植物乳桿菌R23胞內(nèi)抗氧化酶高效提取與保存技術研究

任香蕓 何志剛 林曉姿 李維新 梁璋成 汪媛媛

摘 要：為獲得植物乳桿菌R23高活力胞內(nèi)抗氧化酶，以蛋白質(zhì)含量、菌量和超氧化物歧化酶（SOD）活力為主要指標，對該菌胞內(nèi)抗氧化酶提取、保存等技術進行研究。結果表明，超聲波法可有效破碎植物乳桿菌R23菌體細胞并保持理想的酶活力，在功率400 W、工作總時間20 min和變幅桿φ2 mm時，獲得的蛋白質(zhì)含量較高且SOD活力最大（47.06 U·g-1）;酶提取液在4℃冷藏12 h或-20℃凍藏24 h均有利于保持酶活力。有無二氧化硫脅迫下植物乳桿菌R23生長量均與蛋白質(zhì)含量變化相對應，因此可用蛋白質(zhì)含量指示菌體生長量，用于胞內(nèi)抗氧化酶活力的計算。

關鍵詞：植物乳桿菌;細胞破碎;抗氧化酶;菌量;蛋白質(zhì)含量

中圖分類號：Q 939.9?? 文獻標志碼：A?? 文章編號：0253-2301（2022）03-0001-06

DOI： 10.13651/j.cnki.fjnykj.2022.03.001

Study on the Efficient Extraction and Preservation Techniques of Intracellular AntioxidantEnzymes from Lactobacillus plantarum R23

REN Xiang-yun1，2， HE Zhi-gang1，2， LIN Xiao-zi1，2*， LI Wei-xin1，2，LIANG Zhang-cheng1，2， WANG Yuan-yuan3

[1. Institute of Agricultural Engineering Technology， Fujian Academy of Agricultural Sciences， Fuzhou，

Fujian 350003， China; 2. Fujian Key Laboratory of Agricultural Products （Food） Processing， Fuzhou， Fujian

350013， China; 3. Fujian Xilong Biological Technology Co.， LTD， Fuzhou， Fujian 350015， China]

Abstract： In order to obtain the intracellular antioxidant enzymes of Lactobacillus plantarum R23 with high activity， the extraction and preservation techniques of the intracellular antioxidant enzymes of Lactobacillus plantarum R23 were studied by using the protein content， the amount of bacteria and the activity of superoxide dismutase （SOD） as the main indexes. The results showed that the ultrasonic method could effectively disrupt the fungal cells of Lactobacillus plantarum R23 and maintain the ideal enzyme activity. When the ultrasonic parameters were as follows： the power of 400 W， the total working time of 20 min and the amplitude transformer of φ2 mm， the protein content was relatively high and the activity of SOD was the highest （47.06 U·g-1）. The enzyme activity could be maintained by freezing the enzyme extracting solution at 4℃ for 12 h or -20℃ for 24 h. The growth of Lactobacillus plantarum R23 corresponded with the change of protein content which was not affected by the stress of sulfur dioxide. Therefore， the protein content could be used to indicate the growth of bacterial cells for the calculation of the activity of intracellular antioxidant enzymes.

Key words： Lactobacillus plantarum; Cell disruption; Antioxidant enzyme; Amount of bacteria; Protein content

植物乳桿菌（Lactobacillus plantarum）R23是福建省農(nóng)產(chǎn)品（食品）加工重點實驗室人員在前期研究過程中獲得的優(yōu)良蘋果酸-乳酸發(fā)酵（malolactic fementation， MLF）乳酸菌，該菌不僅能夠耐受120 mg·L-1高二氧化硫脅迫且蘋果酸-乳酸酶活性高，由此大大減弱了酒體中二氧化硫?qū)w的損傷[1-2]，MLF功能得以有效發(fā)揮。目前，植物乳桿菌R23已在山葡萄酒、枇杷酒和楊梅酒等高酸性果酒的生物降酸中成功應用并顯著提高酒體品質(zhì)[3-4]。初步研究發(fā)現(xiàn)，植物乳桿菌R23抗氧化系統(tǒng)在菌體應答二氧化硫脅迫過程中發(fā)揮重要作用。因此，測定分析這一過程菌體胞內(nèi)抗氧化酶活力變化，將有助于揭示菌體對二氧化硫脅迫的耐受性機制，而行之有效的抗氧化酶制備技術與活力測定方法是前提基礎。

