苦蕎愈傷遺傳轉化體系的優化及用于FtCHS1的過表達分析

趙海霞，肖欣，董玘鑫，吳花拉，李成磊，吳琦

苦蕎愈傷遺傳轉化體系的優化及用于的過表達分析

趙海霞，肖欣，董玘鑫，吳花拉，李成磊，吳琦

四川農業大學生命科學學院，四川雅安 625014

【】建立和優化苦蕎愈傷組織遺傳轉化體系，為苦蕎基因功能驗證及分子育種提供研究工具。以苦蕎品種“西蕎二號”為材料，對苦蕎愈傷遺傳轉化條件進行優化，包括苦蕎外植體類型、誘導愈傷的激素比例、繼代培養基的激素比例及農桿菌類型。利用苦蕎類黃酮生物合成關鍵酶基因的過表達驗證優化后的遺傳轉化體系。通過PCR篩選和熒光觀察鑒定陽性株系，采用紫外分光光度法和高效液相色譜法（high performance liquid，HPLC）測定花青素及黃酮醇支路代謝物含量，使用實時熒光定量PCR分析類黃酮合成相關基因的表達，比較過表達愈傷組織與對照組的差異。苦蕎誘導愈傷組織的最佳外植體為下胚軸，其最適誘導培養基為MS+0.8 mg·L-16-BA+3.5 mg·L-12,4-D，誘導率達72%；最優繼代培養基為MS+3 mg·L-16-BA+1 mg·L-1KT，愈傷組織增殖率與增殖系數分別為98%和1.09；轉化過程中的最佳農桿菌是GV3101，轉化效率達31.3%；過表達愈傷組織中，花青素、蘆丁和楊梅素的含量顯著高于對照（＜0.05），山奈酚和槲皮素的含量極顯著高于對照組（＜0.01）；外源的過表達對轉基因愈傷組織中5個內源同源基因的表達水平沒有影響（＞0.05），而、、、、和等黃酮合成途徑關鍵酶基因均上調表達（＜0.05）。此外，特異性正調控黃酮醇合成的轉錄因子基因和上調表達，而花青素合成抑制子基因的表達降低（＜0.05）。建立了苦蕎愈傷組織遺傳轉化體系，過表達的苦蕎愈傷組織通過上調黃酮合成相關基因的表達增加類黃酮物質的積累。

苦蕎；愈傷組織；遺傳轉化；查爾酮合酶基因

0 引言

1 材料與方法

1.1 植物材料及生長條件

苦蕎品種“西蕎二號”由西昌學院王安虎教授惠贈。用75%酒精和0.1%氯化汞消毒苦蕎種子，置于1/2 MS培養基（0.7%瓊脂、2.37 g·L-1MS和3%蔗糖，pH=5.8）上，在光照培養箱中培養10—12 d（光照培養12 h，暗培養12 h，光照強度2.0 klx，25℃），獲得苦蕎幼苗。

1.2 苦蕎愈傷組織的誘導

選擇生長良好的苦蕎幼苗子葉和下胚軸（距子葉節及根各1 cm的中段部分）作為外植體，子葉/下胚軸切成0.5 cm×0.5 cm小片/0.5 cm小段，置于25種不同激素配比的MS培養基（MS+0.2—1.0 mg·L-16-BA+2.0—4.0 mg·L-12,4-D）上誘導愈傷組織（電子附表1），共5個重復，每個重復10個外植體，并于第10天統計誘導率。成功誘導愈傷組織后，置于9種繼代培養基（MS+2.0—4.0 mg·L-16-BA+1.0—3.0 mg·L-1KT）上培養（電子附表1），共3個重復，每個重復20個愈傷組織，觀察其生長增殖情況，于第25天統計增殖率和增殖系數。上述試驗均在光照16 h/黑暗8 h，25℃條件下進行。

