山羊KLF16對肌內前體脂肪細胞分化的影響

李 鑫 張 浩 王佳美 王 永 俄木曲者 李艷艷 朱江江 林亞秋*

(1.西南民族大學 青藏高原動物遺傳資源保護與利用教育部/四川省重點實驗室，成都 610041；2.西南民族大學 畜牧獸醫學院，成都 610041；3.四川省畜牧科學研究院 動物遺傳育種重點實驗室，成都 610066)

山羊脂肪組織按沉積部位的不同可以分為皮下脂肪組織(SAT)、肌內脂肪(IMF)和內臟脂肪組織(VAT)等，其中肌內脂肪(IMF)含量影響山羊肉質，主要包括風味和多汁性[1-2]。IMF的沉積是前體脂肪細胞不斷聚脂，分化為成熟脂肪細胞的過程[3]。因此通過探索肌內脂肪細胞分化機制來分析脂肪沉積的調控機理對山羊乃至經濟畜種肉質改良具有重大意義。

已有研究證明，CCAAT/增強子結合蛋白β(C/EBPβ)調控過氧化物酶體增殖物激活受體γ(PPARγ)和CCAAT/增強子結合蛋白α(C/EBPα)，從而激活成脂分化進程[4]，然而脂肪細胞分化是一個復雜生物學進程，同時受諸如類維生素X受體Alpha(RXRα)和Krüppel樣轉錄因子家族(Krüppel-like factors，KLFs)等多種基因和轉錄因子共同調控，它們是脂肪細胞分化進程中不可或缺的重要調控因子[5-8]。其中，KLFs共計18位成員，廣泛分布于哺乳動物細胞內，通過由3個連續的C2H2型鋅指構成的鋅指結構域結合DNA中的GC-rich區，以直接與靶基因結合或與其他輔助調節因子組合成調節復合物的方式，廣泛參與到真核細胞基因轉錄水平的表達調控[9-11]。

研究顯示，KLFs家族成員在脂肪細胞分化過程中扮演重要角色，且對脂肪細胞分化調控作用具有物種特異性，如KLF13促進豬前體脂肪細胞的分化，但對小鼠前脂肪細胞分化無影響[12]；實驗室前期研究發現KLF3和KLF10促進山羊肌內和皮下前體脂肪細胞分化[13-14]，但卻是小鼠脂肪生成的負調控因子[15-16]；以上研究提示KLF家族基因在脂肪細胞分化方面的調控作用具有物種差異性。KLF16自2002年被發現以來[17]，對其研究多集中在胰腺癌細胞轉化[18]、神經細胞生長及突觸形成、內分泌系統穩態[19]、子宮內膜生理和代謝[20]及多巴胺信號的傳導[21]等方面，表明KLF16在多種生物學過程中具有重要調控作用。而KLF16在脂肪方面的研究直至2016年才被報道，即Jang等[22]研究發現干擾KLF16基因表達可以刺激小鼠棕色和白色前體脂肪細胞分化，而過表達KLF16會以濃度依賴性方式降低PPARγ啟動子活性，從而抑制脂肪生成，提示KLF16對脂肪細胞分化具有調控作用，且尚未見除小鼠外其他物種的KLF16基因在脂肪細胞分化方面的作用。此前本實驗室利用高通量測序發現KLF16為山羊肌內脂肪細胞分化前后的差異調控基因，但其具體的調控作用機制尚不清楚，該基因目前僅豬中存在克隆序列[23]，牛和綿羊僅見預測序列，山羊KLF16基因序列與現有研究是否存在差異，是否導致不同的基因功能，需要深入研究。且基于上述KLFs成員對不同物種脂肪細胞分化調控作用的物種特異性，不能僅以小鼠中的報道為參考，需要以體外培養的山羊肌內前體脂肪細胞為研究對象進行功能研究。

