皮膚惡性黑色素瘤組織中微小RNA-185-5p、SOX13的表達及臨床意義

陳 華, 嚴 旭, 宋樹玲

(1. 山東省棗莊市皮膚病性病防治院 皮膚科, 山東 滕州, 277500;2. 山東省滕州市中心人民醫院 皮膚科, 山東 滕州, 277500;3. 山東省棗莊市立醫院 皮膚科, 山東 棗莊, 277000)

皮膚惡性黑色素瘤(CMM)為皮膚科常見惡性腫瘤，其起病隱匿，易發生轉移，病死率高，預后較差[1], CMM的發病率占皮膚惡性腫瘤的5%左右，在皮膚惡性腫瘤中病死率最高[2], 臨床常用手術、放化療等方式治療，但很難徹底治愈，目前關于CMM的發病機制尚不十分清楚，因此，研究CMM的發病機制對CMM的治療具有重要意義。微小RNA(miRNA)為非編碼小分子RNA, 參與調控細胞增殖、分化，并與多種疾病如惡性腫瘤的發生和發展有關[3]。miR-185-5p為常見的一種微小RNA, 在多種腫瘤中表達下調，上調腫瘤細胞中miR-185-5p表達可顯著抑制腫瘤的增殖[4]。研究[5]顯示，過表達miR-185-5p可靶向調控MAPK14, 阻斷細胞上皮間質轉化，抑制黑色素瘤A375細胞的侵襲、遷移和腫瘤形成。SOX13屬于SOX基因家族中的一種轉錄因子，在惡性腫瘤的發生中發揮重要作用。研究[6]表明，結直腸癌組織中SOX13的表達明顯上調，因此阻斷SOX13表達可抑制結直腸癌的遷移、侵襲與轉移。本研究檢測CMM組織中miR-185-5p與SOX13的表達情況，初步探討miR-185-5p、SOX13與CMM發生、發展的相關性。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選擇2015年6月—2018年4月行手術治療的61例CMM患者為觀察對象，取所選患者的CMM組織標本(CMM組)。61例CMM患者中，男38例，女23例; 年齡31～80歲，平均(59.70±11.40)歲; 腫瘤直徑<2 cm者27例, ≥2 cm者34例; 發病部位為頭頸部26例，軀干部12例，四肢23例; 腫瘤分期Ⅰ～Ⅱ期者29例, Ⅲ～Ⅳ期者32例; 淋巴結轉移者33例，無淋巴結轉移者28例。納入標準: ① 經病理學檢查確診為CMM者; ② 術前未經藥物、激光、放射治療者; ③ 患者臨床資料完整。排除標準: ① 合并糖尿病、高血壓等嚴重慢性疾病者; ② 合并其他惡性腫瘤者。另外，選取同時期61例診斷為皮膚良性色素痣的健康人群的組織標本為對照組，其中男40例，女21例，年齡32～78歲，平均(59.50±11.50)歲，發病部位為四肢者29例，非肢端32例。研究樣本采集均經過倫理委員會批準。CMM組與對照組標本供者的性別、年齡、發病部位等一般資料比較，差異無統計學意義(P>0.05)。

1.2 主要試劑

miR-185-5p、SOX13及內參基因GAPDH、U6的引物由廣州銳博生物技術公司設計與合成, miRNeasy Mini Kit購自Qiagen公司, TaqmanmicroRNA reverse Transcription Kit購自Thermo Fisher公司, SYBR Green qPCR Mix、免疫組化試劑盒、DAB試劑盒購自北京索萊寶科技有限公司，兔抗人SOX13多克隆抗體購自Elabscience公司。

1.3 方法

1.3.1 實時熒光定量聚合酶鏈式反應(qRT-PCR)檢測CMM組織與色素痣組織中SOX13、miR-185-5p的表達: 手術取患者CMM組織及色素痣組織標本, -80 ℃冰箱凍存。取冷凍標本，采用qRT-PCR檢測miR-185-5p、SOX13mRNA的表達，引物序列見表1。反應結束后，分別以U6、GAPDH為內參基因，采用2-△△CT分析法計算miR-185-5p、SOX13mRNA的相對表達量，每個樣品設置3個復孔，取平均值。