愈傷組織誘導率=愈傷組織形成數/所有外植體×100%；

愈傷組織增殖率=可增殖的愈傷組織總數/所有愈傷組織×100%；

增殖系數=增殖后重量/增殖前重量。

1.3 菌液的制備及侵染

為了探究不同種類根癌農桿菌對轉化率的影響，分別以根癌農桿菌株系GV3101和C58C1侵染外植體。將根癌農桿菌（已轉入pCHF3-YFP質粒）在含80 mg·L-1抗生素（利福平/壯觀霉素）的YEB固體培養基（1.5%瓊脂），28℃黑暗養2 d。根據pCHF3-YFP載體MCS兩端序列設計引物MYFP-F/MYFP-R（電子附表2），通過菌落PCR鑒定陽性克隆。將單一陽性農桿菌菌株接種于20 mL YEB液體培養基中，添加80 mg·L-1抗生素（利福平/壯觀霉素），28℃振蕩（180 r/min）培養。當根癌農桿菌OD600=1.5時，取1 mL菌液，置于添加80 mg·L-1抗生素（利福平/壯觀霉素）50 mL YEB液體培養基中擴培至OD600=0.6。擴培后的農桿菌菌液離心（4 000 r/min）5 min，用1/2 MS液體培養基（含200 mmol·L-1乙酰丁香酮）重懸至OD600=0.3。用重懸菌液侵染苦蕎子葉/下胚軸20 min，將外植體置于濾紙上，30 s吸干侵染液，移至MS愈傷誘導培養基，25℃黑暗培養3 d。后用無菌水（含300 mg·L-1頭孢噻肟）清洗子葉/下胚軸3—5次，濾紙吸干多余水分，置于MS愈傷誘導培養基（含300 mg·L-1頭孢噻肟）培養10 d。

1.4 陽性愈傷組織的篩選及鑒定

將誘導出的愈傷組織移至MS繼代培養基（含50 mg·L-1卡那霉素）培養，無菌培養30 d，其間每隔15 d更換培養基，并淘汰褐化愈傷組織。待愈傷組織直徑達3—5 cm時，通過CTAB法提取苦蕎愈傷組織的基因組DNA[18]。使用特異性引物MYFP-F/ MYFP-R通過PCR鑒定陽性愈傷組織（電子附表1）。同時，在藍色激發光（420—485 nm）條件下，通過熒光顯微鏡（奧林巴斯BX53）觀察愈傷組織的YFP信號。

轉化率=陽性愈傷組織數/所有外植體×100%。

如圖3所示，LPS刺激能顯著造成Caco-2細胞中MLCK 的轉錄水平升高(p＜0.05)。而辣木多肽能夠抑制模型細胞中MLCK的轉錄水平。與模型組相比，高濃度(100 μg/mL和150 μg/mL)的辣木多肽可顯著抑制MLCK的 mRNA轉錄水平(抑制率分別為 28.0%和31.3%)。肌球蛋白輕鏈激酶(MLCK)能夠通過促肌球蛋白輕鏈(MLC)的磷酸化使其參與肌動蛋白收縮，引發細胞骨架重排，破壞細胞TJ結構，最終造成細胞間通透性增高[21]。抑制腸上皮細胞中MLCK的過度活化，對于維持腸上皮細胞屏障和細胞間緊密連接的重要作用[22]。

1.5 苦蕎過表達FtCHS1愈傷組織的制備

基于苦蕎基因組和轉錄組數據[2]，設計特異性引物（FtCHS1-F-KpnⅠ/FtCHS1-R-ScalⅠ），以苦蕎葉cDNA為模板，通過RT-PCR擴增獲得（）的開放閱讀框（open reading frame，ORF，電子附表2），并將其克隆到pCHF3-YFP質粒中。參照1.3方法，使用含有pCHF3--YFP質粒的根癌農桿菌侵染下胚軸，并參照1.4方法鑒定陽性愈傷組織。含有空白/空載體（pCHF3-YFP）根癌農桿菌作為試驗對照組。

1.6 HPLC法測定愈傷組織中黃酮醇含量

將苦蕎愈傷組織（1 g）經液氮冷凍10 min，研磨成細粉。用50 ml甲醇萃取2次，4℃保存24 h。60℃干燥后，加入10 mL甲醇，用0.45 μm有機濾膜過濾收集濾液，并加入2倍體積的甲醇稀釋。使用安捷倫1260型高效液相色譜儀（長沙科美分析儀器有限公司），采用高效液相色譜法（high performance liquid chromatography，HPLC）分析槲皮素、山奈酚、楊梅素和蘆丁等黃酮醇的含量，色譜柱為C18（250×4.6 mm，5 μm），柱溫30℃，檢測波長為260 nm，進樣體積為20 μL，流速為1 mL·min-1。流動相A為乙腈，流動相B為水。梯度洗脫條件為0—20 min，乙腈從40%逐步上調至65%，水從60%逐步下調至35%。槲皮素、山奈酚、楊梅素和蘆丁的標品購自南京源植生物技術有限公司。

1.7 愈傷組織中花青素的測定

將新鮮愈傷組織液氮冷凍研磨成粉，取2 g粉末溶于10 mL酸性甲醇（1%鹽酸，v/v）。100 r/min，25℃黑暗振蕩18 h。4℃12 000 r/min離心15 min后，取5 mL上清液轉移到新離心管中。加入5 mL去離子水和3 mL氯仿，4℃ 9 000 r/min離心5 min，取5 mL上清液轉移到新離心管中。測定樣品530和657 nm吸光值。計算公式如下：花青素含量＝（A530－0.25×A657）×M-1（A530為530 nm吸光值，A657為657 nm吸光值，M單位為g），每個樣品3個獨立生物學重復。