作為抗氧化酶等胞內(nèi)酶的制備，首先必須將細胞破壁，使產(chǎn)物得以釋放。目前常見的微生物細胞破壁方法主要有：化學法，如表面活性劑和酸等;物理法，如反復凍融法、超聲法、玻璃珠法等;生物法，如酶解法等[5-6]，各種方法都有自己的適用范圍及優(yōu)缺點。曾敏等[7]比較了超聲波、高速勻漿、反復凍融對鼠李糖乳桿菌LT22肽聚糖提取的影響，認為超聲波法效果最好，其理想條件為：功率500 W，處理時間10 min;趙瑞香等[8]通過單因素試驗和正交試驗，優(yōu)選出了超聲波破碎嗜酸乳桿菌釋放β-半乳糖苷酶的條件，即處理時間7.6 min，工作/間歇28 s/20 s，溫度36℃;李艷等[9]以融合蛋白濃度為主要考察指標，比較了酶法輔助超聲波和酶法輔助凍融法對大腸桿菌BL21細胞破碎溶出血管緊張素轉(zhuǎn)化酶抑制肽（ACEIP）的影響，結果發(fā)現(xiàn)反復凍融6次或超聲波破碎30 min，細胞破碎率可達100%，但反復凍融法操作較煩瑣、耗時長、試劑昂貴且處理量小，而超聲波破碎具有時間短、效率高且能減低黏度等優(yōu)點。由此可見，針對不同種微生物、破碎目的的差異性，破碎方式或條件也不盡相同。如何對植物乳桿菌R23細胞進行有效破碎，如何正確保存酶液樣品，以及如何合理表達酶活力，都是在抗氧化酶活力測定分析前需要解決的問題。

鑒于此，本研究將針對這些問題，以植物乳桿菌R23為試驗菌，著重從細胞破碎方法、酶液保存條件和菌體生長特點等方面展開研究，旨在獲得菌體胞內(nèi)抗氧化酶高效提取與保存方法，并確定酶活力的合理表達方式，為后續(xù)探討抗氧化系統(tǒng)在菌體耐受二氧化硫脅迫中的作用等研究提供科學、有效的技術手段。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 菌株來源 植物乳桿菌（Lactobacillus plantarum）R23，由福建省農(nóng)產(chǎn)品（食品）加工重點實驗室分離、鑒定與保存，NCBI號為HQ58056。

1.1.2 培養(yǎng)基 （1）LHR20液體培養(yǎng)基[10];（2）改良TJA培養(yǎng)基[11]。

1.1.3 主要儀器與試劑 SCIENTZ-950E型細胞破碎儀（寧波新芝生物科技股份有限公司）;GI54DW型高壓滅菌器（美國致微儀器有限公司）;SPX-250BS-Ⅱ型生化培養(yǎng)箱（上海新苗醫(yī)療器械制造有限公司）;SW-CJ-IFD型單人單面凈化工作臺（蘇州凈化設備有限公司）;TGL-18C型高速冷凍離心機（上海安亭科學儀器廠）;ZQLY-180S型立式雙層恒溫振蕩器（上海知楚儀器有限公司）;BioTek Epoch2型全波長酶標儀（美國寶特儀器有限公司）;UV-1705型紫外可見分光光度計（日本島津公司）。SOD試劑盒（上海起子生物科技有限公司）;考馬斯亮藍G-250試劑：稱取100 mg考馬斯亮藍G-250，溶于50 mL 95%乙醇中，加入100 mL 85%（w/v）磷酸，用水定容至1 L;標準蛋白質(zhì)溶液（0.1 mg·mL-1）：準確稱取牛血清蛋白0.01 g，加水溶解并定容至100 mL，4℃冰箱保存，備用。

1.2 試驗方法

1.2.1 菌種活化 將植物乳桿菌R23甘油凍存種接種于LHR20液體培養(yǎng)基中，30℃培養(yǎng)24 h，再以5%（v/v）轉(zhuǎn)接入LHR20進行二次活化，30℃培養(yǎng)15～18 h，備用。

1.2.2 有無脅迫條件下菌體短時生長過程菌量和蛋白質(zhì)含量變化分析 將植物乳桿菌R23活化種以10%（v/v）接種于不同二氧化硫濃度（0、120 mg·L-1）的LHR20液體培養(yǎng)基中，30℃培養(yǎng)，每隔4 h取樣1次，共培養(yǎng)12 h，分別測定樣品中菌量和蛋白質(zhì)含量，并分析兩者之間的關系，評價蛋白質(zhì)含量用于抗氧化酶活力計算的可行性。

