赤峰地區苦菜中葉綠素提取工藝的研究

于曉偉

(赤峰學院化學與生命科學學院，內蒙古 赤峰 024000)

苦菜(Sonchus Oleraceus L)，屬于菊科植物[1]，具有很高的營養價值，含有豐富的蛋白質、糖、食物纖維、鈣、鐵、錳等礦物元素。目前關于苦菜的研究主要集中在苦菜的成分分析、分類鑒定、生物活性作用等方面[2-5]，但是，目前關于苦菜中葉綠素提取的研究卻鮮有報道。在植物生長發育過程中，葉綠素起著非常重要的作用，也是植物進行光合作用的主要色素之一[6,7]。目前，關于葉綠素提取方法的研究報道很多，何思宇[8]等通過溶液浸提法對菠菜中的葉綠素提取工藝進行了優化，葉綠素提取含量可以達到1.89mg·g-1，并進行了酪蛋白分散體系的研究，取得了一定的效果；王鳳婷等[9]以小白菜、菠菜和生菜為試驗材料，研究了改進的研磨法在葉綠素提取試驗中的應用，研究結果表明，該方法用時短、重復性好、操作簡單，同時可以應用于不同植物；盛璐等[10]研究不同處理提取液對鐵線蓮“親愛的”葉綠素含量測定的影響，結果表明，不同提取劑配比對葉綠素含量的提取及穩定性的影響有著明顯的差異；甘勇輝[11]等研究了不同提取液提取金線蓮中葉片葉綠素效果，結果表明，金線蓮葉綠素含量測定提取液為丙酮-乙醇混合液或80%丙酮時提取效果最好；劉穎等[12]研究了超聲波輔助混合溶劑提取黃花菜葉綠素的最佳條件，研究結果表明，使用超聲波輔助混合溶劑方法后葉綠素的提取含量明顯升高，反應時間更短。本試驗采用超聲波輔助不同溶劑法對赤峰地區苦菜中葉綠素的提取進行研究，通過浸提效果確定最佳工藝條件。

1 試驗材料和方法

1.1 試驗材料

試材為新鮮苦菜葉，采摘于內蒙古赤峰市松山區當鋪地滿族鄉，葉片要求完整，顏色鮮艷，消掉泥土，瀝干水分后，置于40℃干燥箱中烘干，研磨，通過100目篩子篩選后備用。

1.2 試劑與儀器

無水乙醇，分析純(天津市恒興化學試劑制造有限公司)；丙酮，分析純(天津市恒興化學試劑制造有限公司)；試驗用水均為去離子水，采購獲得。

1.2.2 儀器

電子天平(Secura612-1CN，賽多利斯科學儀器(北京)有限公司生產)；高速離心機(DD-5M，湖南滬康離心機有限公司生產)；數顯恒溫水浴鍋(HHS，江蘇省金壇市金祥龍電子有限公司生產)；紫外可見分光光度計(TU-1810，PC型，北京普析通用生產)；超聲波清洗機(SB-5200DTN，寧波新芝生物科技股份有限公司生產)。

1.3 試驗方法

1.3.1 苦菜中葉綠素的提取與測定

用電子天平準確稱量苦菜樣品(0.5g)于具塞試管中，加入一定量體積的乙醇或丙酮試劑，具塞試管用錫紙包裹避免光線照射，在一定提取溫度和一定時間的超聲波(超聲功率250W)處理下，待溫度降低到室溫后，用高速離心機離心處理5min(2500r·min-1，20℃)，取一定量的離心溶液，放入石英試管中，以乙醇溶劑作為空白對照，利用紫外分光光度計測定波長為645nm和663nm下的吸光值并記錄。根據Arnon公式[13]，算出葉綠素a、葉綠素b和葉綠素的總含量。Arnon公式具體如下。

葉綠素a含量Ca(mg·g-1)：

當時，環形珠墊的編織方法是基于的周期運動，采用數學表達式的形式表示其周期運動的規律，下行線的運動表示為，上行線的運動表示為，即

Ca=[(12.71×OD663-2.59×OD645)×V]/1000×W

葉綠素b含量Cb(mg·g-1):

Cb=[(22.9OD645-4.67×OD663)×V]/1000×W

葉綠素提取量C(a+b)(mg·g-1):

C(a+b)=Ca+Cb

式中，OD645表示波長為645nm下的吸光度值；OD663表示波長為663nm下的吸光度值；V表示提取液的體積，mL；W表示苦菜質量，g。

1.3.2 單因素分析實驗

分別以乙醇和丙酮為提取劑，設計不同的液料比(mL·g-1)，提取時間、提取溫度和超聲波超聲時間為單因素變量，測量苦菜中葉綠素的含量。具體設計：當液料比為30∶1，提取時間為20min，超聲波(超聲功率250W)10min時，改變提取溫度分別為20℃、30℃、40℃、50℃、60℃；當提取溫度為50℃，液料比為30∶1，超聲波(超聲功率250W)10min時，改變提取時間分別為10min、20min、30min、40min、50min；當提取溫度為50℃，提取時間為20min，超聲波(超聲功率250W)10min時，改變液料比分別為20∶1、30∶1、40∶1、50∶1、60∶1；當提取溫度為50℃，液料比為30∶1，提取時間為20min，改變超聲波(超聲功率250W)，時間分別為10min、20min、30min、40min。比較提取溫度、提取時間、液料比和超聲時間對苦菜中葉綠素提取含量的影響。

1.3.3 Box-Behnken試驗設計

在單因素分析試驗結果的基礎上，以提取溫度(A)、提取時間(B)、液料比(C)、超聲時間(D)為自變量，苦菜中葉綠素提取量(Y)為響應值，采用Box-Behnken設計法對苦菜中葉綠素的提取工藝條件進行優化。響應面試驗設計及因素水平見表1。

