微小RNA-506-3p靶向SPOCK1對宮頸癌HeLa細胞增殖、凋亡的研究

代恒蘋, 尤克莎, 陳典玲

(陜西省安康市婦幼保健院 產科三病區, 陜西 安康, 725000)

宮頸癌的發病率僅次于乳腺癌，是女性癌癥相關死亡的重要原因[1]。近年來，雖已發現治療宮頸癌的生物靶點，但其死亡率仍居高不下。微小RNA(miRNA)是一類與腫瘤發生發展密切相關的短鏈小分子非編碼RNA。miR-506-3p屬于miR-506-514亞群，位于X染色體，參與對細胞增殖、凋亡和遷移等生命活動的調控，影響腫瘤發生發展。研究[2]表明, miR-506在宮頸癌組織中異常低表達，通過靶向作用于hedgehog通路中Gli3轉錄因子，誘導細胞周期出現G1/S期阻滯，抑制細胞增殖，促進細胞凋亡。SPOCK1又叫細胞外基質蛋白多糖基因，屬于鈣離子結合蛋白多糖家族成員，位于人類染色體5q31位點。既往研究[3-7]表明, SPOCK1在神經膠質瘤、結腸癌、食管鱗狀細胞癌、卵巢癌及肺癌等腫瘤組織中異常表達，下調其表達可抑制腫瘤細胞的增殖和轉移。但SPOCK1在宮頸癌發展中的作用還不清楚。生物信息學分析顯示, SPOCK1是miR-506-3p的潛在靶點。本研究檢測了宮頸癌細胞中miR-506-3p和SPOCK1的表達情況，觀察miR-506-3p過表達和SPOCK1抑制表達對宮頸癌細胞HeLa增殖和凋亡的影響，探究miR-506-3p對SPOCK1的靶向作用機制。

1 材料與方法

1.1 實驗材料、試劑

宮頸癌細胞HeLa、Siha、Caski及正常宮頸細胞Ect1/E6E7購自中國科學院上海細胞庫，聚合酶鏈反應(PCR)引物、miR-506-3p mimic、miR-NC、si-SPOCK1、si-NC、pcDNA、pcDNA-SPOCK1、WT-SPOCK1及MUT-SPOCK1的構建和測序由北京華大基因公司完成，蛋白質印跡(Western blot)相關試劑購自上海碧云天公司，四甲基偶氮唑藍(MTT)試劑、Annexin V-FITC/PI凋亡檢測試劑盒購于北京索萊寶公司。

1.2 細胞培養、實驗分組與細胞轉染

采用含有10%胎牛血清的RPMI 1640培養基對正常宮頸細胞Ect1/E6E7和宮頸癌細胞HeLa、Siha及Caski進行培養。定期觀察細胞生長情況，及時更換培養液。用胰酶消化融合度約為80%細胞，進行傳代培養。

將實驗分為miR-506-3p mimic組(轉染miR-506-3p mimic)、miR-NC組(轉染miR-NC)、si-SPOCK1組(轉染si-SPOCK1)、si-NC組(轉染si-NC)、miR-506-3p mimic+pcDNA組(轉染miR-506-3p mimic和pcDNA)和miR-506-3p mimic+pcDNA-SPOCK1組(轉染miR-506-3p mimic和pcDNA-SPOCK1)。

收集對數生長期的HeLa細胞接種于6孔板(以5×105個/孔)上，細胞融合度約為60%時，室溫下將各組待轉染RNA與LipofectamineTM2000混合，孵育20 min后，將混合物加入HeLa細胞中搖晃混勻，無血清培養基培養6 h, 再用含血清培養基繼續培養48 h, 進行后續實驗分析。為進一步驗證miR-506-3p是通過調控SPOCK1表達參與對宮頸癌細胞增殖和凋亡的調控，進行回補實驗，把miR-506-3p mimic和pcDNA-SPOCK1同時轉入HeLa細胞，觀察過表達SPOCK1能否逆轉miR-506-3p對宮頸癌細胞HeLa增殖和凋亡的影響。

1.3 實時熒光定量PCR(qRT-PCR)檢測miR-506-3p和SPOCK1的mRNA表達水平

按照Trizol說明書分別提取正常宮頸細胞Ect1/E6E7和宮頸癌細胞HeLa、Siha及Caski總RNA, 分析其濃度、純度后，逆轉錄酶合成cDNA, 隨后進行qRT-PCR反應。miR-506-3p和SPOCK1mRNA的檢測分別以U6和GAPDH為內參。采用2-△△Ct法計算mRNA的相對表達量。所用引物序列如下(5′-3′): miR-506-3p上游引物: ACACTCATAAGGCACCCTTC; miR-506-3p下游引物: TCTACTCAGAAGGGGAGTAC;U6上游引物: CTCGCTTCGGCAGCACA;U6下游引物: ACGCTTCACGAATTTGC;SPOCK1上游引物: CAGCCTGTCCACACAAAAGC;SPOCK1下游引物: CCATCGATT-TGGGGGTTCCA;GAPDH上游引物: GTCAACGGATTTGGTCTGTATT;GAPDH下游引物: CGCUUCACGAAUUUGCGUGUCAU。