1.8 愈傷組織中類黃酮合成相關基因的表達量測定

使用RNeasy Plant Mini試劑盒（Aidlab Biotech，Beijing，China）提取苦蕎愈傷組織總RNA，使用ReverTra Ace（Toyobo，Osaka，Japan）反轉錄為cDNA。利用實時熒光定量PCR測定類黃酮合成及其調節基因的表達水平，包括5個苦蕎FtCHSs同源基因（、、、和、（GenBank：KF831243）、（GenBank：JF274262）、（GenBank：JX401285）、（GenBank：KJ094503）、（GenBank：GU169468）、（GenBank：LC216399）、（GenBank：MK128409)[19]、[20]和[21]（GenBank：MT333222.1）。使用Premier5軟件設計上述基因引物，管家基因（GenBank：HM628903）作為內參基因（電子附表2）。使用SYBR Premix EX Taq試劑盒（TaKaRa，Japan）及CFX Connect系統進行qRT-PCR。反應條件為95℃ 3 min；95℃ 15 s，60℃ 15 s，72℃ 20 s，40個循環。使用2?ΔΔCT法進行數據分析。

2 結果

2.1 不同激素組合及不同外植體對苦蕎愈傷組織誘導率的影響

參考之前報道的方法[22]，以25種不同激素組合誘導苦蕎下胚軸和子葉產生愈傷組織（圖1）。處理組C19（MS+0.8 mg·L-16-BA+3.5 mg·L-12,4-D）、C20（MS+0.8 mg·L-16-BA+4 mg·L-12,4-D和C22（MS+1 mg·L-16-BA+2.5 mg·L-12,4-D）可獲得更多的愈傷組織（＜0.05），愈傷組織誘導率分別達到72%、66%和66%（圖1）。與下胚軸相比，苦蕎子葉的誘導率更低（0—6%）。

以上結果表明，下胚軸是苦蕎愈傷組織誘導的最佳材料，故下胚軸被用于后續試驗。上述3種處理均可用于確定不同農桿菌菌株對愈傷組織誘導的影響。

C1—C25：25種不同愈傷誘導激素組合（電子附表1）；不同字母代表差異顯著（P＜0.05），誤差棒表示±SDs。下同

2.2 苦蕎愈傷組織繼代培養

為了獲得足夠的愈傷組織材料進行后續試驗，設置S1—S9共9組添加了不同激素配比的培養基進行愈傷組織的繼代培養[9]（電子附表1）。繼代培養5 d后，整個愈傷組織開始膨脹（圖2-A）。繼代25 d后統計增殖率及增殖系數。結果表明，處理組S4在繼代培養25 d后具有最高的增殖率（98%）和增殖系數（1.09），其余各組增殖系數和增殖率顯示出相同的變化趨勢（圖2-B和圖2-C）。由此可知，處理組S4（MS+3 mg·L-16-BA+1 mg·L-1KT）所用激素組合是愈傷組織繼代培養的最佳配比。

2.3 不同根癌農桿菌對愈傷組織誘導的影響

含pCHF3-YFP質粒的2種根癌農桿菌菌株GV3101和C58C1用于苦蕎下胚軸侵染，使用處理組C19、C20和C22的激素組合對侵染過的外植體進行愈傷誘導并在處理組S4的條件下繼代篩選（電子附表1）。結果顯示，在6個處理中，農桿菌GV3101侵染下胚軸的轉化率最高，達31.3%，且侵染后的下胚軸色澤健康呈淡黃色（圖3-A）。農桿菌C58C1侵染過的下胚軸，則表現出較低的轉化率（16%—24%），下胚軸產生明顯褐化（圖3-A和圖3-B）。

A：在繼代培養處理組S4條件下培養5和25 d的愈傷組織；B：不同繼代條件下的愈傷組織增殖率；C：不同處理后的愈傷組織增殖系數。S1—S9：9種不同繼代激素組合（電子附表1）