1.3.4 數據處理

使用Excel和Design Expert 11軟件進行數據統計分析，建立方程模型和作圖。每次試驗處理均重復3次，取其平均值。

表1 響應面試驗設計及因素水平

2 結果與分析

2.1 單因素試驗結果

2.1.1 提取溫度對苦菜中葉綠素提取含量的影響

圖1 提取溫度對葉綠素提取含量的影響

由圖1可知，當分別以乙醇和丙酮作為提取劑時，在液料比為30∶1，提取時間為20min，超聲波(超聲功率250W)10min時，分別改變不同提取溫度，隨著溫度的不斷升高，葉綠素的提取含量不斷增大，當反應溫度達到50℃時，兩者的葉綠素提取量均達到的最大值，此時繼續提高反應溫度，葉綠素的提取含量明顯下降。相對于以乙醇作為提取劑，丙酮作為提取劑時的葉綠素提取含量在各個溫度下均低于乙醇，乙醇的提取效果更好。

2.1.2 提取時間對苦菜中葉綠素提取含量的影響

圖2 提取時間對葉綠素提取含量的影響

由圖2可知，分別以乙醇和丙酮作為提取劑時，當提取溫度為50℃，液料比為30∶1，超聲波(超聲功率250W)10min時，改變提取時間，發現隨著提取時間的不斷延長，以乙醇為提取劑的葉綠素的提取量在20～40min的過程中出現一個陡增的過程，葉綠素含量明顯提高，當提取時間超過40min時，提取量有下降的趨勢；以丙酮為提取劑的葉綠素的整體提取量變化不明顯，提取含量明顯少于以乙醇作為提取劑，提取效果不明顯。

2.1.3 液料比對苦菜中葉綠素提取含量的影響

圖3 液料比對葉綠素提取含量的影響

由圖3可知，分別以乙醇和丙酮作為提取劑時，當提取溫度為50℃，提取時間為20min，超聲波(超聲功率250W)10min時，在不同液料比的條件下，以乙醇作為提取劑的葉綠素的含量在液料比為30∶1時，達到最大值，繼續增大液料比對葉綠素提取量的影響不大；以丙酮作為提取劑的葉綠素的含量同樣在30∶1時，達到峰值，繼續增大液料比對葉綠素提取量的影響不大。且當液料比大于40∶1時，以丙酮作為提取劑的葉綠素的提取量要好于以乙醇作為提取劑的提取效果。

2.1.4 超聲時間對苦菜中葉綠素提取含量的影響

圖4 超聲時間對葉綠素提取含量的影響

由圖4可知，分別以乙醇和丙酮作為提取劑時，當提取溫度為50℃，液料比為30∶1，提取時間為20min，改變超聲波(超聲功率250W)的時間。當以乙醇作為提取劑時，當超聲(超聲功率250W)時間為20min時，葉綠素的提取含量達到最大值，繼續延長超聲時間對葉綠的提取量的影響不大；當以丙酮作為提取劑時，當超聲(超聲功率250W)時間為20min時，葉綠素的提取含量達到最大值，隨著時間的延長，葉綠素的提取量有一定的降低。以乙醇作為提取劑的葉綠素的提取量的最大值要高于以丙酮作為提取劑的葉綠素提取量。

2.2 響應面優化試驗結果

2.2.1 試驗方案設計及結果

利用Design Expert 11 軟件里的Box-Behnken設計試驗方案，其響應值及方差分析結果見表2。對表2數據進行分析，得到葉綠素提取量(Y)和編碼自變量A、B、C、D的回歸方程：Y=0.7280+0.0042A+0.0525B+0.0183C+0.0133D-0.06AB+0.005AC-0.0125AD-0.005BC-0.0025BD-0.05CD+0.0477A2-0.1377B2-0.0415C2-0.34D2。

由響應面方差分析表可知，見表3，該方程模型極顯著(p<0.05)，說明所得方程擬合較好，回歸顯著。方程程模型的校正相關系數R2=0.8006，校正絕對系數R2Adj=0.613，說明試驗因素A、B、C、D對葉綠素提取量影響顯著。其中，B2的P值<0.0001，說明對葉綠素提取量影響極顯著。根據回歸方程中各項系數的絕對值表示各因素對響應值影響的大小、正負表示對響應值影響的方向的原理[14]，得到影響苦菜中葉綠素提取率的因素大小依次為提取時間(B)>液料比(C)>超聲時間(D)>反應溫度(A)，其中提取時間對葉綠素提取量的影響可達極顯著水平。

2.2.2 驗證試驗

響應面優化得苦菜中葉綠素提取工藝最佳條件為提取反應溫度為40℃，提取反應時間為40min，液料比為30∶1，超聲波(超聲功率250W)的時間為20min。通過優化后的參數做3組平行試驗，最終測得苦菜中葉綠素的提取量為0.81±0.03mg·g-1，證明該方程可靠、有效，可用于模擬苦菜中葉綠素的提取工藝。

3 結論

本文通過比較以乙醇和丙酮作為提取劑，研究了提取溫度、提取時間、液料比和超聲波(超聲功率250W)時間等因素對苦菜中葉綠素提取含量的影響，并通過響應面法優化了苦菜中葉綠素的條件。最后得出結論：以乙醇作為提取劑提取葉綠素的效果明顯好于以丙酮作為提取劑；最佳反應工藝條件為提取溫度為40℃，提取時間為40min，液料比為30∶1，超聲波(超聲功率250W)時間為20min。此結果為今后在苦菜中葉綠素提取提供了可行的參考方法。