可切除肝細胞癌患者癌旁肝組織中分泌型簇集蛋白的表達與術后生存預后的相關性

黃 蓉, 樊 斌, 丁 俊

(湖北省恩施土家族苗族自治州中心醫院 肝膽胰脾外科, 湖北 恩施, 445000)

肝細胞癌(HCC)占所有肝癌病例的70%～85%, 是導致腫瘤相關死亡的主要原因[1]。目前，手術切除仍是治愈HCC的主要手段，但約80%的HCC患者在根治性切除術后仍會發生肝內復發, 5年病死率超過50%[2]。原發性HCC復發包括肝內復發和多中心復發，肝內復發主要與腫瘤因素有關，而多中心復發還可能與其他肝臟背景因素有關[3-4]。因此，僅關注腫瘤組織是不夠的，癌旁組織有關分子學改變也可能會直接或間接影響手術后疾病進展。簇集蛋白(CLU)是最初從大鼠睪丸中分離出的一種高度保守的糖蛋白，在人體所有組織中都有表達[5]。事實上,CLU基因可編碼分泌型sCLU蛋白(sCLU)和核sCLU蛋白(nCLU), 而sCLU和nCLU蛋白在腫瘤發生和發展的各個病理生理過程中可能發揮著相反的作用[6-7]。多項研究[6-9]證實了sCLU在各種惡性腫瘤中的預后價值，但結果卻相互矛盾。本研究調查sCLU在可切除HCC患者癌旁肝組織和血清中的表達水平及預后評估作用，現將結果報告如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

本研究是在獲得本院機構審查委員會的批準并在赫爾辛基宣言指導原則下進行的?；颊咴跇颖精@取前簽署了知情同意書，所有患者數據都是匿名的。選取2010年1月—2015年12月在本院肝膽胰脾外科接受治愈性肝切除術的208例HCC患者為研究對象，均獲得血清樣本、切除的腫瘤組織和癌旁肝組織樣本。排除接受過任何術前治療(如化療、乙醇注射或經動脈化療栓塞)的患者。經術后病理組織學檢查證實了原發性HCC診斷。根治性切除定義為宏觀上完全切除腫瘤，組織學檢查陰性。208例患者的平均年齡為(59.0±13.56)歲，其中男162例(77.88%); 126例(60.58%)為乙型肝炎表面抗原(HBsAg)陽性, 63例(30.29%)為抗丙型肝炎病毒(HCV)陽性, 31例(14.90%)有HCC家族史; 中位腫瘤直徑為5.0 cm[四分位距(IQR)為3.5～12.0 cm]; 病理檢查證實微血管侵犯105例(50.48%); 根據美國癌癥聯合委員會(AJCC)/國際癌癥控制聯盟(UICC)第7版腫瘤、淋巴結和轉移(TNM)分期系統[10]對HCC組織進行分類, Ⅰ期54例, Ⅱ期84例, Ⅲ期70例; 84例(40.38%)為肝硬化。因此，大部分患者被診斷為慢性肝病、肝功能異常，平均吲哚菁綠15 min滯留率(ICG-R15)為(14.5±10.8)%(正常為0%～10%)。

1.2 樣本獲取和臨床資料收集

所有患者在手術前禁食≥10 h后采集血液樣本，立即分離血清并存儲于-80 ℃環境中。每個樣本只經歷1次凍融。此外，手術切除后立即獲得組織標本，在液氮中迅速冷凍, 24 h后轉移至-70 ℃環境中保存。前瞻性獲取術前臨床和實驗室數據、切除標本的組織學分析以及術后生存數據。詳細的臨床病理特征包括常規肝臟生化指標、肝炎標志物、血清甲胎蛋白(AFP)水平、腫瘤大小、腫瘤數量和血管浸潤。基于蘇木精-伊紅染色(HE染色)切片檢查進行組織學評估。分析HCC標本、血清中凝聚素表達與重要的臨床病理參數的關系，包括年齡、性別、抗HCV狀態、HBsAg狀態、血清AFP水平、腫瘤大小、腫瘤數量、ICG-R15水平、血清白蛋白水平、血清丙氨酸轉氨酶水平、宏觀/微觀血管浸潤和肝硬化。

1.3 酶聯免疫吸附法(ELISA)測定血清中sCLU水平

采用ELISA試劑盒(捷克BioVendor Laboratory Medicine Inc公司)測定血清sCLU水平。所有樣品和標準品以一式兩份進行評估，并計算平均值。首先將稀釋后的樣品和標準品用移液管移入96孔板中，室溫下孵育2 h后洗滌平板，采用sCLU偶聯物孵育2 h; 然后加入底物溶液并在室溫下孵育30 min, 加入終止液終止反應，在450 nm處通過Spectra Max 250酶標儀(美國Molecular Devices. 公司)讀板。sCLU濃度以μg/mL表示，并通過與參考標準進行比較來評估。