A：農桿菌GV3101/C58C1侵染下胚軸7 d后表型；B：C19、C20和C22 3種處理下的轉化率

因此，選擇農桿菌GV3101作為苦蕎外植體侵染菌株，以處理組C19誘導條件誘導愈傷組織，在處理組S4條件下繼代可作為遺傳轉化體系的優化方案。

2.4 苦蕎FtCHS1的克隆及轉基因苦蕎愈傷組織的獲得

從苦蕎葉cDNA中擴增出約1.2 kb的ORF（已去除終止密碼子），構建植物表達載體pCHF3--YFP（圖4-A）。用含有pCHF3--YFP質粒的農桿菌GV3101侵染下胚軸，在C19（3.5 mg·L-12,4-D+0.8 mg·L-16-BA）條件下培養7 d，其中，轉基因組在愈傷組織誘導階段呈現明顯的紅色（圖4-B）。當愈傷組織直徑達3—5 cm時，采用特異性PCR引物（MYFP-F/MYFP-R）鑒定7個株系，結果均為陽性（圖4-C）。在熒光顯微鏡下，與對照組相比，試驗組呈現明顯的黃色熒光（圖4-D）。經熒光定量PCR檢測外源的表達水平，篩選出表達量最高的＃1、＃3和＃6等3個株系用于后續試驗（圖4-F）。在繼代培養期間，試驗組和對照組之間的增殖率無明顯差異（圖4-E，＞0.05），但后15 d轉基因愈傷組織的增殖系數高于對照組（圖4-G）。

A：pCHF3-FtCHS1-YFP結構圖；B：GV3101農桿菌侵染下胚軸侵染5 d后表型，#1、#2和#3為不同株系；C：轉基因愈傷組織的PCR鑒定；D：愈傷組織熒光檢測；E：不同愈傷組織增殖率；F：轉基因愈傷組織和對照組愈傷組織中FtCHS1表達量；G：繼代培養0—5 d、10—15 d、15—20 d和20—25 d愈傷組織增殖系數。**P＜0.01；*P＜0.05。下同

2.5 過表達FtCHS1對苦蕎黃酮含量的影響

為了確定過表達對愈傷組織中類黃酮含量的影響，測定黃酮醇和花青素的積累情況。結果表明，在轉基因愈傷組織中，槲皮素和山奈酚含量極顯著高于對照組（＜0.01），蘆丁和楊梅素含量也較對照組有所增加（＜0.05，圖5-A）。此外，所有陽性株系中的花青素含量也比對照組高約40%（＜0.05，圖5-B）。

A：轉基因愈傷組織中黃酮醇（蘆丁、山奈酚、槲皮素和楊梅素）含量的測定；B：測定轉基因愈傷組織中花青素含量

2.6 過表達FtCHS1對苦蕎黃酮合成相關基因的影響

基于熒光定量PCR的基因表達水平分析，表明過表達的外源對其同源基因的表達沒有顯著影響（＞0.05，圖6-A），但影響了其他黃酮合成相關基因的表達。其中，黃酮醇合成支路關鍵酶基因和的表達水平顯著高于對照組（＜0.01），、3和花青素支路的表達也顯著上調（＜0.05），但的表達卻被下調（＜0.05，圖6-B）。此外，還對歸屬轉錄因子R2R3-MYB家族SG7亞組中的黃酮醇特異性正轉錄因子基因和的表達均顯著上調增加（＜0.05，＜0.01），而歸屬SG4亞組中花青素抑制性轉錄因子基因的表達顯著下調（＜0.05，圖6-C）。說明從轉錄水平上支持了過表達轉基因愈傷組織中黃酮含量的變化結果。

3 討論

3.1 建立苦蕎愈傷遺傳轉化體系的重要性

苦蕎富含黃酮且耐貧瘠，是研究黃酮代謝分子機制及逆境響應的理想植物。因此，利用苦蕎基因開展相關研究的報道并不少見，如、和等的異位表達可調控煙草或擬南芥中類黃酮的合成[5, 19-20]，、及等基因轉入擬南芥后增強了其對干旱和鹽的耐受性[6, 23-24]。但此類研究多在異源植物中進行，難以反映這些基因在苦蕎中的真實生物學效應。因此，回歸苦蕎進行基因功能驗證，一直是苦蕎研究工作者所急于攻克的難點，而建立穩定的遺傳轉化體系就是突破的關鍵。得益于毛狀根技術的發展，基于毛狀根的遺傳轉化體系逐漸成為研究苦蕎基因的常用工具[25-27]。但毛狀根分化潛力低，難以據此獲得完整植株。而愈傷組織作為一種具有多能性或全能性的細胞團，較毛狀根而言更具分化潛力，以此建立遺傳轉化體系，不僅回歸了本植物，還可降低后續轉基因植株獲取難度。