表1 qRT-PCR檢測的引物序列

1.3.2 免疫組織化學染色: 將手術過程中取得的標本進行石蠟包埋，連續切片后，經過脫蠟、抗原修復和封閉，之后加入兔抗人SOX13多克隆抗體(按照1∶500稀釋), 4 ℃冰箱孵育過夜后，加入二抗(按照1∶1 000稀釋)，室溫孵育1 h, DAB染色，蘇木素復染，采用顯微鏡觀察。染色結果判斷: SOX13陽性表現為黃色顆粒，主要定位于細胞核，根據陽性細胞占比進行評分, 0～10%、>10%～25%、>25%～50%、>50%～75%、>75%分別判為0、1、2、3、4分。根據細胞著色深度進行評分，無著色為0分，淡黃色為1分，棕黃色為2分，棕褐色為3分。將2項評分相乘，總分≤1分判為陰性(-)，總分≥2分為陽性(+)。

1.4 統計學分析

采用SPSS 22.0進行統計學分析, miR-185-5p、SOX13mRNA表達水平用均數±標準差表示，組間比較采用t檢驗; 計數資料采用[n(%)]表示，組間比較采用卡方檢驗; Pearson法分析CMM組織中miR-185-5p與SOX13mRNA表達水平的相關性; Kaplan-Meier生存曲線分析miR-185-5p、SOX13表達與CMM患者生存率的關系; Cox回歸模型分析CMM患者的預后影響因素。P<0.05為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1 CMM組織與色素痣組織中miR-185-5p及SOX13 mRNA表達水平比較

CMM組織中, miR-185-5p表達水平為(0.47±0.08), 低于色素痣組織的(1.01±0.13), 差異有統計學意義(t=27.630,P<0.05); CMM組織中SOX13mRNA表達水平為(2.32±0.51), 高于色素痣組織的(1.05±0.11), 差異有統計學意義(t=19.012,P<0.05)。

2.2 CMM組織與色素痣組織SOX13蛋白表達水平比較

免疫組織化學染色結果顯示, CMM組織中SOX13蛋白陽性表達率為59.02%, 色素痣組織中SOX13蛋白陽性表達率為13.11%。CMM組織中SOX13蛋白陽性表達率高于色素痣組織，差異有統計學意義(P<0.05), 見圖1、表2。

A: 色素痣組織中SOX13陰性表達; B: CMM組織中SOX13陽性表達。

2.3 CMM組織中miR-185-5p與SOX13 mRNA的相關性

表2 SOX13蛋白在CMM組織與色素痣組織中的表達

Pearson相關性分析顯示, CMM組織中miR-185-5p與SOX13mRNA表達呈負相關(r=-0.635,P<0.05), 見圖2。生物信息學軟件TargetScan預測發現, miR-185-5p與SOX13存在靶向結合位點，見圖3。

圖2 CMM組織中miR-185-5p與SOX13 mRNA的相關性

圖3 生物信息學軟件TargetScan預測miR-185-5p與SOX13的靶向結合位點

2.4 miR-185-5p、SOX13與CMM臨床病理特征的關系

根據miR-185-5p在CMM組織中表達水平，將CMM患者分為miR-185-5p高表達組(miR-185-5p表達水平≥0.47)31例和miR-185-5p低表達組(miR-185-5p表達水平<0.47)30例。根據SOX13蛋白在CMM組織中的表達結果，將CMM患者分為SOX13陽性表達組36例和SOX13陰性表達組25例。結果發現, miR-185-5p、SOX13表達與浸潤程度和淋巴結轉移有關(P<0.05), 與患者性別、年齡、腫瘤直徑、發病部位和腫瘤分期無關(P>0.05), 見表3。

表3 miR-185-5p、SOX13與CMM臨床病理特征的關系[n(%)]

2.5 Kaplan-Meier生存分析

對所有患者隨訪36個月, Kaplan-Meier生存曲線分析顯示, miR-185-5p高表達組3年生存率為65.55%, miR-185-5p低表達組3年生存率為37.78%, miR-185-5p高表達組3年生存率高于miR-185-5p低表達組，差異有統計學意義(χ2=5.871,P=0.015); SOX13陽性表達組的3年生存率為38.12%, SOX13陰性表達組3年生存率為65.87%, SOX13陽性表達組3年生存率低于SOX13陰性表達組，差異有統計學意義(χ2=5.030,P=0.020), 見圖4。