因此本研究首先利用RT-PCR技術克隆山羊KLF16基因序列，然后利用熒光定量PCR(Quantitative real-time PCR，qPCR)檢測該基因在山羊不同組織及不同誘導分化階段肌內脂肪細胞中的表達模式，構建其組織及細胞時序表達譜，利用過表達及生物信息學預測等手段明確KLF16基因對山羊肌內前體脂肪細胞分化的影響及可能的作用機制，為最終闡明KLF16對山羊前體脂肪細胞分化的調控機制及經濟畜種的肉質改良提供基礎數據及參考。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1試驗樣品的采集

選擇四川省簡陽市大哥大牧業有限公司種羊場健康的6～8月齡(育成羊)簡州大耳羊公羊作為研究對象(n=4)。晨間屠宰后迅速采集其心、肝、脾、肺、腎、背最長肌、股二頭肌、臂三頭肌、背部皮下脂肪和腹部皮下脂肪組織，用DEPC水清洗除去血漬后立即用錫箔紙包裹好分裝入凍存管中，置入液氮中凍存并帶回實驗室進行后續實驗。原代肌內脂肪細胞由實驗室前期分離保存[24]。

1.1.2主要材料

山羊肌內前體脂肪細胞(本實驗室保存)；Trizol、PMD-19T載體和SYBR?Premix Ex Taq TM(2×)購自TaKaRa；DNA純化試劑盒和2×GC-rich PCR Master Mix購自TIANGEN；TreliefTM5α購自北京擎科生物科技有限公司，胎牛血清、雙抗和胰酶購自Gibco；DEME/F12培養基購自Hyclone；油酸購自Sigma；反轉錄試劑盒購自Thermo Fisher；過表達腺病毒載體HBAD-KLF16-EGFP和對照腺病毒載體HBAD-EGFP的構建及過表達山羊KLF16的重組腺病毒和對照重組腺病毒的包裝均由漢恒生物科技(上海)有限公司完成。

1.2 試驗方法

1.2.1山羊KLF16基因克隆及生物信息學分析

取保存于液氮中的山羊組織樣品約0.2 g，用Trizol法提取組織樣品中的總RNA，經過IMPLEN NanoPhotometer?N60 超微量分光光度計測定RNA樣品質量濃度，A260/280和 A260/230的值均>2.0，取1 μg的total RNA用反轉錄試劑盒將RNA反轉錄為cDNA。根據NCBI上綿羊KLF16基因預測序列(XM_012116067.1)，使用Primer Premier 5.0軟件設計克隆引物(表1)。共25 μL的反應體系(山羊背最長肌cDNA 2 μL、2×GC-rich PCR Master Mix 12.5 μL、上下游引物各1 μL、ddH2O 8.5 μL)按照94 ℃預變性3 min；94 ℃變性30 s，60 ℃退火30 s，72 ℃延伸50 s，共38個循環。用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測并回收產物，用PMD-19T 載體連接并轉化至TreliefTM5α感受態細胞，37 ℃恒溫培養12 h后挑菌，擴大培養的菌液用PCR鑒定，將符合目的條帶大小的樣品送至北京擎科生物技術有限公司成都分公司測序。

表1 克隆和熒光定量PCR引物信息Table 1 Information of primers for cloning and quantitative real-time PCR

表1(續)

對測序獲得的序列進行生物信息學分析，分析內容及對應的工具如表2。

表2 山羊KLF16序列分析內容及相應分析工具Table 2 Sequence analysis content and corresponding analysis tools of goat KLF16

1.2.2山羊KLF16在組織及細胞時序表達分析

選用UXT和GAPDH為內參基因，qPCR檢測KLF16在山羊不同組織和不同分化階段肌內脂肪細胞中的表達水平，引物信息如表1。山羊各組織cDNA由1.2.1獲得。

沿用本實驗室前期的方法將山羊原代肌內脂肪細胞復蘇培養[14]， F3代細胞生長到80%左右時，加入含50 μmol/L油酸的培養基進行誘導分化，分別收集0、1、2、3、4、5和6 d的細胞，用Trizol法提取細胞中的總RNA，取1 μg RNA反轉錄為cDNA，將獲得的cDNA原液5倍稀釋后即獲得細胞時序cDNA。qPCR反應體系為：cDNA模板1 μL，上下游引物各1 μL， SYBR?Premix ExTaqTM (2×)10 μL，用ddH2O補充至20 μL。95 ℃預變性3 min，95 ℃變性10 s，66 ℃退火10 s，72 ℃延伸15 s，共40個循環。