3.2 影響苦蕎愈傷組織遺傳轉化的因素

本研究優化了苦蕎愈傷組織的遺傳轉化條件。苦蕎下胚軸的愈傷組織誘導率高于子葉，這與前人研究相符[28]。激素配比是誘導愈傷組織形成的關鍵，不同苦蕎品種對激素的敏感程度可能存在差異，從而導致不同苦蕎品種的最佳愈傷組織誘導激素組合不同[29]。本研究以苦蕎“西蕎二號”下胚軸為外植體時，在MS培養基中添加0.8 mg·L-16-BA及3.5 mg·L-12,4-D時，可達到最佳的誘導效果，繼代培養基里6-BA與KT含量分別為3和1 mg·L-1時，愈傷組織增殖效果最好，有別于前人報道的九江苦蕎及園子蕎[11, 28]。此外，不同農桿菌菌株會根據目標植物種類的不同，表現出不同的毒性強弱，從而導致侵染效率的差異[30]。例如，小果咖啡中GV3101菌株侵染效率高于LBA4404菌株[31]，蘋果中EHA101菌株侵染效率優于LBA4404菌株和C58C1菌株[32]。本研究結果顯示，GV3101菌株相較于C58C1菌株侵染效率更高，更適于苦蕎的遺傳轉化。綜上所述，本研究初步建立了穩定的苦蕎愈傷組織遺傳轉化體系，并成功獲得了過表達的陽性苦蕎轉基因愈傷組織。此外，先前的研究表明愈傷組織的再分化需要外源激素誘導，6-BA與IAA、NAA和KT的多種組合添加到分化培養基里可誘導苦蕎愈傷組織芽的產生[10-11, 28]。但適用于本研究遺傳轉化體系的分化培養基還需進一步探索。

A：FtCHSs基因；B：類黃酮代謝分支酶基因；C：SG7亞家族轉錄因子基因和SG4類亞家族轉錄因子基因

A: FtCHSs gene; B: flavonoid metabolic branch enzyme genes; C: SG7 subfamily transcription factors genes and SG4-like gene subfamily transcription factor

圖6 過表達愈傷組織中黃酮合成相關基因的表達量分析

Fig. 6 Expression analysis of flavonoid synthesis related genes in overexpressedcallus

3.3 FtCHS1促進類黃酮積累的機制

查爾酮合酶作為植物類黃酮合成途徑中的第一個關鍵酶，在黃酮類化合物合成起重要作用[33-34]。本研究中，過表達轉基因愈傷組織均增加了黃酮醇和花青素含量，、、和等其他黃酮合成途徑酶基因也在轉錄水平顯著增強，表明的過表達可以可通過調節上游代謝流量來促進下游黃酮醇和花青素的生物合成。查爾酮合酶基因的轉錄活性通常由轉錄因子調節，尤其是R2R3-MYB轉錄因子家族[35-36]。本研究表明，過表達還可以反向影響相關R2R3-MYB基因的表達水平，即分別上調正控黃酮醇合成SG7亞家族成員和下調負控花青素合成SG4亞家族成員的表達[21-22]。可見，過表達可能對苦蕎黃酮代謝具有更為復雜的生物學效應，有待進一步深入解析。

4 結論

通過對苦蕎愈傷組織遺傳轉化體系條件的優化，建立了穩定有效的轉基因苦蕎愈傷組織誘導體系。過表達的愈傷組織可以通過調節類黃酮相關基因的表達來促進黃酮醇和花青素的積累。

[1] ZHANG L J, LI X X, MA B, GAO Q, DU H, HAN Y H, LI Y, CAO Y H, QI M, ZHU Y X, LU H W, MA M C, LIU L L, ZHOU J P, NAN C H, QIN Y J, WANG J, CUI L, LIU H M, LIANG C Z, QIAO Z J. The tartary buckwheat genome provides insights into rutin biosynthesis and abiotic stress tolerance. Molecular Plant, 2017, 10(9): 1224-1237.

[2] ZHANG X M, ZHAO L, LARSON-RABIN Z, LI D Z, GUO Z H, NITABACH M N.sequencing and characterization of the floral transcriptome of(Poaceae: Bambusoideae). Plos One, 2012, 7(8): e42082.

[3] GAO F, YAO H P, ZHAO H X, ZHOU J, LUO X P, HUANG Y J, LI C L, CHEN H, WU Q. Tartary buckwheat FtMYB10 encodes an R2R3-MYB transcription factor that acts as a novel negative regulator of salt and drought response in transgenic. Plant Physiology and Biochemistry, 2016, 109: 387-396.

[4] ZHOU H, WANG K L, WANG F R, ESPLEY R V, REN F, ZHAO J N, OGUTU C, HE H P, JIANG Q, ALLAN A C, HAN Y P. Activator- type R2R3-MYB genes induce a repressor-type R2R3-MYB gene to balance anthocyanin and proanthocyanidin accumulation. New Phytologist, 2018, 221(4): 1919-1934.