1.4 免疫組化法檢測組織sCLU蛋白表達

將組織標本在4%多聚甲醛中4 ℃固定過夜，并使用自動包埋機包埋在蠟中。此外，樣品通過一系列乙醇梯度脫水(70%、80%、90%、100%)后經氯仿清洗，然后包埋在石蠟中。將再水化的組織切片用檸檬酸鈉緩沖液(10 mmol/L, pH值6.0)微波處理，用3.0% H2O2孵育10 min，封閉液浸泡10 min。將組織切片與sCLU單克隆抗體(克隆B-5, 1∶200稀釋; 美國Santa Cruz Biotechnology公司)在4 ℃的濕室中孵育過夜。此外，將組織切片載玻片用生物素標記的二抗孵育10 min, 然后用鏈霉親和素辣根過氧化物酶結合物再處理10 min, 3, 3′-二氨基聯苯胺底物顯色10 min, Mayer′s蘇木精復染10 min。將載玻片安裝在顯微鏡下評估。采用PBS替代一抗作為陰性對照。評估標準[11]: 陰性(-)為弱染色或未染色, (+)為<10%的腫瘤細胞中觀察到陽性表達，陽性表達≥10%的腫瘤細胞為中度染色()至強染色()。

1.5 統計學分析

2 結 果

2.1 血清sCLU水平與術后生存率的關系

208例HCC患者隨訪時間為2～130個月，中位隨訪時間為58個月; 復發142例(68.27%), 復發時間為38.0個月; 隨訪期間死亡112例(53.85%)。所有患者術前血清sCLU水平為89.11(63.23, 119.47) μg/mL, 且血清sCLU水平與腫瘤分期無相關性; 單因素分析顯示，術前高sCLU水平(≥89.11 μg/mL,n=104)與低sCLU水平(<89.11 μg/mL,n=104)患者的生存期比較，差異無統計學意義(Log-rankχ2=1.815,P=0.178)。見圖1。

A: 不同TNM分期患者血清sCLU水平比較; B: Kaplan-Meier生存曲線。

2.2 HCC和癌旁肝組織中sCLU的免疫組化染色結果

在115例(55.29%)腫瘤組織和81例(38.94%)癌旁肝組織中檢測到sCLU蛋白陽性表達，見圖2。

A: 腫瘤組織,陰性; B: 腫瘤組織,陽性; C: 配對的癌旁肝組織,陰性; D: 配對的癌旁肝組織,陽性。圖2 免疫組化法檢測HCC腫瘤組織和癌旁肝組織中sCLU蛋白表達

2.3 HCC和癌旁肝組織中sCLU的免疫組化染色結果與術后生存率的關系

腫瘤組織中sCLU蛋白表達陽性與陰性患者的無病生存率差異無統計學意義(Log-rankχ2=1.763,P=0.184); 癌旁肝組織中sCLU表達陽性的患者的術后無病生存率低于sCLU表達陰性的患者，差異有統計學意義(Log-rankχ2=9.853,P=0.002)。見圖3。生存分析結果顯示，癌旁肝組織sCLU蛋白表達與腫瘤組織sCLU蛋白表達呈顯著正相關性(rs=0.679,P<0.001)。此外，癌旁肝組織sCLU陽性表達者的腫瘤復發率為81.48%(66/81), 高于陰性表達者的59.84%(76/127), 差異有統計學意義(χ2=10.691,P=0.001)。HCC組織中sCLU陽性表達者的腫瘤復發率為71.30%(82/115), 陰性表達者為64.52%(60/93), 差異無統計學意義(χ2=1.094,P=0.296)。

A: 腫瘤組織sCLU蛋白表達; B: 癌旁肝組織sCLU蛋白表達。

2.4 肝組織中sCLU蛋白表達與患者臨床病理特征的關系

腫瘤組織及癌旁肝組織中, sCLU蛋白陽性表達者血清sCLU水平均高于陰性表達者，差異有統計學意義(P<0.05)。此外，腫瘤組織sCLU蛋白表達與TNM分期有關(P=0.008), 而癌旁肝組織sCLU蛋白表達與其他臨床病理特征無相關性(P>0.05)。見表1。

表1 肝組織sCLU蛋白表達與HCC患者臨床病理特征的關系

2.5 影響HCC患者術后復發的臨床因素

單因素分析顯示，血清AFP>200 ng/mL、血清白蛋白≤4.0 g/dL、多發腫瘤、腫瘤直徑>5 cm、微血管浸潤、TNM分期Ⅱ～Ⅲ期以及癌旁肝組織中sCLU蛋白陽性表達是影響HCC患者術后復發的獨立危險因素(P<0.001)。見表2。

表2 Kaplan-Meier法對術后復發的單因素生存分析[n(%)]