1.2.3 不同細胞破碎方法對菌體胞內(nèi)抗氧化酶提取效果的影響 取植物乳桿菌R23活化種50 mL，9 000 r·min-1、4℃離心10 min，棄上清，加無菌生理鹽水洗滌1次，菌泥中加入5 mL PBS（pH 8.0）緩沖液，旋渦震蕩混勻，獲得的菌懸液分別作以下3種處理：（1）反復凍融：將菌懸液置于-70℃冰箱凍存30 min取出，隨后置20℃水浴鍋溶解5～10 min（至溶解），如此反復操作5次，備用;（2）超聲波破碎：條件為功率200 W、工作1 s、間歇2 s、時間20 min、變幅桿直徑5 mm，破碎后的菌懸液于12 000 r·min-1、4℃離心10 min，上清液裝于10 mL離心管，備用;（3）溶菌酶輔助超聲波破碎：向菌懸液中加入50 mg·mL-1溶菌酶0.1 mL，使溶菌酶的終濃度為1 mg·mL-1，4℃孵育10 min，加Triton-X至終濃度為1%，然后進行超聲處理，具體操作同（2）。測定以上3種處理獲得的樣品中蛋白質(zhì)含量和抗氧化酶活力（以SOD作代表），考察每種方法對菌體細胞的破碎程度以及對抗氧化酶活力的影響。

1.2.4 超聲波破碎條件對菌體胞內(nèi)抗氧化酶提取效果的影響 以破碎功率、工作總時間和變幅桿直徑為主要考察因素，固定間歇2 s、工作1 s不變，其他超聲條件分別設置為：（Ⅰ）功率200 W，工作總時間20 min，變幅桿φ5 mm;（Ⅱ）功率200 W，工作總時間10 min，變幅桿φ5 mm;（Ⅲ）功率200 W，工作總時間20 min，變幅桿φ2 mm;（Ⅳ）功率200 W，工作總時間10 min，變幅桿φ2 mm;（Ⅴ）功率400 W，工作總時間20 min，變幅桿φ5 mm;（Ⅵ）功率400 W，工作總時間20 min，變幅桿φ2 mm;（Ⅶ）功率600 W，工作總時間20 min，變幅桿φ5 mm;（Ⅷ）功率600 W，工作總時間20 min，變幅桿φ2 mm;分別利用以上8種條件對1.2.2制備的菌懸液進行超聲波破碎處理，并測定獲取的樣品中蛋白質(zhì)含量和SOD活力，進而確定適宜的超聲波破碎參數(shù)。

1.2.5 不同保存條件下菌體抗氧化酶樣品活力分析 采用優(yōu)化后的細胞破碎方法制取植物乳桿菌R23胞內(nèi)酶樣品，分別于常溫（30～35℃）、4℃和-20℃保存，并測定0、12和24 h樣品的SOD活力，分析保存溫度和時間對酶活力的影響。

1.2.6 測定方法 （1）菌量測定，采用平板計數(shù)法[12];（2）蛋白質(zhì)含量測定，采用考馬斯亮藍法[13]，標準曲線見圖1;（3）SOD酶活力測定：采用試劑盒法，具體操作按照產(chǎn)品說明書進行。

1.2.7 數(shù)據(jù)分析 采用Excel 2010和Origin 2018軟件對試驗數(shù)據(jù)進行處理與作圖，顯著性分析采用SPSS 23.0軟件的one-way ANOVA算法進行。

2 結果與分析

2.1 有無脅迫條件下菌體短時培養(yǎng)過程生長量和蛋白質(zhì)含量變化特點

由圖2可知，自然條件下（無二氧化硫脅迫）

植物乳桿菌R23生長量在4 h即發(fā)生顯著增加，之后增長速率進一步提升，整體蛋白質(zhì)含量增長趨勢與菌量相似（圖2a）。與之相比，在二氧化硫脅迫條件下菌體生長量和蛋白質(zhì)含量起初增勢緩慢，8 h后才有顯著提升（圖2b）。可見，二氧化硫脅迫使得菌體延滯期加長且導致生長總量下降，培養(yǎng)12 h的菌量比自然條件下低1個數(shù)量級;但兩種條件下菌體生長量和蛋白質(zhì)含量變化大體是一致的，提示抗氧化酶活力計算中可用蛋白質(zhì)含量指示菌量大小，并適用于后續(xù)菌體對二氧化硫脅迫的耐受性機制研究中。

