外源乙烯利對禾谷炭疽菌生物學特性的影響及轉BtACO基因植物的抗病性評價

楊利艷 郭曉娣 張玉榮 邊 璐 劉金香

(1.山西師范大學 生命科學學院，太原 030031；2.西南大學 柑桔研究所，重慶 400712)

玉米是世界糧食產量最高的作物，隨著我國米種植面積的增長，玉米已成為第一大糧食作物[1]。禾谷炭疽菌(Colletotrichumgraminicola) 屬于半知菌亞門，是炭疽菌屬重要的病原菌，其所引起的炭疽病是玉米最常見的病害之一[2]。禾谷炭疽菌不僅侵染玉米，同時也會侵染其他作物，是危害世界農業生產的重要病害[3]。提高作物對禾谷炭疽菌的抗性對保障作物產量和品質意義重大。大芻草Balsas teosinte (Zeamaysssp.parviglumis) 為禾本科、玉蜀黍屬一年生草本植物，是現代栽培玉米最直接的野生近緣種[4]，原產于中美洲和墨西哥一帶[5]。在以產量為主要目標性狀的長期馴化過程中，玉米品種丟失了很多優良性狀，大芻草與玉米相比，具有更強的抗病蟲害特性[6-7]。

乙烯是一種植物激素，在植物抵御病害侵染中發揮重要作用[8]。1-氨基環丙烷-1-羧酸氧化酶(1-aminocyclopropane-1-carboxylate oxidase, ACO)是乙烯生物合成途徑中的關鍵酶之一，催化1-氨基環丙烷-1-羧酸(1-aminocyclopropane-1-carboxylic acid, ACC)到乙烯的生物合成[9]。在轉ACO基因的植株中，ACO酶活性以及乙烯釋放速率均提高[10-11]。當植物在受到灰霉菌侵染時，乙烯釋放量增加[12]。對擬南芥乙烯信號路徑缺失突變體(ein2-1、ein4-1、ein6-1、esa1-1和pad1-1)接種黃萎病菌后，發現突變體感病性增強[13]。在水稻中發現乙烯可以促進植物抗毒素的積累以及活性氧的生成，增強水稻對稻瘟病的抗性[14]。以上研究表明，乙烯參與了植物對病害的防御響應。

系統的構建起源于四個方面的需求。1、資源管理的需要。讀者利用資源的同時產生了大量的行為數據，這些行為數據的價值在不斷遞增且有些已經與資源本身的價值等同；2、資源保障的需要。學校乃至教育部對文獻資源有學科保障的要求，同時，保障率的分析需要對比整個行業、同類型學校，以及運用類似ESI指標對標全球，即實現行業保障與區域保障；3、績效評估的需要。圖書館文獻資源的績效評價離不開對其用戶行為數據的分析，其中存在著引文的學術規范的問題；4、服務整合的需要。新的服務需要按學科重新整合資源，構建基于云的服務體系。

本課題組前期從大芻草中克隆了乙烯合成途徑的關鍵酶基因BtACO，并獲得了轉BtACO基因擬南芥。目前乙烯及ACO基因對禾谷炭疽菌致病性的研究鮮有報道。因此，為明確乙烯對禾谷炭疽菌致病性的影響并評價轉BtACO基因擬南芥對禾谷炭疽菌的抗性，本研究以禾谷炭疽菌為研究對象，分析和比較不同濃度外源乙烯利對禾谷炭疽菌生長狀況的影響，并通過對噴施不同濃度乙烯利處理的擬南芥接種禾谷炭疽菌，調查禾谷炭疽菌的致病性，并對轉BtACO基因擬南芥的抗病性進行評價，以期為減輕作物炭疽病提供新的思路。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