1.4 雙熒光素酶報告實驗

TargetscanHuman 7.1網站(http://www.targetscan.org/vert_71/)在線預測顯示miR-506-3p與SPOCK1基因的3′UTR有結合位點。構建含有或未含有miR-506-3p結合位點的野生型或突變型SPOCK1基因3′UTR的熒光素酶表達載體WT-SPOCK1、MUT-SPOCK1。按照1.2 LipofectamineTM2000轉染方法將WT-SPOCK1和MUT-SPOCK1質粒分別轉染到HeLa細胞，同時分別轉染miR-506-3p mimic或miR-NC。用熒光素酶報告基因檢測儀進行結果檢測。

1.5 MTT法檢測細胞增殖活力

分別取miR-506-3p mimic組、miR-NC組、si-SPOCK1組、si-NC組、miR-506-3p mimic+pcDNA組及miR-506-3p mimic+pcDNA-SPOCK1組轉染成功的對數期細胞，用胰酶消化后重懸細胞，以3×103個/孔細胞數接種于96孔板中，培養24、48、72 h后按照文獻[8-9]方法加入MTT試劑以檢測細胞增殖活力，以空白孔調零，用酶標儀在490 nm波長處測定各孔光密度值(OD值)。

1.6 流式細胞儀檢測細胞凋亡

采用適量結合緩沖液重懸各組細胞。按照Annexin V/PI試劑盒說明書，暗室內先后加入Annexin V-FITC和PI染色。使用流式細胞儀檢測熒光強度。

1.7 Western blot測定蛋白表達水平

用RIPA裂解液提取正常宮頸細胞Ect1/E6E7和宮頸癌細胞HeLa、Siha、Caski以及各轉染組HeLa細胞總蛋白，并測定蛋白濃度。取30 μg蛋白樣品上樣，進行十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)，并濕法轉至聚偏氟乙烯(PVDF)膜。隨后用Western封閉液室溫封閉60 min, 吸盡封閉液后，用抗SPOCK1、GAPDH、細胞周期調節蛋白(Cyclin D1)、細胞周期蛋白激酶抑制劑(p21)、抗凋亡因子(Bcl-2)、凋亡蛋白(Bax)、活化型半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3(Cleaved-caspase3)和升高剪切型PARP(Cleaved-PARP)一抗4 ℃緩慢搖動孵育過夜; 用相應的二抗(1∶1 000)室溫孵育2 h。ECL化學發光試劑顯色后進行拍照，并用Image J軟件對目的條帶進行定量(以GAPDH為內參)。

1.8 數據分析

2 結 果

2.1 miR-506-3p和SPOCK1在宮頸癌細胞和正常宮頸細胞中的表達

qRT-PCR結果顯示，宮頸癌細胞HeLa、Siha、Caski中miR-506-3p的表達與正常宮頸細胞Ect1/E6E7相比均降低,SPOCK1mRNA的表達與正常宮頸細胞Ect1/E6E7相比升高，差異有統計學意義(P<0.05)。Western blot結果顯示，宮頸癌細胞HeLa、Siha、Caski中SPOCK1蛋白的表達與正常宮頸細胞Ect1/E6E7相比均升高(P<0.05), 差異有統計學意義。見圖1、表1。

圖1 宮頸癌細胞和正常宮頸細胞中SPOCK1蛋白的表達

表1 miR-506-3p和SPOCK1在宮頸癌細胞和正常宮頸細胞中的表達

2.2 miR-506-3p靶向調控SPOCK1的表達

生物信息學分析(圖2A)顯示, miR-506-3p在SPOCK1基因3′UTR有相應結合位點。熒光素酶活性檢測結果(見表2)顯示，轉染WT-SPOCK1后，再轉染miR-506-3p mimic組的HeLa細胞的熒光素酶活性低于再轉染miR-NC組，差異有統計學意義(P<0.05)。而轉染MUT-SPOCK1后，再轉染miR-506-3p mimic組的HeLa細胞的熒光素酶活性變化與再轉染miR-NC組比較，差異無統計學意義(P>0.05), 表明SPOCK1是miR-506-3p的靶基因。