2.2 不同細胞破碎方法對菌體胞內(nèi)抗氧化酶提取效果的影響

由表1可知，采用反復凍融法獲得的蛋白質(zhì)含量最小，為0.08 mg·mL-1，提示該方法對植物乳桿菌R23細胞破碎效果并不理想;采用超聲波法獲得的蛋白質(zhì)含量為1.72 mg·mL-1，其破碎效果顯著優(yōu)于反復凍融法（P<0.05）;溶菌酶輔助下菌體細胞破碎程度進一步增大（蛋白質(zhì)含量為1.88 mg·mL-1），但未發(fā)生顯著提升。從SOD酶活力看，反復凍融法的細胞破碎率雖低，但對酶活力的影響最小，溶菌酶輔助超聲波法對酶活力影響最大。因此，從操作簡便性、細胞破碎程度和酶活力保持三方面考慮，宜選擇單純超聲波法用于后續(xù)菌體細胞破碎。

2.3 超聲波破碎條件對菌體胞內(nèi)抗氧化酶提取效果的影響

8種超聲處理條件下獲得的蛋白質(zhì)含量和SOD活力見表2。超聲波破碎功率越大、工作總時間越長或變幅桿直徑越大，細胞破碎效果越好;其中處理Ⅶ的蛋白質(zhì)含量高達2.17 mg·mL-1，比常用超聲條件即處理I提高31.52%。但是，酶活力并非與之完全相對應，在200 W功率范圍內(nèi)，較長工作時間或較大直徑的變幅桿均會降低酶活力，且變幅桿直徑的影響大于工作總時間;功率在400 W（處理Ⅵ）時酶活力最大為47.06 U·g-1;當功率進一步增大時，蛋白質(zhì)含量雖然在繼續(xù)增加，但酶活力發(fā)生顯著下降。

2.4 保存條件對菌體胞內(nèi)抗氧化酶測定樣品活力的影響

由圖3可知，常溫（30～35℃）放置的樣品酶活力隨著時間延長迅速減小;4℃冷藏的樣品在12 h內(nèi)酶活力差異不顯著，-20℃凍藏的樣品酶活力在24 h內(nèi)差異不顯著。即常溫放置對酶活力影響最大，其次為4℃冷藏，-20℃凍藏酶活最為穩(wěn)定。因此，在樣品量較小的情況下，應盡快測完，且測定全程需冰浴;如果樣品量較大無法及時完成檢測，可將樣品作短時冷藏或長時冷凍處理。

3 結論與討論

反復凍融法可使細胞壁變疏松，增大通透性，加大細胞質(zhì)中蛋白溢出及細胞破裂[7]。本試驗選擇-70℃反復凍融5次的方法破碎植物乳桿菌R23細胞，與其他2種方法相比，該方法雖然可以有效保持胞內(nèi)抗氧化酶活力，但獲得的蛋白質(zhì)含量偏低，僅是超聲波法的4.4%，因此并不適宜用于該菌胞內(nèi)酶液的制備。溶菌酶輔助超聲波法雖然可以增強細胞破碎效果，但胞內(nèi)抗氧化酶活力發(fā)生顯著下降。已有報道顯示，酶解法在溶解細胞過程中，不僅會增加溶液的黏度，干擾對目的產(chǎn)物的檢測，而且易使目的產(chǎn)物生物活性受損[14-15]。推測，本試驗中SOD活力的降低，可能是由溶菌酶的使用引起的。因此，綜合考慮宜選擇單純超聲波法對植物乳桿菌R23細胞進行破碎。

本研究在對超聲波參數(shù)的優(yōu)化過程中，選用了3種功率、2種工作總時間和2種變幅桿直徑;從試驗結果看，超聲波功率、工作總時間和變幅桿直徑均影響細胞破碎效果和胞內(nèi)酶活力。其中，處理Ⅷ（功率600 W、工作總時間20 min、變幅桿直徑5 mm）獲得的蛋白質(zhì)含量最大，但酶活力顯著下降。原因分析為，大功率、長時間、粗桿超聲條件產(chǎn)生更加強勁的“空穴作用”[16-17]，使菌體細胞得以有效裂解;但同時超聲波振動的過程中機械能轉(zhuǎn)變成熱能，即使操作過程中樣品處于冰浴狀態(tài)，但熱量無法及時傳遞出去，進而影響了釋放出的蛋白質(zhì)（酶）活性。顧思天等[18]研究發(fā)現(xiàn)，當超聲波功率增大到400 W以上時，會導致植物乳桿菌ZS2058細胞破碎液中的蛋白質(zhì)變性、酶失活;趙瑞香等[8]研究發(fā)現(xiàn)，高強度超聲條件會導致溶液產(chǎn)生泡沫，進而導致蛋白質(zhì)變性。因此，功率過大、時間過長或變幅桿過粗均不利于酶活力的保持。在處理Ⅵ（功率400 W、工作總時間20 min、變幅桿直徑2 mm）超聲條件下，酶活力雖然保持最高，但是蛋白質(zhì)含量相對偏低一些。綜合考慮，可選擇處理V作為后續(xù)植物乳桿菌R23細胞破碎條件，在此條件下，酶活力與處理Ⅵ無顯著差異，蛋白質(zhì)含量較高且與處理Ⅶ無顯著差異。