1.2.3山羊KLF16在肌內前體脂肪細中的過表達

將F3代山羊肌內前體脂肪細胞按4×104個/孔接種于12孔板，待融合度達80%后根據腺病毒小體積感染表(漢恒生物科技(上海)有限公司)用3 μL 攜帶目的基因的重組腺病毒(HBAD-KLF16-EGFP)感染細胞24 h(病毒滴度為1.26×1010PFU/mL)，獲得KLF16過表達組(Overexpression, OE)，陰性對照組(Negative control, NC)，用不攜帶目的基因的空載腺病毒(HBAD-EGFP)感染細胞；然后更換為50 μmol/L 油酸的培養基誘導分化2 d，觀察細胞內綠色熒光蛋白(EGFP)的表達情況并收集細胞用于后續實驗，細胞總RNA的提取和cDNA的獲得方法同1.2.1。

1.2.4過表達KLF16對山羊肌內前體脂肪細胞分化的影響

1.2.4.1 油紅O染色觀察脂滴形成情況

用油紅O染色法檢測誘導分化前后山羊肌內脂肪細胞中脂滴的變化，用于染色的細胞接種于24孔板，過表達KLF16兩天后移除培養基，PBS洗滌三遍后用中性甲醛(10%)固定30 min，移除甲醛，重復PBS洗滌，然后加入適量的油紅O染液染色20 min，移除染液后用PBS多次洗滌，在顯微鏡下觀察并拍照。隨后根據油紅O染色提取法，每孔加入1 mL異丙醇溶解脂滴中吸附的油紅O染料，轉移至96孔板中測定490 nm時的吸光度值(OD值)以量化染色結果。

1.2.4.2 分化標志基因及家族其他成員表達變化

用qPCR檢測過表達KLF16后KLFs和分化標志基因的表達情況，反應體系同1.2.3，引物信息同表1。

1.2.5數據處理及分析

用2-ΔΔCt法處理qPCR數據結果，以“平均值±標準差”表示，并用SPSS 18.0檢驗數據顯著性。P<0.05表示存在顯著差異；P<0.01表示存在極顯著差異。KLF家族基因表達量的相關性分析由Excel相關程序完成。

2 結果與分析

2.1 山羊KLF16基因克隆及生物信息學分析

克隆得到山羊KLF16基因序列全長986 bp(圖1(a))，包含756 bp完整的CDS區序列，編碼251個氨基酸，功能結構域預測顯示KLF16具有3個相鄰的C2H2型鋅指結構，分別位于128～150、158～180和188～208位氨基酸(圖1(b))。山羊KLF16蛋白分子量大小為25.597 ku，理論等電點為10.17，無信號肽，不包含跨膜結構域，亞細胞定位顯示其主要定位于細胞核。山羊KLF16蛋白具有29個O-糖基化位點，不含有N-糖基化位點；含有25個絲氨酸(S)磷酸化位點，5個蘇氨酸(T)磷酸化位點和1個酪氨酸(Y)磷酸化位點。蛋白質三維結構預測顯示山羊KLF16具有3個鋅指結構，佐證了功能結構域預測的結果(圖1(c))。蛋白質互作分析顯示KLF16可能與CYP1A1、KLF6、SIN3A、MITD1和IRF2BP1等蛋白質間存在相互作用(圖1(d))。

(a)PCR擴增KLF16基因；(b)KLF16鋅指結構域位點；(c)KLF16蛋白三級結構預測；(d)KLF16相互作用預測(a) Amplication of KLF16 gene by PCR; (b) KLF16 zinc finger domain site; (c) KLF16 protein tertiary structure prediction; (d) KLF16 interaction prediction圖1 山羊KLF16基因克隆及序列分析Fig.1 Clone and sequence analysis of goat KLF16 gene