A: miR-185-5p高表達和miR-185-5p低表達患者累計生存曲線; B: SOX13陰性表達和SOX13陽性表達患者累計生存曲線。

2.6 CMM患者預后影響因素分析

單因素和多因素Cox分析結果顯示，淋巴結轉移、SOX13是CMM患者不良預后的獨立危險因素(P<0.05), miR-185-5p是CMM患者不良預后的保護因素(P<0.05), 見表4。

表4 影響CMM患者預后的單因素和多因素Cox分析結果

3 討 論

miR-185-5p定位于染色體q11.21, 在調控腫瘤細胞增殖、遷移、侵襲、上皮間質轉化、血管生成、腫瘤耐藥性等過程中發揮重要作用[7]。多項研究[8-10]顯示, miR-185-5p在胰腺癌、前列腺癌、非小細胞肺癌等多種腫瘤中低表達。CHEN X G等[11]研究表明，長鏈非編碼RNA UCA1通過靶向miR-185-5p的表達調控Wnt/β-catenin信號通路，抑制黑色素瘤的生長與侵襲。YIN C G等[12]研究表明, miR-185-5p在乳腺癌組織與細胞中呈低表達，與腫瘤直徑、腫瘤分化和淋巴結轉移呈負相關, miR-185-5p可通過調節晚期糖基化終產物特異性受體抑制F-actin聚合并逆轉人乳腺癌細胞的上皮間質轉化。本研究檢測了miR-185-5p在CMM組織中表達，結果發現, CMM組織中miR-185-5p表達水平低于色素痣組織，提示miR-185-5p可能與CMM的發生有關，其機制可能與miR-185-5p參與調控腫瘤細胞的增殖有關。進一步分析顯示, miR-185-5p表達與患者性別、年齡、腫瘤直徑、發病部位和腫瘤分期無關，與浸潤程度和淋巴結轉移有關，提示miR-185-5p可能參與CMM的發生與進展過程。

SOX家族轉錄因子參與調控胚胎發育與細胞生理功能。研究[13]報道,SOX基因家族成員，如SOX2、SOX4與腫瘤的發生有關。SOX13是SOX家族成員之一，參與中樞神經系統發育、糖尿病及膽汁性肝硬化等生理病理過程[14]。SOX13的異常表達還與腫瘤的發生有關，其可促進胰腺癌的侵襲與進展[15]。SOX13在肝癌中表達上調，與肝癌患者的不良預后有關, SOX13參與維持肝癌細胞的癌干樣特性，并在肝癌的發展中發揮關鍵作用[16];SOX13在人胃癌組織中的表達上調，與患者預后相關，且SOX13的表達上調可顯著促進胃癌細胞的增殖[17]。本研究結果顯示, CMM組織中SOX13mRNA表達水平及蛋白陽性表達率高于色素痣組織，且與CMM的浸潤程度和淋巴結轉移有關，提示SOX13可能在CMM發生、發展過程中發揮促癌作用。

本研究還發現, CMM組織中miR-185-5p表達水平與SOX13mRNA表達呈負相關，且生物信息學軟件TargetScan預測發現, miR-185-5p與SOX13存在靶向結合位點，提示miR-185-5p與SOX13可能通過靶向調控關系參與CMM的發生、發展。本研究的Kaplan-Meier生存曲線分析可知, miR-185-5p高表達患者3年生存率高于miR-185-5p低表達患者, SOX13陽性表達患者3年生存率低于SOX13陰性表達患者，提示miR-185-5p、SOX13與CMM患者預后相關。Cox回歸模型分析顯示，淋巴結轉移、SOX13是CMM患者不良預后的獨立危險因素, miR-185-5p是CMM患者不良預后的保護因素，進一步提示miR-185-5p、SOX13可能作為評估CMM患者預后不良的標志物。

綜上所述, CMM組織中miR-185-5p呈低表達, SOX13呈高表達，且均與CMM患者臨床病理特征和預后有關，可能作為CMM潛在的預后標志物，但兩者的具體作用機制需要結合細胞模型或動物模型進行進一步研究。