參考文獻：

[1]FERNDEZ-PREZ R， RODRGUEZ C T， RUIZ-LARREA F.Fluorescence microscopy to monitor wine malolactic fermentation[J].Food Chemistry，2019，274：228-233.

[2]JIANG J，SUMBY K M，SUNDSTROM J F，et al.Directed evolution of Oenococcus oeni strains for more efficient malolactic fermentation in a multi-stressor wine environment[J].Food Microbiology，2018，73：150-159.

[3]LIN X Z，HE Z G，LI W X，et al.Validation of reference genes for real-time quantitative polymerase chain reaction analysis in Lactobacillus plantarum R23 under sulfur dioxide stress conditions[J].Australian Journal of Grape and Wine Research，2018，24（3）：390-395.

[4]李維新，何志剛，鄭寶東，等.植物乳桿菌R23產(chǎn)蘋果酸乳酸酶特性研究[J].中國食品學報，2012，12（5）：35-40.

[5]王曉敏，董璐，張繼福，等.細胞破碎方法對Bacillus sp.DL-2 胞內(nèi)蛋白酶拆分乙酸蘇合香酯的影響[J].熱帶海洋學報，2021，40（2）：39-48.

[6]梁蕊芳，徐龍，岳明強.細胞破碎技術應用研究進展[J].北方農(nóng)業(yè)學報，2013（1）：113.

[7]曾敏，謝為天，潘麗媚，等.鼠李糖乳桿菌細胞破碎方法的比較及其肽聚糖含量的測定[J].飼料工業(yè)，2010，31（8）：31-33.

[8]趙瑞香，王大紅，牛生洋，等.超聲波細胞破碎法檢測嗜酸乳桿菌 β-半乳糖苷酶活力的研究[J].食品科學，2006，27（1）：47-50.

[9]李艷，孫海燕，周麗珍，等.重組血管緊張素轉(zhuǎn)化酶抑制肽工程菌細胞破碎條件優(yōu)化[J] .湖北農(nóng)業(yè)科學，2014，53（9）：2127-2130.

[10]任香蕓，何志剛，林曉姿，等.植物乳桿菌R23高效增殖條件優(yōu)化[J].中國食品學報，2015（8）：94-100.

[11]任香蕓，何志剛，李維新，等.枇杷酒蘋果酸乳酸發(fā)酵耐硫優(yōu)良菌株的篩選[J].食品與發(fā)酵工業(yè)，2010，36（2）：12-16.

[12]THOMAS P，SEKHAR A C，UPRETI R，et al.Optimization of single plate-serial dilution spotting （SP-SDS） with sample anchoring as an assured method for bacterial and yeast cfu enumeration and single colony isolation from diverse samples[J].Biotechnology Reports，2015（8）：45-55.

[13]王孝平，邢樹禮.考馬斯亮藍法測定蛋白含量的研究[J].天津化工，2009，23（3）：40-41.

[14]RICCI-SILVA M E， VITILO M， ABRAHAO-NETO J.Protein and glucose 6-phosphate dehydrogenase releasing from baker′s yeast cells disrupted by a vertical bead mill[J].Process Biochemistry， 2000， 35（8）： 831-835.

[15]王曦，李彩梅，勞文燕，等.表達乙型肝炎表面抗原重組漢遜酵母細胞破碎方法的比較[J].中國生物制品學雜志，2012，25（6）：759-762.

[16]許愈，張昭寰，趙莉，等.應用酸性點解水聯(lián)合超聲波殺滅副溶血性弧菌[J].上海海洋大學學報，2020，29（4）：578-584.

[17]WANG Q X，MANMI K.Three dimensional microbubble dynamics near a wall subject to high intensity ultrasound[J].Physics of Fluids，2014，26（3）：DOI：10.1063/1.4866772.

[18]顧思天，陳海琴，葉強，等.植物乳桿菌ZS2058中亞油酸異構酶的定位研究[J].食品工業(yè)科技，2008，（12）：57-60.

（責任編輯：柯文輝）