2種不同彈力纖維染色方法對腫瘤侵犯判讀結果的對比研究

劉文超, 田 禾, 程 娜, 薛麗燕, 馮小龍, 鄭 波

(中國醫學科學院北京協和醫學院國家癌癥中心/國家癌癥臨床研究中心/北京腫瘤醫院1. 病理科, 2. 胸外科, 北京, 100021)

目前，肺癌在所有惡性腫瘤中死亡率最高[1-2]。病理診斷醫師在蘇木精-伊紅(HE)染色中不易判斷腫瘤細胞是否侵犯臟層胸膜時，需加行彈力纖維染色。根據美國國立綜合癌癥網絡(NCCN)指南TNM分期標準，即使腫瘤直徑≤3 cm, 只要侵犯臟層胸膜，應歸為T2期，而非T1期，故彈力纖維染色對肺癌患者的準確臨床分期具有重要意義。胸膜侵犯程度與肺癌腫瘤 TNM 分期具有良好的相關性，是影響肺癌患者術后預后的重要危險因素[3]。由于不健康的生活方式和遺傳背景，年輕人結直腸癌(CRC)的發病率逐年上升[4]。彈力纖維染色可有效提高結直腸癌臟層腹膜彈力層侵犯(VPELI)和血管侵犯(VI)的檢出率。VPELI陽性腫瘤患者提示預后不良[5]。癌癥的發病率逐漸升高，正確判斷腫瘤是否侵犯及侵犯程度尤為重要。在臨床病理工作中存在多種效果各異的彈力纖維染色方法，但對不同方法之間差異的研究較少。本研究通過對Victoria blue 法和Verhoeff法這2種染色方法的染色過程、染色時間、染色效果及對肺癌胸膜、結直腸癌漿膜或靜脈侵犯判讀難易進行對比，找到了一種操作簡單、染色穩定、容易判讀的彈力纖維染色方法。

1 材料與方法

1.1 材料

選取2017年9—12月懷疑侵犯的肺癌標本50例、結直腸標本20例為研究對象。每例病例切2張白片，分別入組Victoria blue 法(A組)和Verhoeff法(B組)。所有病例均經10%的中性福爾馬林固定液固定后石蠟包埋切片。

1.2 試劑

1.2.1 A組所用試劑: ①維多利亞藍染色液[6]。維多利亞藍2.0 g, 糊精0.5g,間苯二酚4.0 g, 蒸餾水200.0 mL。將上述物質混合后加熱煮沸，邊煮邊攪拌，約5 min。然后用另一容器取30.0%的三氯化鐵水溶液25.0 mL, 另行加熱煮沸后慢慢倒入上述混合液中，繼續煮沸3 min, 不斷攪拌溶液呈膠體狀。去火冷卻過濾，將濾紙上的殘渣連同濾紙一同放在60 ℃的恒溫箱中烤干。殘渣呈深藍色細顆粒狀粉末，再將其溶于400.0 mL的70.0%乙醇液中，然后加濃鹽酸4.0 mL和苯酚5.0 g, 放置至成熟后使用。② 核固紅染色液。核固紅0.1 g, 硫酸鋁5.0 g, 蒸餾水100.0 mL, 麝香草酚50.0 mg。先將硫酸鋁溶于蒸餾水，然后加入核固紅，稍微加溫溶解，冷卻后過濾，加入麝香草酚。

1.2.2 B組所用試劑: ① 鐵碘蘇木素溶液(彈性纖維染色液-Ⅰ)。蘇木素2.8%, 三氯化鐵5.0%, Verhoeff氏碘液(碘化鉀2.0 g、典結晶1.0 g、實驗室三級水100.0 mL), 無水乙醇。② 三氯化鐵溶液(彈性纖維染色液-Ⅱ)。三氯化鐵2.0%, 實驗室三級水。VG染色液(彈性纖維染色液-Ⅲ)。酸性復紅液1.5%, 桔黃G 0.5%, 實驗室三級水。