供試菌株為禾谷炭疽菌 (C.graminicola)，由吉林大學張世宏老師惠贈。

供試植物材料有：野生型哥倫比亞型擬南芥種子(Arabidopsisthaliana，Columbia-0)為本實驗室保存；轉BtACO基因擬南芥植株為T3代純合體。BtACO基因從大芻草Balsas teosinte中克隆獲得，該基因是在對大芻草響應粘蟲取食轉錄組[15]分析基礎上篩選，取大芻草葉片進行3′RACE獲得該基因的CDS序列，其長度為1 071 bp,提交GenBank獲得Accession Number: MK600519。構建植物表達載體并采用農桿菌介導法轉化野生型擬南芥，在含有潮霉素的MS培養基上進行篩選獲得陽性植株，連續自交，獲得T3代純合體。

馬鈴薯葡萄糖瓊脂(potato dextrose agar，PDA)培養基成分為馬鈴薯200 g、葡萄糖20 g、瓊脂粉18 g，用去離子水定容至1 000 mL[16]。羧甲基纖維素鈉(Carboxymethylcellulose sodium，CMC)培養基成分為羧甲基纖維素鈉15 g，磷酸二氫鉀1.0 g，硝酸銨1.0 g，七水硫酸鎂0.5 g，酵母浸膏粉1.0 g，用去離子水定容至1 000 mL[17]。

乙烯利(Ethephon)購自北京索萊寶科技有限公司；氨芐青霉素(Ampicillin sodium salt)購自合肥博美生物科技有限責任公司。

1.2 禾谷炭疽菌孢子懸浮液制備

活體植株接菌觀察及生物量測定：將濃度為1×105個/mL 孢子懸液5 mL均勻噴灑于生長 30 d 的轉BtACO基因擬南芥和野生型植株蓮座葉，黑暗條件下培養24 h后，移入光暗周期16 h/8 h(光照/黑暗)，溫度22 ℃/18 ℃(光照/黑暗)培養4 d，每組處理3個重復，期間記錄植株發病情況。20 d后測定鮮重。將清洗干凈的植株在105 ℃下烘30分鐘，65 ℃下烘干至恒重，記錄干重。

對不同濃度乙烯利處理組孢子產生情況觀察表明，在含有50～75 mg/L乙烯利的CMC培養基中，禾谷炭疽菌的產孢量明顯低于對照組；125～200 mg/L 乙烯利處理組孢子的產量明顯高于對照組(圖1(b)，表1)，即高濃度乙烯利促進了禾谷炭疽菌孢子的產生。

1.3 禾谷炭疽菌黑色素及孢子的觀察

分別在100 mL CMC液體培養基中加入乙烯利(濃度100 mg/mL)10、25、50、75、100、125、150、175和200 uL，使乙烯利濃度為10、25、50、75、100、125、150、175和200 mg/L，以不加乙烯利為對照，每組處理設置3個生物學重復。在每個CMC培養基中加5 mL孢子懸液(濃度：1×105個/mL)，置于28 ℃，180 r/min，培養20 d，期間觀察孢子生長變化。

分別在100 mL PDA培養基中加入乙烯利(濃度100 mg/mL) 10、25、50、75、100、125、150、175和200 uL，使乙烯利濃度分別為10、25、50、75、100、125、150、175和200 mg/L，以不加乙烯利為對照，每組處理設置3個生物學重復。活化禾谷炭疽菌，在28 ℃ PDA培養基上暗培養7～10 d，用打孔器打取菌餅并置于附加不同量乙烯利的培養基中間，將接種后的培養基置于28 ℃，暗培養7 d，記錄禾谷炭疽菌黑色素生長情況。