山羊KLF16氨基酸序列與綿羊高度相似，達到99.47%，與牛也存在較高相似性(圖2(a))。進化樹顯示山羊KLF16與綿羊、牛親緣關系較近(圖2(b))。

圖2 KLF16氨基酸相似性比對(a)與進化樹分析(b)Fig.2 KLF16 amino acid similarity comparison (a) and evolutionary tree analysis (b)

2.2 山羊KLF16基因組織和細胞表達模式

qPCR 結果顯示，KLF16在育成羊各組織中廣泛表達，在腹部皮下脂肪中表達量最高(P<0.01)；同時在肺臟中的表達水平也顯著高于其他組織(P<0.05)(圖3(a))。

KLF16在山羊肌內前體脂肪細胞分化的0～6 d均有表達且存在差異，呈現先劇增后下降的特點。KLF16在1 d的表達量達最高水平，且極顯著高于分化前和其他分化過程(P<0.01)，而在2～6 d內持續低表達(圖3(b))。

同行數據肩標不同大寫字母為差異極顯著(P<0.01)，不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)。Different uppercase letters in the data of the same peer group indicate that the difference is extremely significant (P<0.01), and different lowercase letters indicate that the difference is significant (P<0.05).圖3 山羊KLF16在不同組織(a)和肌內前體脂肪細胞(b)的表達量Fig.3 The expression levels of goat KLF16 in different tissues(a) and intramuscular preadipocytes (b)

2.3 過表達KLF16對山羊肌內前體脂肪細胞分化的影響

2.3.1過表達山羊KLF16對肌內脂肪細胞脂滴積聚的影響

鏡下觀察誘導兩天的細胞綠色熒光蛋白的表達，利用ImageJ軟件計算圖片熒光區域，NC組綠色熒光占圖片46.62%，OE組綠色熒光占圖片46.32%，NC組和OE組熒光表達量相當，說明感染效率基本一致，可以進行后續觀察和分析(圖4(a)和(c))。qPCR檢測KLF16過表達效率，顯示KLF16極顯著(P<0.01)上調達到約1 500倍(圖4(e))，油紅O染色觀察到過表達KLF16后細胞內脂滴生成減少(圖4(b)), 油紅O染色提取法OD值也呈現相同的結果(圖4(d))。

(a)NC組與OE組細胞內熒光表達情況(40×)；(b)油紅O染色觀察細胞內脂滴積聚情況；(c)NC組與OE組熒光相對表達面積；(d)OD值量化油紅O染色結果；(e)NC組與OE組KLF16相對表達量(a) Fluorescence expression in adipocytes of NC group and OE group (40×); (b) Oil red O staining to observe the accumulation of intracellular lipid droplets; (c) Relative fluorescens area of NC group and OE group; (d) OD value quantifies the Oil red O staining results; (e) Relative expression of KLF16 in NC group and OE group**表示P<0.01，*表示P<0.05，下同。** means P<0.01, * means P<0.05. The same below.圖4 過表達KLF16后形態學觀察及效率檢測Fig.4 Morphological observation and efficiency detection after overexpression of KLF16

2.3.2過表達山羊KLF16對肌內脂肪細胞分化標志基因及KLFs的影響

為探究KLF16在山羊肌內脂肪細胞分化中的作用機制，本研究檢測分化標志基因相關基因的表達，發現PPARα、PPARγ、C/EBPα和C/EBPβ均表現為下調，且PPARα和PPARγ表達極顯著水平(P<0.01)(圖5(a))。預測KLF16保守結合域如圖5(b)所示，且與PPARα、PPARγ、C/EBPα和C/EBPβ啟動子區域存在多個結合位點(圖5(c))。

