羊棲菜醇提物中巖藻黃素的檢測*

趙 麗，馮娟娟，張臘梅，朱晴晴

(山東潔晶集團股份有限公司質量管理部，山東 日照 276826)

巖藻黃素(Fucoxanthin)，是存在于褐藻、硅藻、無脊椎海洋動物中的具有含氧多烯烴及共軛結構的脂溶性偏極性類胡蘿卜素[1]，其中以全反式結構為主(見圖1)。

圖1 全反式巖藻黃素結構式

羊棲菜中，巖藻黃素的含量相對較高，有企業已經實現工業規模化生產，但是因巖藻黃素價格較高，市場上冒充品也隨即誕生，主要以玉米黃素冒充品較多。目前，巖藻黃素已被國內外科研結果證實，具有多種生理活性[2-6]。2008年前后，國內就有企業開始以褐藻為原料，進行工業化提取巖藻黃素，推出純度0.5%～5%范圍的巖藻黃素產品，主要用于出口。日本、美國等已經對該產品的安全性毒理學評價，并認可[7-8]。美國FDA已批準巖藻黃素作為新食品補充劑，歐洲、日本、韓國均準許并有市場已流通的產品，應用領域以食品、保健品為主導，輔以化妝品領域，也有部分原料來自中國。國內巖藻黃素產品受檢測方法、產品標準等方面的限制，用于食品的生產許可方面還是空白，這在很大程度上限制和阻礙了巖藻黃素在國內食品等領域的推廣。

利用有機溶劑提取，是目前生產巖藻黃素的主要方法。雖然有研究采用高效液相色譜法(HPLC法)對其含量進行檢測[9-11]，但目前市場上的產品，主要采用紫外分光光度計法(UV法)檢測含量，存在不能消除產品中以玉米黃素為代表的其他類胡蘿卜素混淆巖藻黃素的可能，檢測區分度較小。為了區分以玉米黃素為代表的其他類胡蘿卜素混淆巖藻黃素的情況，同時也進一步為規范市場提供參考，本研究采用薄層層析與HPLC聯合的方法，對羊棲菜醇提物中巖藻黃素進行雙重定性和定量分析。先以巖藻黃素標準品對照進行薄層層析鑒別[12]，若確定產品中含巖藻黃素且不含以玉米黃素為代表的其他類胡蘿卜素，再進一步進行HPLC法二次定性，同時進行含量檢測。本研究不僅可以促進企業合理調整工藝，完善檢測手段，為產品性能提供指導依據，而且還可以更好地促進行業技術升級、產業進步，有利于生產和貿易的發展。同時，在提高巖藻黃素產品質量的美譽度以及市場的認可度，促進商品流通和維護公平競爭等方面發揮積極的作用。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

羊棲菜醇提物由山東潔晶集團股份有限公司生產；巖藻黃素標準品(純度w≥95.0%)購于美國Sigma公司；玉米黃素標準品(純度w≥85%)購于上海源葉生物科技有限公司；分析純乙醇、優級純正己烷、色譜純乙腈、色譜純甲醇，購于國藥集團化學試劑有限公司；分析純丙酮，購于煙臺遠東精細化工有限公司；實驗用水為自制超純水。

1.2 儀器設備

SB-800DTD超聲波清洗機(寧波新芝生物科技股份有限公司)；AR124CN電子天平(奧豪斯儀器上海有限公司)；P-I型薄層色譜展開缸(上海信誼儀器廠有限公司)；硅膠G薄層板(青島勝海精細硅膠化工有限公司)；高效液相色譜儀(配二極管陣列檢測器)(美國Waters公司)；C18色譜柱(φ4.6 mm×150 mm，5 μm)(美國Waters公司)；Exceed-Cc-100艾柯實驗室超純水機(成都艾柯水處理設備有限公司)

1.3 實驗方法

1.3.1 巖藻黃素的薄層色譜鑒定

1)標準品及樣品溶液的配制

取巖藻黃素標準品、玉米黃素標準品各 1 mg，分別加入試管中并加入適量乙醇；超聲使之完全溶解，分別轉移至 5 mL 容量瓶中；加乙醇配制成質量濃度為 1 mg/mL 的溶液，避光保存。取試樣 0.1 g，于試管中，加入適量乙醇，超聲使之完全溶解，轉移至 5 mL 容量瓶中定容，避光保存。

2)薄層色譜操作

分別吸取對照品溶液、試樣溶液各 5 μL，點樣于硅膠G薄層板上。將點好的薄層板放入展開缸中，進入展開劑的深度為距原點 5 mm 為宜，密閉。在正己烷-丙酮(體積比6.5∶3.5)展開劑中，展開距離約 8 cm，取出薄層板，標記展開劑前沿位置，晾干后檢測。整個實驗過程要求在 1 h 內完成。