1.4 不同濃度乙烯利處理擬南芥接菌觀察

參照張鍇等[18]方法，用無菌水將乙烯利分別稀釋到10、25、50、75、100、125、150、175和200 mg/L，在培養30 d的野生型擬南芥葉片表面噴灑5 mL以上不同濃度乙烯利溶液，以噴等體積無菌水為對照。將處理后的擬南芥置于光照條件下培養12 h后，暗培養12 h，之后進行接菌處理。將濃度為1×105個/mL 孢子懸液5 mL均勻噴灑于野生型擬南芥葉片表面，避光培養24 h 后，移入光照培養箱培養7 d，光暗周期16 h/8 h(光照/黑暗)，溫度22 ℃/18 ℃(光照/黑暗)，每組處理設置3個生物學重復。每天觀察植株發病情況，統計發病株數與發病程度，計算植株病情指數。

病情分級標準為[19]：0級，無癥狀；1級，接種部位失綠；3級，接種部位周圍有過敏性壞死反應；5級，葉片腐爛面積50%；7級，葉片腐爛面積50%～75%；9級，葉片全部腐爛。

離體葉片接菌觀察：在生長狀況基本一致、生長30 d的轉BtACO基因擬南芥和野生型植株上分別選7片蓮座葉進行接菌。將孢子懸液(1×105個/mL)以每滴10 μL點接，每葉點接2次，置于鋪有濕潤濾紙的培養皿中，在黑暗條件下保濕培養24 h后，在光暗周期16 h/8 h(光照/黑暗)，溫度22 ℃/18 ℃(光照/黑暗)培養4 d，期間保持濾紙濕潤，每天記錄離體葉片病斑擴展情況。

實驗數據均為平均值±SD，差異顯著性分析采SPSS 17.0，One-Way ANOVA。

1.5 轉BtACO基因擬南芥和野生型植株抗病性比較

病情指數=∑(病級×各級發病葉數)/(最高發病級數×調查葉數)×100。

在PDA培養基中活化禾谷炭疽菌，附加抗生素氨芐青霉素，28 ℃黑暗培養7～10 d，待菌絲長滿平板后用打孔器打取菌餅，放置于PDA固體培養基上，光照條件下28 ℃培養3～6 d，至菌絲布滿整個平板，用打孔器打菌餅。在50 mL無菌離心管加入20 mL無菌水，每個離心管中加30個菌餅，震蕩搖勻，用三層無菌紗布過濾至50 mL無菌三角瓶內(分離除去菌絲體)，濾液即為孢子懸液，使用血球計數板在顯微鏡下進行計數(孢子濃度為2.6×105個/mL)，在孢子懸液中加入無菌水稀釋到1×105個/mL，備用。

1.6 數據處理

1）交叉模式：如果發射器連接交點，則發生交點模式.發射機將計算所有連接路段的權重，并選擇最小權重來傳輸數據包.考慮計算的距離和連通概率，考慮到多層結構的影響，用RAR中的3-D歐幾里德距離來定義距離.

證監會認定，龍薇傳媒在本次收購前一個月成立，期間未進行資金的充分籌備，在境內可支付資金有限、金融機構擬融入資金缺乏充分準備的情況下，采取高杠桿收購方式，簽訂股權轉讓協議。在履行能力、履行結果不確切，收購行為真實性、準確性不能保證的情況下，貿然公布收購信息。其行為因其名人效應等因素疊加，嚴重誤導市場及投資者，引發市場和媒體的高度關注，致使萬家文化股價大幅波動，嚴重擾亂了正常的市場秩序。

2 結果與分析

2.1 外源乙烯利影響禾谷炭疽菌黑色素及孢子的產生

為明確乙烯對禾谷炭疽菌生長的影響，對不同濃度乙烯利處理組黑色素和孢子產生情況進行觀察，結果分別見圖1和表1?？芍涸诤械蜐舛纫蚁├?10～100 mg/L)的PDA培養基上，禾谷炭疽菌菌株黑色素的產量均高于對照組。之后隨著乙烯利濃度的升高(125～200 mg/L)，黑色素產量下降，均低于對照組((圖1(a)，表1)，但外源乙烯利對禾谷炭疽菌菌絲生長速度無明顯影響(表1)。上述結果表明，外源乙烯利會影響禾谷炭疽菌黑色素的產生，低濃度乙烯利起促進作用，高濃度乙烯利則抑制黑色素的產生。