(a)分化標志基因檢測；(b)KLF16 DNA結合域預測；(c)KLF16與基因的啟動子結合關系預測；(d)KLFs表達直方圖；(e)KLFs成員與KLF16的表達相關性分析；(f)KLF16與KLF8啟動子結合位點預測。(a) Detection of differentiation marker genes; (b) Prediction of KLF16 DNA binding motif; (c)Prediction of KLF16 binding sites with genes promoter; (d) Histogram of KLFs expression; (e) The expression correlation analysis of KLFs with KLF16; (f) Prediction of KLF16 binding sites with KLF8 promoter.圖5 山羊KLF16調控肌內前體脂肪細胞分化的作用途徑分析Fig.5 Analysis of the role of goat KLF16 in regulating the differentiation of intramuscular preadipocytes

為探討KLF16是否通過與其他KLF成員之間相互作用來發揮調控作用，qPCR檢測過表達KLF16后KLFs的表達(圖5(d))，發現除KLF2、5、6和10之外其他成員的表達均發生顯著變化，其中KLF7和KLF15表達分別顯著(P<0.05)和極顯著(P<0.01)上調，KLF1、9和14顯著下調(P<0.05)，KLF3、4、8、11～13和17極顯著下調(P<0.01)。采用皮爾遜相關系數(Pearson,r)表征過表達KLF16后KLFs之間的表達關系，顯示家族成員之間存在一定程度的相關表達，且KLF16與KLF1、KLF8和KLF14存在正相關(r>0.7)，與KLF4、KLF5和KLF10存在負相關(r<-0.7)(圖5(e))，預測KLF16與KLF8啟動子存在結合位點(圖5(f))。

3 討 論

3.1 山羊KLF16基因克隆及分子特性

本研究克隆得到山羊KLF16基因序列，分析發現該序列具有KLF家族典型的C2H2鋅指結構域。山羊KLF16的鋅指結構中，前2個鋅指均由23個氨基酸組成，第三個鋅指由21個氨基酸組成，符合KLF家族鋅指保守規律，與現有人和豬方面的報道一致[23,25]。已知C2H2型鋅指結構域可以識別并結合DNA序列[26], 從而調控基因的表達進而發揮作用，推測山羊KLF16可能通過C2H2鋅指結構域發揮調控作用。山羊KLF16第一鋅指前六肽為“AAKSHR”，包含3個堿性氨基酸，主要分布于細胞核，這與Song等[27]報道在KLF16在T淋巴細胞中具有核定位序列相似。山羊KLF16氨基端的AAVDL，屬于保守的A(A/V)XXL基序[23]，該基序可招募轉錄共抑制因子Sin3A抑制靶基因表達[28]。蛋白質互作分析顯示山羊KLF16與KLF6、KLF8、CYP1A1、SIN3A、MITD1和IRF2BP1等可能存在相互作用。其中已證實KLF6、KLF8促進小鼠脂肪細胞分化，KLF6與HDAC3在DLK1啟動子上相互作用抑制DLK1基因表達，從而促進3T3-L1脂肪細胞的分化[29]，還通過干擾PPARα的表達從而達到的促進分化的作用[30]；而KLF8則是通過增強PPARγ2和C/EBPα啟動子活性促脂肪細胞分化[31-32]。細胞色素CYP1A1通過促進肝臟脂肪酸ω氧化過程，從而調節脂質代謝[33-34]。IRF2BP2是脂質穩態的新型調節器，且在KLF2轉錄激活過程中必需IRF2BP2的參與[35]，同時KLF2已被證實是山羊肌內脂肪細胞分化的負調控因子[24]。系統進化樹分析發現山羊KLF16氨基酸序列與綿羊的相似性更高，其次為牛，符合物種進化規律。