[5] YAO P F, ZHAO H X, LUO X P, GAO F, LI C L, YAO H P, CHEN H, PARK S U, WU Q.FtWD40 functions as a positive regulator of anthocyanin biosynthesis in transgenic tobacco.Journal of Plant Growth Regulation, 2017, 36(3): 755-765.

[6] Lü B B, WU Q, WANG A H, LI Q, DONG Q X, YANG J J, ZHAO H X, WANG X L, CHEN H, LI C L. A WRKY transcription factor, FtWRKY46, from tartary buckwheat improves salt tolerance in transgenic. Plant Physiology and Biochemistry, 2020, 147: 43-53.

[7] Yamane Y. Induced differentiation of buckwheat plants from subcultured calluses. Japanese Journal of Genetics, 1974, 49(3): 139-146.

[8] LEE S Y, KIM Y KY, UDDIN M R, PARK N I, PARK S U. An efficient protocol for shoot organogenesis and plant regeneration of buckwheat (Moench.). Romanian Biotechnological Letters, 2009, 14(4): 4524-4529.

[9] Kwon S J, Han M H, Huh Y S, Roy S K, Lee C W, Woo S H. Plantlet regeneration via somatic embryogenesis from hypocotyls of common buckwheat (Moench.). Korean Journal of Crop Science, 2013, 58(4): 331-335.

[10] HAN M H, KAMAL A H, HUH Y S, JEON A Y, BAE J S, CHUNG K Y, LEE M S, PARK S U, JEONG H S, WOO S H. Regeneration of plantlet via somatic embryogenesis from hypocotyls of tartary buckwheat (). Australian Journal of Crop Science, 2011, 5(7): 865-869

[11] HOU S Y, SUN Z X, HU B L, WANG Y G, HUANG K S, XU D M, HAN Y H. Regeneration of buckwheat plantlets from hypocotyl and the influence of exogenous hormones on rutin content and rutin biosynthetic gene expression. Plant Cell Tissue and Organ Culture, 2015, 120(3): 1159-1167.

[12] Jovanka M D, Mirjana N, Slavica N, Radomir C. Agrobacterium-mediated transformation and plant regeneration of buckwheat (Moench.). Plant Cell Tissue & Organ Culture, 1992, 29(2): 101-108.

[13] KOJIMA M, ARAI Y, IWASE N, SHIROTORI K, SHIOIRI H, NOZUE M. Development of a simple and efficient method for transformation of buckwheat plants () using. Bioscience Biotechnology & Biochemistry, 2000, 64(4): 845-847.

[14] KIM H S, KANG H J, LEE Y T, LEE S Y, KO J A, RHA E S. Direct regeneration of transgenic buckwheat from hypocotyl segment by agrobacterium-mediated transformation. Korean Journal of Crop Science, 2001, 46(5): 375-379.

[15] Chen L H, Zhang B, Xu Z Q. Salt tolerance conferred by overexpression ofvacuolar Na(+)/H(+) antiporter gene AtNHX1 in common buckwheat (). Transgenic Research, 2008,17(1): 121-132.

[16] 豐明, 陳慶富, 葛維德, 薛仁風. 抗旱調控基因DREB2A轉化遼蕎5號的研究. 東北農業科學, 2019, 44(4): 29-36.

FENG M, CHEN Q F, GE W D, XUE R F. Research on the drought-resistant regulatory genes DREB2A transforming the ‘Liao 5 Buckwheat’. Journal of Northeast Agricultural Sciences, 2019, 44(4): 29-36. (in Chinese)

[17] 李占旗. 苦蕎離體再生體系的建立和遺傳轉化研究[D]. 西安: 西北大學, 2007.

LI Z Q. Establishment of plant regeneration system and genetic transformation of tartary buckwheat[D]. Xian: Northwest University, 2007. (in Chinese)

[18] SUN X M, CHEN X, DENG Z X, LI Y D. A CTAB-assisted hydrothermal orientation growth of ZnO nanorods. Materials Chemistry & Physics, 2003, 78(1): 99-104.

[19] HUANG Y J, WU Q, WANG S, SHI J Q, DONG Q X, YAO P F, SHI G N, XU S X, DENG R Y, LI C L, CHEN H, ZHAO H X. FtMYB8 from tartary buckwheat inhibits both anthocyanin/proanthocyanidin accumulation and marginal trichome initiation. BMC Plant Biology, 2019, 19(1): 263.

[20] 高飛. 苦蕎光應答轉錄因子FtMYB5對黃酮合成的調控[D]. 成都: 四川農業大學, 2017.