A～J，乙烯利質量濃度分別為0，10，25，50，75，100，125，150，175和200 mg/L。下同。A-J: Ethephon concentrations are 0, 10, 25, 50, 75, 100, 125, 150, 175 and 200 mg/L, respectively. The same below.圖1 乙烯利對禾谷炭疽菌黑色素(a)和孢子生長(b)的影響Fig.1 Effects of ethephon on melanin (a) and spore production (b) of C.gloeosporioides

東晉初年，李充受命在《晉中經簿》基礎上，校對所有藏之書與整理舊籍，編撰成《晉元帝四部書目》。李充對書目分類進行調整，以經書為甲部，史記為乙部，諸子為丙部，詩賦等為丁部，正式確立了四部排列的順序，是歷代沿用的經、史、子、集四部分類體系的雛形。

表1 不同濃度乙烯利處理組菌絲生長狀況Table 1 Mycelial growth profile under various concentrations ethephon treatments

2.2 不同濃度乙烯利影響禾谷炭疽菌的致病性

為明確不同濃度乙烯利對禾谷炭疽菌致病性的影響，對活體接菌的野生型擬南芥進行了觀察。對照組葉片出現部分黃化，病級多集中在3、5級，病情指數為7.9。當乙烯利濃度為10～75 mg/L時，少數葉片出現黃化現象，病級多集中在0、1、3級，病情指數顯著低于對照組及其它高濃度乙烯利處理組(P<0.05)；當乙烯利濃度為100～125 mg/L時，葉片發病程度較為嚴重，病級多為7、9級，少數為1、3級，病情指數顯著高于對照組(P<0.05)；當乙烯利濃度為150～200 mg/L時，葉片發病程度最重，病級多為7、9級，少數為3、5級，病情指數顯著高于對照組(P<0.05)(圖2)。以上結果表明，低濃度(10～75 mg/L)乙烯利可降低禾谷炭疽菌的致病性，高濃度(125～200 mg/L)乙烯利增強禾谷炭疽菌的致病性。

方玫在上海呆了快一年了，她還沒去哪兒玩過，所以很激動。徐東就笑她，然后很自然地接過她手里的包。方玫的臉紅了一下，沒有拒絕。

2)從花崗巖中實測球面波粒子速度波形的時域和頻域分析結果可知，在測點半徑約為30 mm(比距離約為60 m·kt-1/3)處，粒子速度峰值的衰減規律出現由慢變快的轉折；

不同小寫字母表示處理間差異顯著(P<0.05)。下同。Different small letters indicate significantly different at 0.05 level among different treatments. The same below.圖2 不同濃度乙烯利對禾谷炭疽菌致病性的影響Fig.2 Pathogenicity of C.graminicola with different concentrations of ethephon

2.3 轉BtACO基因擬南芥提高了對禾谷炭疽菌的抗性

為評價BtACO基因對禾谷炭疽菌的抗性，首先，對轉BtACO基因擬南芥和野生型植株進行離體葉片接菌，4 d后對葉片發病情況進行了觀察。轉BtACO基因擬南芥葉片沒有形成明顯的炭疽斑，黃化現象不明顯; 野生型擬南芥葉片炭疽斑面積較大，黃化現象嚴重 (圖3(a))。

4.3 從相關關系角度 挖掘相關關系，擺脫因果思維的局限，是大數據技術最具價值的部分之一，是從無到有的突破。谷歌成功預測2009年全球H1N1流感發生就是典型案例，通過挖掘“治療咳嗽和發熱藥物”詞條的變化趨勢，得出流感在時間和空間上的相互關系，并與美國疾控中心的記錄數據進行對比，在甲型H1N1流感暴發幾周前，成功預測了流感暴發[11]。

