綜合考慮方法LOQ、MRLs和檢測線性范圍，雞肉中氟喹諾酮能力驗證考核選擇2倍LOQ和MRLs進行陽性添加，而豬肉中磺胺能力驗證考核選擇1倍LOQ和MRLs進行陽性添加。陽性添加樣品與考核樣品和空白對照樣品應同時測定，其中空白對照可避免試驗過程中的污染和干擾，而陽性添加可確保本批次試驗的準確度和精密度。

3.2 結論

實驗室參加能力驗證是一項綜合性考核工作，實驗室在多年的能力驗證工作中，通過梳理質量控制的關鍵因素，并在實踐中予以驗證，有效提升了實驗室的質量體系管理水平和檢測質量，為實驗室順利通過能力驗證提供了正確路徑。本實驗室自2015年來參加農業農村部農產品質量安全監管司組織的畜禽產品中的獸藥殘留能力驗證，以人員、儀器與耗材、樣品、標準物質、方法、平行試驗和加標回收檢測7個方面為抓手，在提高實驗室的檢測質量的同時，其能力驗證也均獲得了滿意結果。