3.2 山羊KLF16的表達特性

明確基因表達特性是闡明基因功能的基礎。NCBI上收錄的小鼠組織表達數據(Gene ID: 118445)顯示KLF16在成年小鼠子宮、腎上腺、脾表達量相對較高，在生殖系統脂肪墊和皮下脂肪中也存在較高表達；此外，豬(Gene ID: 100302638)KLF16在子宮中表達水平最高，其次為脾、肺、心臟和皮下脂肪等組織。本研究發現KLF16在山羊各組織中廣泛表達，尤以腹部皮下脂肪中高表達，其次為肺臟。與上述結果存在差異，可能是物種差異造成的。本研究發現KLF16在山羊腹部皮下脂肪組織中的高表達，提示其可能對脂肪沉積存在影響。本研究發現KLF16在山羊肌內脂肪細胞分化0～6 d均存在表達，但表達趨勢與Jang等[22]研究結果存在差異，Jang等研究表明KLF16在小鼠棕色脂肪細胞和3T3-L1前脂肪細胞分化0 d的表達量最高，隨后逐漸降低。這種差異可能是由于物種特異性和不同取材部位兩方面的影響，Jang實驗中的小鼠前體脂肪細胞取材于皮下，而本研究中山羊前體脂肪細胞來源于背最長肌，肌內脂肪與肌纖維面積和直徑等表型具有正相關，對前脂肪細胞分化過程可能也有影響[36]。

3.3 山羊KLF16在脂肪細胞分化中的作用

在明確山羊KLF16組織及肌內脂肪細胞分化表達模式的基礎上，本研究利用HBAD-KLF16-EGFP重組病毒感染體外培養的山羊肌內前體脂肪細胞，使其過表達，結果發現與對照組相比，過表達后細胞內脂滴積聚減少，這與Jang等[22]的研究結果相似，Jang等研究表明KLF16是小鼠脂肪生成中的負調控因子。為了確定過表達山羊KLF16減少肌內脂肪細胞脂滴積聚的可能機制，本研究檢測了脂肪細胞分化標志基因PPARγ、PPARα、C/EBPα 和C/EBPβ的表達變化，結果發現PPARγ、PPARα和C/EBPβ均存在顯著下調，推測可能通過調控這些基因的表達來發揮作用。且通過ALGGEN PROMO程序預測，山羊KLF16在PPARα、PPARγ和C/EBPα啟動子區存在多個結合位點。Sun等[37]指出過表達KLF16通過直接結合PPARα的啟動子來加速小鼠脂肪酸氧化并減弱線粒體應激和氧化應激，從而減少脂質沉積，與本實驗結果相似。現有研究證實PPARs與C/EBPs做為典型的脂肪組織特異性轉錄因子，具有協同作用[38-39]，因此推測KLF16可能通過直接結合PPARα，影響PPARs與C/EBPs之間的協同作用從而抑制山羊肌內脂肪細胞分化，但KLF16是否直接作用于PPARγ和C/EBPα仍需進一步研究探明。研究指出KLF家族成員之間的表達存在相互影響[40-44]，因此本研究檢測了過表達KLF16后KLFs的表達情況，其中KLF7和KLF15表達上調，KLF1、3、4、9、8、11～14、17下調。分析KLFs之間表達相關性顯示KLF16與KLF1和KLF8的相關系數達到0.9以上，存在較強正相關，與山羊KLF16可能與KLF8具有相互作用的預測結果相對應，分析發現KLF8啟動子區存在KLF16結合位點，并且本實驗室前期研究表明干擾KLF8抑制山羊肌內脂肪細胞成脂分化，KLF16表達水平上調，基于上述推測山羊KLF16通過拮抗KLF8 抑制PPARα、PPARγ和C/EBPβ的表達來抑制肌內脂肪細胞分化。

后續研究將致力于探究KLF16在山羊不同部位脂肪沉積中的作用，并通過mRNA和蛋白水平的研究全面闡述其調控脂肪沉積的分子機理。

4 結 論

本研究成功克隆獲得具有典型三鋅指結構的山羊KLF16基因序列，主要定位于細胞核，屬于不穩定堿性親水蛋白質；過表達山羊KLF16減少了脂滴積聚，且可能通過拮抗KLF8下調脂肪細胞分化標志基因PPARγ、PPARα和C/EBPβ的表達水平抑制肌內前體脂肪細胞分化；本研究為揭示山羊KLF16調控肌內前體脂肪細胞分化機制提供基礎，并為完善山羊KLFs脂肪細胞分化調控網絡構建提供數據支撐。