3)薄層色譜結果判定

置可見光下檢視，與巖藻黃素標準品進行對照，試樣色譜相應的位置上顯示相同顏色的斑點，呈黃色或黃棕色。與玉米黃素標準品對照色譜相應的位置上無斑點。按照中國藥典中的薄層色譜方法[13]計算比移值Rf，且試樣比移值和巖藻黃素標準品比移值相差范圍應在3%以內。

1.3.2 巖藻黃素含量的高效液相色譜法檢測

1)標準品及樣品溶液的配制

將巖藻黃素標準儲備溶液用乙腈逐級稀釋，配制成質量濃度為0.0、0.1、0.2、0.5、2.0、5.0、10.0 mg/L 的巖藻黃素標準溶液。分別取上述溶液經濾膜過濾至液相瓶中待測。

根據樣品目標含量的不同，準確稱取待測樣 0.02～0.06 g(精確至 0.0001 g)，加入少量乙醇，放入超聲波清洗儀中超聲 5 min 使其溶解充分，樣品用乙醇定容至 100 mL 棕色容量瓶中，超聲脫氣、經濾膜過濾至液相進樣瓶中待測。

2) 高效液相色譜條件

色譜柱：C18色譜柱，φ4.6 mm×150 mm，5 μm；柱溫：25 ℃；流速：0.8 mL/min；流動相：溶劑A：乙腈(80%)；溶劑B：純水(20%)；紫外檢測器：波長 450 nm；進樣體積：10 μL；外標法定量。

2 結果與分析

2.1 羊棲菜醇提物中巖藻黃素的薄層色譜鑒定

經過多次試驗驗證：巖藻黃素Rf值范圍在0.40～0.49之間，而玉米黃素Rf值大于0.5。玉米黃素的比移值相對于巖藻黃素標準品及樣品偏高，能夠明顯區分開來，如圖2。圖2中，自左到右分別為：玉米黃素標準品、巖藻黃素標準品、羊棲菜醇提物樣品、羊棲菜醇提物樣品平行。樣品比移值和巖藻黃素標準品比移值相差范圍均在2%～3%之間。

1.玉米黃素標準品；2.巖藻黃素標準品；3.羊棲菜醇提取物；4.羊棲菜醇提物。圖2 玉米黃素、巖藻黃素標品及樣品薄層色譜日光圖

2.2 羊棲菜醇提物中巖藻黃素的HPLC檢測

2.2.1 方法線性范圍

將巖藻黃素標準儲備溶液使用乙腈逐級稀釋，配制成質量濃度為 0.0、0.1、0.2、0.5、2.0、5.0、10.0 mg/L 的標準系列工作溶液，上機測定，在此范圍內巖藻黃素標準溶液質量濃度與響應值呈線性相關，線性方程為y=195.25x+4.1548，相關系數為0.9998，線性回歸曲線見圖3。由圖3知，在實驗質量濃度范圍內，質量濃度與峰面積線性關系良好。巖藻黃素系列標準溶液色譜圖見圖4。

圖3 巖藻黃素濃度與峰面積的線性回歸關系 圖4 巖藻黃素對照品色譜圖

2.2.2 檢出限、定量限

檢出限：將巖藻黃素標準溶液稀釋至3倍信噪比附近，重復驗證6次，得出儀器3倍信噪比所對應的檢出限質量濃度為 0.025 mg/L。定量限：將提取后的樣品待測液稀釋至低質量濃度水平，使該質量濃度水平信噪比接近10，重復驗證6次，得出褐藻油樣品定量限為 20 mg/kg，褐藻粉末樣品定量限為 200 mg/kg。

2.2.3 樣品測定

羊棲菜醇提物6次平行樣品中巖藻黃素含量測定結果平均為 531 mg/kg，精密度相對標準偏差為1.1%，6次平行樣品中巖藻黃素質量分數結果見表1，色譜圖見圖5。在 11.4 min 左右出目標峰，表明方法的專屬性良好。

表1 樣品巖藻黃素測定結果

圖5 樣品色譜圖

2.2.4 加標回收率

樣品定量限以及樣品含量選擇三個加標水平分別為100、200 和 400 mg/kg，每個加標水平做6次平行測試，加標回收率結果見表2。加標水平在 100～400 mg/kg 范圍內時，回收率在97.5%～99.3%。

表2 樣品回收率實驗檢測結果

3 結論

本文采用薄層色譜和高效液相色譜聯合的方法，對羊棲菜醇提物中巖藻黃素進行了雙重定性和定量分析。首先定性檢測，確保產品中不含以玉米黃素為代表的其他類胡蘿卜素；定性確認后，再經過高效液相色譜法進行定量檢測。定量操作準確、回收率高、重復性好，為評價實驗室提取的以及企業生產的羊棲菜醇提物的質量以及規范市場提供依據。本文也可作為其他原料所提取的巖藻黃素及其加工產品中巖藻黃素含量的定性、定量檢測提供參考。