1.3 染色方法

1.3.1 彈力纖維染色: 2位技師對入組標本隨機平均分配(每位技師25例肺癌及10例結直腸癌)，進行A組和B組彈力纖維染色。染色方法如下: ⑴ A組。① 石蠟切片，脫蠟入水。② 切片入70.0 %乙醇1 min。③ 切片浸入Victoria blue 染液中1.5 h。④ 用95.0%乙醇分化2～3 s, 水洗。⑤ 切片浸入核固紅染液8～15 min, 水洗。⑥ 用95.0%乙醇及無水乙醇脫水，二甲苯透明，中性樹膠封固。⑵ B組。① 切片脫蠟至水。② 鐵碘蘇木素染色15～30 min, 至顏色呈深黑色。自來水洗。③ 三氯化鐵溶液分化10～20 s, 至彈力纖維清晰為止，自來水充分水洗。④ 入95.0%乙醇2～5 min, 自來水水洗2遍。⑤ 滴染VG染色液染色1～2 min。⑥ 用95.0%乙醇急速分化。無水乙醇脫水，二甲苯透明、中性樹膠封固。

1.3.2 2種染色方法的比較: 對2種方法的染色過程、操作時間進行對比。染色判讀及評分: 請2位病理醫師盲法對所有特染切片染色效果、腫瘤侵犯判讀難易程度進行評價，對胸膜、漿膜或靜脈侵犯結果進行判讀。評分標準: 從彈力纖維定位定性準確、染色背景干凈、腫瘤細胞與彈力纖維對比清晰、炭末有無影響炭判讀這4個方面進行判讀評價，單項分數最高2分，最低0分，即彈力纖維定性定位不準確0分，較準確1分，準確2分; 染色背景不干凈0分，較干凈1分，干凈2分; 腫瘤與彈力纖維對比不清晰0分，較清晰1分，清晰2分; 炭末有影響0分，較影響1分，無影響2分。4項內容滿分共計8分。

1.4 統計學分析

評分匯總應用SPSS 22.0軟件進行統計學分析。采用兩配對樣本的Wilcoxon非參數檢驗,P<0.05為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1 2種染色方法染色步驟及染色時間比較

分化是染色程序的關鍵步驟, A組和B組分別耗時2～3 s和35 min。見表1。

表1 2種方法染色過程、操作時間對比

2.2 判讀結果

2種方法的判讀結果顯示，A組分別有41.43%、58.57%的患者被判讀為侵犯性和無侵犯性，所有患者均可通過Victoria blue法判讀。B組分別有37.14%、61.34%的患者被判讀為侵犯性和無侵犯性, 1例患者不能通過Verhoeff法判讀。見表2。

表2 肺癌胸膜侵犯、結直腸癌漿膜或靜脈侵犯判讀結果比較[n(%)]

2.3 染色評分

A組各項評分均高于B組，且A組總分[(7.42±0.94)分]高于B組總分[(4.89±1.53)分]，差異有統計學意義(P<0.05)。見表3。

表3 彈力纖維染色評分 分

2.4 染色效果

A組分化易掌握，腫瘤細胞與彈力纖維對比清晰，炭末不影響判讀，低倍鏡下易判讀。B組分化不易掌握，腫瘤細胞與彈力纖維對比不清晰，炭末影響判讀，低倍鏡下不易判讀。見圖1。

3 討 論

目前公認臟層胸膜由以下 4層構成: 間皮細胞層; 間皮下結締組織層; 彈力纖維層; 結締組織層分隔彈力纖維和肺實質[7]。彈力纖維染色在肺癌病例中主要用于顯示腫瘤細胞與胸膜的關系，從而評估腫瘤侵犯層次，對病理學指標的TNM分期有重要臨床意義。在結直腸癌中，漿膜或靜脈侵犯是評價臨床術后病理分期(pTNM)及臨床個體化治療的重要指標[8-9]。