接著進行轉BtACO基因擬南芥和野生型植株活體接菌，調查發病情況并進行比較，結果如3(b)：第一天，兩組葉片均無明顯變化；第二天，野生型植株葉片出現部分黃化現象，病級多集中在1、3級，病情指數為2.4，而轉BtACO基因擬南芥仍無變化；接菌第三天，野生型擬南芥發病程度加重，黃化部位增多，病級多集中在3、5級，病情指數為6，轉BtACO基因擬南芥少數葉片開始出現部分失綠，病級多集中在1級，病情指數為0.5，較野生型擬南芥病情指數降低91.7%；第四天、第五天野生型擬南芥葉片黃化現象嚴重，出現較多病斑，病級多集中在5、7、9級，病情指數大幅上升，轉BtACO基因擬南芥葉片發病程度較輕，病級多集中在3、5級，少有7級，病情指數顯著低于野生型植株(P<0.05)。綜上，與野生型材料相比，轉BtACO基因擬南芥對禾谷炭疽菌的抗性提高。

禾谷炭疽菌侵染20 d后，轉BtACO基因擬南芥的鮮重、干重分別均較野生型植株增加19.5%和6.7%(P<0.05)，即過表達BtACO的轉基因擬南芥生物量積累高于野生型(圖3(c, d))。綜合離體、活體接菌結果可見，BtACO基因可提高植株對禾谷炭疽菌的抗性，最終表現為生物量的增加。

圖3 轉BtACO擬南芥和野生型植株抗病性及生物量比較Fig.3 Disease resistance and biomass accumulation comparison between BtACO Arabidopsis and wild type plants

3 討論與結論

已有研究表明乙烯可促進病原菌的生長發育、提高病原菌的致病性[20]; 持續釋放乙烯會提高植物對多種真菌的抗性[21]；乙烯對病原菌的發展無明顯影響[22-24]。

植物病原菌孢子的數量在病害形成及循壞周期中發揮重要的作用[25-26]。當膠孢炭疽菌分生孢子產量下降時，致病力減弱[27]。本研究也得到相似結果：當乙烯利濃度高于125 mg/L時，產孢量較對照提高，此時植株病情指數明顯高于對照，即產孢量與禾谷炭疽菌的致病性具有相對一致性。同時發現，不同濃度乙烯利對孢子的產生有不同的影響：高濃度乙烯利(125～200 mg/L)促進孢子萌發，這與乙烯利對盤長孢狀刺盤孢(C.gloeosporioides)和香蕉刺盤孢(C.musae)生長的影響類似[28]，但與張苗等[29]發現的低濃度乙烯利促進鏈格孢孢子萌發，高濃度起到抑制作用不同，可能是由于病原菌的種類不同，對乙烯利的響應不同，即乙烯利對孢子生長的影響與真菌種類有關。研究表明黑色素的致病作用，可能是通過強化附著胞的形成及與其他毒素復合起作用[30]，而本研究發現黑色素的產量與致病性無明顯相關性。轉BtACO基因擬南芥比野生型植株對禾谷炭疽菌有更強的抗性，生物量的積累較高。研究表明ACO基因參與了植物對病菌侵染的響應[12-13,31]，根據本研究中結果中乙烯利濃度與禾谷炭疽菌致病性強弱的關系，推測轉BtACO基因植株的較高抗病性是由于BtACO基因的表達影響了乙烯的生物合成，可能是轉BtACO基因植株提高了釋放的乙烯的濃度，但尚未達到使禾谷炭疽菌致病性增強的高濃度。然而，植物的抗病與病原菌的致病是一個非常復雜的相互作用體系，BtACO基因如何在該復雜的體系中發揮功能，仍需進一步研究驗證。

綜上，低濃度外源乙烯利處理(10～75 mg/L)可降低禾谷炭疽菌的致病性，BtACO基因可以作為抗禾谷炭疽病的候選基因。