GAO F. Tartary buckwheat light-induced transcription factor FtMYB5 involved in flavonoid biosynthesis regualtion[D]. Chengdu: Sichuan Agricultural University, 2017. (in Chinese)

[21] YAO P E, HUANG Y J, DONG Q X, WAN M, WANG A H, CHEN Y W, LI C L, WU Q, CHEN H, ZHAO H X. FtMYB6, a Light-Induced SG7 R2R3-MYB transcription factor, promotes flavonol biosynthesis in tartary buckwheat (). Journal of Agricultural and Food Chemistry, 2020, 68(47): 13685-13696.

[22] 王成龍. 苦蕎毛狀根的誘導及高頻再生體系的建立[D]. 成都: 四川農業大學, 2015.

WANG C L. Induction hairy roots and established high-frequency plant regeneration system tartary buckwheat (Gaertn.) [D]. Chengdu: Sichuan Agricultural University, 2015. (in Chinese)

[23] 王官鳳, 呂兵兵, 王安虎, 趙海霞, 王曉麗, 吳琦, 陳惠, 李成磊. 苦蕎抗旱相關轉錄因子基因FtWRKY10的克隆及功能鑒定. 農業生物技術學報, 2020, 28(4): 629-644.

WANG G F, Lü B B, WANG A H, ZHAO H X, WANG X L, WU Q, CHEN H, LI C L. Cloning and functional identification of drought resistance related transcription factor gene FtWRKY10 from tartary buckwheat (). Journal of Agricultural Biotechnology, 2020, 28(4): 629-644. (in Chinese)

[24] LI Q, WU Q, WANG A H, LV B B, DONG Q X, YAO Y J, WU Q, ZHAO H X, LI C L, CHEN H, WANG X L. Tartary buckwheat transcription factor FtbZIP83 improves the drought/salt tolerance ofvia an ABA-mediated pathway. Plant Physiology and Biochemistry, 2019, 144: 312-323.

[25] 伍小方, 高國應, 左倩, 趙輝, 張凱旋, 嚴明理, 周美亮. FtMYB1轉錄因子調控苦蕎毛狀根黃酮醇合成的機理研究. 植物遺傳資源學報, 2020, 21(5): 1270-1278.

WU X F, GAO G Y, ZUO Q, ZHAO H, ZHANG K X, YAN M L, ZHOU M L. Deciphering the functional basis of FtMYB1 transcription factor in flavonol biosynthesis of tartary buckwheat hairy root. Journal of Plant Genetic Resources, 2020, 21(5): 1270-1278. (in Chinese)

[26] 盧曉玲, 何銘, 張凱旋, 廖志勇, 周美亮. 苦蕎鼠李糖基轉移酶基因的克隆與轉化毛狀根研究. 作物雜志, 2020(5): 33-40.

LU X L, HE M, ZHANG K X, LIAO Z Y, ZHOU M L. Study on the cloning and transformation of rhamnose transferasegene in tartary buckwheat. Crops, 2020(5): 33-40. (in Chinese)

[27] 翁文鳳, 伍小方, 張凱旋, 唐宇, 江燕, 阮景軍, 周美亮. 過表達提高苦蕎毛狀根黃酮積累及其耐鹽性. 作物雜志, 2021(4): 1-9.

WENG W F, WU X F, ZHANG K X, TANG Y, JIANG Y, RUAN J J, ZHOU M L. The overexpression ofimproves accumulation of flavonoid in the hairy roots of tartary buckwheat and its salt tolerance. Crops, 2021(4): 1-9. (in Chinese)

[28] WANG C L, DONG X N, DING M Q, TANG Y X, ZHU X M, WU Y M, ZHOU M L, SHAO J R. Plantlet regeneration of tartary buckwheatGaertn.)tissue cultures. Protein and Peptide Letters, 2016, 23(5): 468-477.

[29] 侯思宇, 王欣芳, 杜偉, 馮晉華, 韓淵懷, 李紅英, 劉龍龍, 孫朝霞.苦蕎WOX家族全基因組鑒定及響應愈傷誘導率表達分析. 中國農業科學, 2021, 54(17): 3573-3586.

HOU S Y, WANG X F, DU W, FENG J H, HAN Y H, LI H Y, LIU L L, SUN Z X. Genome-wide identification of WOX family and expression analysis of callus induction rate in tartary buckwheat. Scientia Agricultura Sinica, 2021, 54(17): 3573-3586. (in Chinese)

[30] AHMAD F, DANNY G. Agroinfiltration of intact leaves as a method for the transient and stable transformation of saponin producingPlant Cell Reports, 2012, 31(8): 1517-1526.

[31] VARGAS-GUEPWARAL C, VARGAS-SESURA C, VILALTAVILALOBOS J, FERERALF P, GATIOAARIAS A. A simple and efficient agroinfiltration method in coffee leaves (L.): assessment of factors affecting transgene expression. 3 Biotech, 2018, 8(11): 471.