高效準確的病理報告對臨床醫生進行臨床決策至關重要。在實際的臨床工作中，病理醫生的工作量大。操作簡單、染色穩定、容易判讀的彈力纖維染色方法對病理技術人員和病理醫師具有重要意義。肺癌胸膜侵犯、結直腸癌漿膜或靜脈侵犯判讀結果(表2)表明，A組和B組相比，B組存在漏診，導致漏診病例的TNM分期不準確，進而對判斷患者預后及后期個體化治療造成影響。

B組存在漏診的原因主要有以下幾個方面: 首先, B組彈力纖維呈黑色，細胞核呈棕黑色、膠原纖維呈紅色。細胞核和彈力纖維對比不明顯，難以辨認二者之間的關系(圖1b)。在低倍鏡下，醫生很難通過B組染色分辨肺癌胸膜是否侵犯、結直腸癌漿膜或靜脈是否侵犯(圖1b、2b)。而A組彈力纖維呈藍色，細胞核呈紅色。該法在染液中浸染1.5 h, 用核固紅復染，紅色的細胞核與藍色的彈力纖維對比清晰，對較粗、較細的彈力纖維染色效果均顯著[10], 能夠清晰顯示腫瘤細胞與彈力纖維的關系(圖1a), 通過該法醫生在低倍鏡下能輕松、準確判讀肺癌胸膜、結直腸癌漿膜或靜脈是否侵犯(圖1a、2a), 從而提高診斷工作效率。其次，在肺癌病例中, B組炭末、細胞核及彈力纖維均為黑色，黑色的炭末影響細胞核與彈力纖維關系的判讀(圖3b)。而A組彈力纖維呈藍色，細胞核呈紅色，黑色的炭末不影響細胞核與彈力纖維關系的判讀(圖3a), 細胞核與彈力纖維對比清晰(圖4a、5a), 染色效果能夠滿足病理醫生的診斷需求。再次，B組對三氯化鐵分化步驟要求較高，需根據彈力纖維清晰程度決定分化時間，因此需要進行單張分化。根據實驗結果(表1)，如同時染多張切片，染色技術員需付出較長時間進行該染色方法的分化工作，且容易出現分化不一致、染色結果不穩定的情況。當分化不夠時，染色結果對比不清晰(圖4b); 分化過度時，則不能較好地顯示彈力纖維(圖5b), 容易出現因分化不佳導致的重復染色，從而影響診斷。此外，該法染液不能長期保存和重復使用。而A組分化過程不用單張操作，分化時間短且一致，工作效率提高，降低了技術人員的工作難度，提高了染色穩定性。此外該法染液適宜浸染，配置結束后約0.5 h放置成熟即可使用，常溫條件下可保存數年，使用方便。

1a: A組染色效果。肺癌,腫瘤細胞與彈力纖維對比清晰; 1b: B組染色效果。肺癌,腫瘤細胞與彈力纖維對比不清晰; 2a: A組染色效果。腸癌,低倍鏡下易判讀; 2b: B組染色效果。腸癌,低倍鏡下不易判讀; 3a: A組染色效果。肺癌,炭末不影響判讀; 3b: B組染色效果。肺癌,炭末影響判讀; 4a: A組染色效果。肺癌,分化易掌握,腫瘤細胞與彈力纖維對比清晰; 4b: B組染色效果。肺癌,分化不夠,腫瘤細胞與彈力纖維對比不清晰; 5a: A組染色效果。肺癌,分化易掌握,腫瘤細胞與彈力纖維對比清晰; 5b: B組染色效果。肺癌,分化過度,腫瘤細胞與彈力纖維對比不清晰。圖1 2種彈力纖維染色方法的染色效果(放大倍數10倍)

綜上所述, Victoria blue法染色對肺癌臟層胸膜侵犯和結直腸癌漿膜或靜脈侵犯結果的判讀更清晰、準確，能很好地滿足病理醫生診斷的需要，具有染色質量穩定、對比清晰、炭末不影響判讀、操作簡單和安全可靠等諸多優點，能夠為病理診斷提供更加可靠的依據，為腫瘤患者提供更高效的服務。