A: SPOCK1與miR-506-3p的結合位點預測; B: miR-506-3p過表達或抑制其表達對SPOCK1蛋白表達的影響圖2 miR-506-3p靶向調控SPOCK1的表達

表2 雙熒光素酶報告實驗

Western blot檢測結果(見圖2B和表3)顯示, miR-506-3p mimic組HeLa細胞SPOCK1蛋白表達水平低于與miR-NC組，差異有統計學意義(P<0.05); anti-miR-506-3p組HeLa細胞SPOCK1蛋白表達水平高于anti-miR-NC組，差異有統計學意義(P<0.05), 說明miR-506-3p可抑制HeLa細胞SPOCK1基因的表達。

表3 miR-506-3p過表達或抑制其表達對SPOCK1蛋白表達的影響

2.3 miR-506-3p過表達對宮頸癌HeLa細胞增殖和凋亡的影響

qRT-PCR(見表4)顯示，與miR-NC組相比, miR-506-3p mimic組HeLa細胞miR-506-3p的表達升高，差異有統計學意義(P<0.05), 表明成功構建了過表達miR-506-3p的HeLa細胞株。

MTT增殖實驗(見表4)顯示, miR-506-3p mimic組HeLa細胞在48、72 h時細胞活力低于miR-NC組，差異有統計學意義(P<0.05), 表明過表達miR-506-3p可顯著抑制宮頸癌HeLa細胞增殖。

流式細胞術檢測結果(見圖3B和表4)顯示, miR-506-3p mimic組細胞凋亡率高于miR-NC組，差異有統計學意義(P<0.05)。結果表明，過表達miR-506-3p可顯著促進宮頸癌HeLa細胞的凋亡。

Western blot檢測結果(見圖3A和表4)顯示, miR-506-3p mimic組HeLa細胞Cyclin D1和Bcl-2蛋白的表達低于miR-NC組, p21、Bax、Cleaved-caspase3和Cleaved-PARP蛋白的表達高于miR-NC組，差異有統計學意義(P<0.05)。

A: 免疫印跡圖; B: 細胞凋亡流式圖。圖3 miR-506-3p過表達對宮頸癌HeLa細胞增殖和凋亡的影響

2.4 抑制SPOCK1表達對宮頸癌HeLa細胞增殖和凋亡的影響

Western blot檢測(見圖4、表5)顯示, si-SPOCK1組HeLa細胞SPOCK1蛋白的表達低于si-NC組，差異有統計學意義(P<0.05), 表明成功構建了抑制SPOCK1表達的HeLa細胞株。si-SPOCK1組HeLa細胞CyclinD1和Bcl-2蛋白的表達低于si-NC組, p21、Bax、Cleaved-caspase3和Cleaved-PARP蛋白的表達高于si-NC組，差異有統計學意義(P<0.05)。

表4 miR-506-3p過表達對宮頸癌HeLa細胞增殖和凋亡的影響

MTT增殖實驗(見表5)顯示, si-SPOCK1組HeLa細胞在48、72 h時細胞活力低于si-NC組，差異有統計學意義(P<0.05), 表明抑制SPOCK1表達可顯著抑制HeLa細胞增殖。

流式細胞術檢測(見表5)顯示, si-SPOCK1組細胞凋亡率高于si-NC組，差異有統計學意義(P<0.05)。結果表明，抑制SPOCK1表達對宮頸癌HeLa細胞具有顯著促凋亡作用。

圖4 免疫印跡圖

表5 抑制SPOCK1表達對宮頸癌HeLa細胞增殖和凋亡的影響

2.5 SPOCK1過表達逆轉miR-506-3p過表達對宮頸癌HeLa細胞增殖和凋亡的作用

Western blot檢測(見圖5和表6)顯示，與miR-NC組相比, miR-506-3p mimic組HeLa細胞SPOCK1、Cyclin D1和Bcl-2蛋白的表達降低, p21、Bax、Cleaved-caspase3和Cleaved-PARP蛋白的表達升高，差異有統計學意義(P<0.05); 與miR-506-3p mimic+pcDNA組相比, miR-506-3p mimic+pcDNA-SPOCK1組HeLa細胞SPOCK1、Cyclin D1和Bcl-2蛋白的表達升高, p21、Bax、Cleaved-caspase3和Cleaved-PARP蛋白的表達降低，差異有統計學意義(P<0.05)。

圖5 免疫印跡圖

MTT法檢測(見表6)顯示, miR-506-3p mimic組HeLa細胞在48、72 h時細胞活力低于miR-NC組，差異有統計學意義(P<0.05); miR-506-3p mimic+pcDNA-SPOCK1組HeLa細胞在48、72 h時細胞活力高于miR-506-3p mimic+pcDNA組，差異有統計學意義(P<0.05)。