[32] BONDT A D, EGGERMONT K, PENWNCKX I, GODERIS I, BROEKAERT W F.Agrobacterium-mediated transformation of apple (Borkh.): an assessment of factors affecting regeneration of transgenic plants. Plant Cell Reports, 1996, 15(7): 549-554.

[33] FEINBAUM R L, AUSUBEL F M. Transcriptional regulation of thechalcone synthase gene. Molecular and Cellular Biology, 1988, 8(5): 1985-1992.

[34] KROL A R, LENTING P E, VEENSTRA J, MEER I M, KORS R E, GERATS A G, MOL J N M, STUITJE A R. An anti-sense chalcone synthase gene in transgenic plants inhibits flower pigmentation. Nature, 1988, 333(6176): 866-869.

[35] LOTKOWSKA M E, TOHGE T, FERNIE A R, XUE G P, BALAZADEH S, BERND M R. Thetranscription factor MYB112 promotes anthocyanin formation during salinity and under high light stress. Plant Physiology, 2015, 169(3): 1862-1880.

[36] SUN Z X, HU B L, HOU S Y, LIU R H, WANG L, HAO Y R, HAN Y H, ZHOU M L, LIU L L, LI H Y. Tartary buckwheat FtMYB31 gene encoding an R2R3-MYB transcription factor enhances flavonoid accumulation in tobacco. Journal of Plant Growth Regulation, 2020, 39(2): 564-574.

Optimization of callus genetic transformation system and its application inoverexpression in tartary buckwheat

ZHAO HaiXia, XIAO Xin, DONG QiXin, WU Huala, LI ChengLei, WU Qi

College of Life Science, Sichuan Agricultural University, Ya’an 625014, Sichuan

【】To develop a novel tool for functional verification and molecular breeding in tartary buckwheat, this study focused on establishing and optimizing an efficient callus genetic transformation system. 【】Callus induction factors including different explants, ratios of diverse growth regulators, andtypes were systematically evaluated using “Xiqiao No. 2” as the derived plant. We further overexpressed, a key enzyme gene involved in the biosynthesis of tartary buckwheat flavonoids in obtained calli to validate the optimized genetic callus transformation system. The positive transgenic lines were confirmed by PCR and fluorescent observation. Subsequently, the content of anthocyanins and metabolites in flavonol branch pathway were determined by UV spectrophotometry and High Performance Liquid Chromatography (HPLC), respectively. Furthermore, quantitative real-time PCR was performed to analyze expression levels of genes involved in flavonoid synthesis, in order to compare the differences between theoverexpressed calli and the control. 【】The optimal explant was hypocotyls and the optimal induction medium was the Murashige and Skoog (MS) medium supplemented with the addition of 0.8 mg·L-16-BA (6-Benzylaminopurine) and 3.5 mg·L-12,4-D (2,4-Dichlorophenoxyacetic acid). The induction rate of calli grown on the above medium reached up to 72%. Moreover, the optimized subculture medium containing MS with the additives of 3 mg·L-16-BA and 1 mg·L-1KT (Kinetin) increased the percentage and coefficient of callus proliferation to 98% and 1.09, respectively. Additionally, the bestin the transformation process was GV3101, and the transformation efficiency was up to 31.3%. The functional analysis ofoverexpressing in transgenetic calli demonstrated that: (1) the accumulations of kaempferol and quercetin in transgenic calli overexpressingwere dramatically higher than those in control groups (＜0.01), and anthocyanin, rutin and myricetin contents were also remarkably higher (＜0.05); (2) overexpression of the exogenousdid not affect the expression levels of 5 endogenous orthologous genesin the transgenic calli (＞0.05), whereas genes encoding key enzymes of the flavonoid synthesis pathway, such as,,,,,and, were up-regulated (＜0.05); (3)and, the transcription factor genes that specifically positively regulated the flavonol synthesis, were up-regulated, while, a suppressor gene of anthocyanin synthesis, was down-regulated (＜0.05). 【】In this study, the callus genetic transformation system of tartary buckwheat was successfully established from “Xiqiao No. 2”.1 overexpression in the transgenic calli up-regulated genes related to flavonoid synthesis, resulting in flavonoids accumulation.

tartary buckwheat; callus; genetic transformation; chalcone synthase gene

10.3864/j.issn.0578-1752.2022.09.003

2021-11-01；

2021-12-30

國家自然科學基金面上項目（31871699）

趙海霞，E-mail：zhaohaixia@sicau.edu.cn。通信作者吳琦，E-mail：wuqi@sicau.edu.cn

（責任編輯 李莉）