2.6 多因素Cox比例風險模型分析

將重要的協變量從單變量分析進入多因素Cox比例風險模型。結果顯示，血清AFP>200 ng/mL、血清白蛋白≤4.0 g/dL、微血管浸潤、TNM分期Ⅱ～Ⅲ期以及癌旁肝組織sCLU蛋白陽性表達是HCC患者術后無病生存的獨立危險因素(P<0.05)。此外，多發腫瘤、微血管浸潤、TNM分期Ⅱ～Ⅲ期以及癌旁肝組織sCLU蛋白陽性表達亦是影響HCC患者術后總生存的獨立危險因素(P<0.05)。見表3。

表3 無病生存和總生存相關因素的多因素分析結果

3 討 論

本研究評估了HCC患者在腫瘤切除前的血清和切除組織(包括肝癌組織以及鄰近的癌旁肝組織)中sCLU濃度。本研究結果表明，術前血清sCLU水平、HCC腫瘤組織中sCLU蛋白表達情況與可切除HCC患者術后復發無相關性。有趣的是，本研究發現癌旁肝組織中sCLU蛋白陽性表達者較陰性表達者的預后更差。

研究[5]表明, sCLU與腫瘤集落蛋白的特性和腫瘤癌細胞的化學耐藥性相關[9, 12]。sCLU基因是一個單拷貝基因，位于染色體8p21～p12上，由9個外顯子、8個內含子和1個5′-非翻譯區組成，編碼3種不同的人類轉錄異構體。在人體中,sCLU基因可編碼2種蛋白質: sCLU蛋白(75～80 kDa)和nCLU蛋白(55 kDa)[6]。sCLU蛋白的前22個氨基酸代表一個經典的疏水性先導信號序列，這些氨基酸被轉化成一個先導多肽，將蛋白質作用于內質網; 22肽通過蛋白水解過程被去除，產生一個50 kDa的前體，然后在內質網中進一步加工成60 kDa的形式。當蛋白質被轉運到高爾基復合體時，即被糖基化，進一步分裂成2個40 kDa亞基，α 鏈和 β 鏈。然后，這2個亞基組裝成異二聚體絡合物，由5個二硫鍵連接。nCLU是由缺乏外顯子II剪接的mRNA合成的。第一和第三外顯子是拼接在一起的，放置第二幀外顯子III的第2個AUG序列作為翻譯起始位點。nCLUmRNA的翻譯產生了一種約49 kDa 的nCLU前體蛋白，定位于細胞質中，并保持休眠狀態。在全身電離輻射或細胞損傷后, nCLU前體蛋白經過翻譯后修飾產生1個成熟的約55 kDa促凋亡蛋白形式，其具有N端和C端的卷曲螺旋結構域。研究[7, 14]表明, sCLU具有細胞保護作用和抗凋亡作用[6, 13], 而 nCLU蛋白具有促凋亡作用。

sCLU是一種異二聚硫酸化糖蛋白，牽涉到多種生物學功能，包括脂質轉運、衰老、補體級聯、膜循環、細胞黏附和細胞程序性死亡等[5, 13]?；趕CLU在抗凋亡、血管生成和促轉移方面的作用, sCLU被證實與肝癌的進程有關[15-16]。此外，鑒于其良好的診斷和預后表現, sCLU也被推薦為多種癌癥的重要生物標志物[16-20]。AL-MAGHRABI J A等[16]研究發現, CLU在子宮內膜癌組織中表達上調，可作為診斷標志物，但是與疾病復發、生存或任何其他臨床病理參數無明顯相關性。CHEN Q F等[17]也發現乳腺癌患者血清CLU水平顯著高于正常對照組，且與臨床分期高、淋巴結轉移、總生存率和無病生存率低有顯著相關性，提示血清CLU水平可能是診斷和評價乳腺癌化療敏感性的有效指標。有研究[18]稱，通過原位雜交檢測, sCLU在大鼠肝細胞中以低基礎水平表達，在肝細胞生長和促肝細胞分裂素的誘導下, sCLU表達上調。

既往研究[19-20]報道了使用免疫組織化學染色的人腫瘤組織中sCLU細胞質過表達。本研究結果顯示，在癌旁肝組織中有類似的sCLU表達，在HCC組織的腫瘤細胞中有細胞質和額外的微管分泌染色模式。本研究中, 55.29%的HCC組織表達sCLU, 38.94%的癌旁肝組織表達sCLU。本研究對癌旁肝組織中sCLU過表達與各種臨床病理參數進行了比較，結果顯示癌旁肝組織sCLU蛋白表達與肝功能惡化程度無關，因此其表達增加對HCC患者術后預后的影響可能只是與促癌分子機制有關，并不受肝硬化或纖維化的影響。本研究仍存在一些局限性: 本研究為單中心研究，樣本量相對較小; 本研究采用的數據庫主要基于HCC和乙肝病毒感染的患者隊列，應該考慮對HCC和主要HCV感染人群或有酗酒史的人群進行分層研究。

綜上所述，癌旁肝組織中的sCLU表達是與HCC患者術后無病生存和總生存都密切相關的獨立不良預后因素, sCLU在可切除HCC患者癌旁肝組織中表達上調，可作為HCC切除術后預防腫瘤復發的有效靶點。