流式細胞術檢測(見表6)顯示, miR-506-3p mimic組細胞凋亡率高于miR-NC組，差異有統計學意義(P<0.05); 而miR-506-3p mimic+pcDNA-SPOCK1組細胞凋亡率低于miR-506-3p mimic+pcDNA組，差異有統計學意義(P<0.05)。以上結果表明, SPOCK1過表達可以逆轉過表達miR-506-3p對宮頸癌HeLa細胞的增殖抑制及凋亡促進作用。

3 討 論

腫瘤細胞的惡性增殖和凋亡抵抗是腫瘤發生的重要機制。因此探討宮頸癌細胞增殖和凋亡的內在機制，尋找遏制宮頸癌惡性發展的靶基因具有重要的意義。

miR-506-3p位于人類X染色體長臂27.3位置，細胞中miR-506-3p的異常表達與腫瘤的發生密切相關。研究[10]顯示, miR-506-3p在多種腫瘤中異常低表達，通過上調其下游靶基因，可調控腫瘤細胞的增殖和凋亡等生命進程。例如, miR-506-3p可下調RAB3D的表達抑制骨肉瘤細胞MG63的增殖和轉移過程。miR-506-3p還可下調LHX2的表達抑制Wnt/β-catenin信號通路，從而抑制鼻咽癌細胞的生長和轉移[11]。研究[12]表明, miR-506-3p在宮頸癌中表達下調，但miR-506-3p在宮頸癌中的作用并未完全闡明。

SPOCK1是鈣離子結合蛋白多糖家族成員，其參與調控細胞周期、細胞凋亡、DNA修復和轉移。隨著對腫瘤研究的進一步深入, SPOCK1在多種腫瘤中的重要作用引起了學者的廣泛關注。SPOCK1在食管鱗狀細胞癌中過表達[13]; SPOCK1與拉帕替尼耐藥及胃癌復發有關[14]; 在肝癌細胞中, CHD1L可作用于SPOCK1進而激活Akt信號通路，抑制細胞凋亡，促進腫瘤轉移[15]。生物信息學分析顯示,SPOCK1是miR-506-3p的潛在靶基因，但SPOCK1在宮頸癌中的表達情況及miR-506-3p能否靶向作用于SPOCK1參與宮頸癌細胞的增殖和凋亡調控還不清楚。

表6 過表達SPOCK1逆轉miR-506-3p過表達對宮頸癌HeLa細胞增殖和凋亡的作用

本研究檢測到宮頸癌細胞中miR-506-3p表達異常下調, SPOCK1表達異常上調。這與GONG M等[12]宮頸癌中miR-506-3p低表達的結論一致。隨后的雙熒光素酶報告基因檢測和Western blot結果證實SPOCK1表達受到miR-506-3p的靶向負性調控。用脂質體轉染法上調miR-506-3p表達或RNA干擾技術抑制SPOCK1表達，均發現HeLa細胞中Cyclin D1和Bcl-2表達下降, p21和Bax表達升高，細胞增殖減弱，凋亡增加。Cyclin D1表達減少，與CDKs形成的細胞周期素蛋白激酶復合物減少，同時p21抑制復合物的活性，進一步阻礙細胞周期從G0/G1期進入S期，從而發揮抗增殖作用。促凋亡蛋白Bax表達增加，抗凋亡因子Bcl-2表達減少，促進細胞凋亡[16]。此外，上調miR-506-3p或抑制SPOCK1表達后細胞凋亡標記物Cleaved-caspase3和Cleaved-PARP表達顯著升高。這與敲減SPOCK1后，前列腺癌[17]、膽囊癌[3]及膀胱癌[18]細胞增殖減弱凋亡增加現象相吻合，并可能與PI3K/Akt信號通路有關[19]。以上結果提示，在宮頸癌細胞中, miR-506-3p可通過抑制癌細胞增殖，促進其凋亡，抑制宮頸癌的進一步惡化。而SPOCK1則發揮相反的作用。把miR-506-3p mimic和pcDNA-SPOCK1共轉染HeLa細胞后，發現miR-506-3p對HeLa細胞的增殖抑制和促進凋亡作用在一定程度上得到逆轉。

綜上所述，在宮頸癌細胞中miR-506-3p低表達, SPOCK1高表達，且miR-506-3p通過靶向下調SPOCK1的表達抑制宮頸癌細胞HeLa增殖并誘導其凋亡。這為miR-506-3p作為宮頸癌治療靶點提供新的理論依據。