川牛膝和懷牛膝化學成分提取分離及含量測定研究進展

梁林輝 杜翠華 梁大偉

摘要 川牛膝和懷牛膝為道地藥材，臨床使用廣泛，療效顯著，其成分三萜皂苷類、甾酮類、多糖類生物活性顯著，為其發揮藥效的主要物質。總結國內外公開發表的相關文獻，對川牛膝和懷牛膝中三萜皂苷類、甾酮類、多糖類成分的提取分離及含量測定研究進行綜述，以期為其有效成分進一步研究及開發提供參考。

關鍵詞 川牛膝;懷牛膝;化學成分;提取分離;含量測定

中圖分類號 R 284? 文獻標識碼 A? 文章編號 0517-6611（2022）09-0012-03

doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2022.09.004

開放科學（資源服務）標識碼（OSID）：

The Research Progress on Extraction and Determination Methods of Chemical Constituents in Cyathulae Radix and Achyranthis Bidentatae Radixpolysaccharides

LIANG Lin-hui， DU Cui-hua， LIANG Da-wei

（Ya’an Polytechnic College， Ya’an， Sichuan 625000）

Abstract Cyathulae Radix and Achyranthis Bidentatae Radixpolysaccharides are genuine crude drugs. It’s clinical application is extensive， and the activated ingredients are triterpenoid saponins， sterone compounds and polysaccharide. This paper summarizes the extraction and determination methods of chemical constituents in Cyathulae Radix and Achyranthis Bidentatae Radixpolysaccharides， and provides a reference for its further development and utilization

Key words Cyathulae Radix;Achyranthis Bidentatae Radixpolysaccharides;Chemical constituent;Extraction;Determination

川牛膝為莧科植物川牛膝Cyathula officinalis Kuan的干燥根，是川產道地藥材，主要產自雅安市天全縣、寶興縣、漢源縣以及樂山的金河口區，重慶、云南、貴州亦有分布;懷牛膝為河南省焦作市特產，是中國國家地理標志產品。它們具有逐瘀通經、通利關節、利尿通淋的功能，用于經閉癥瘕、胞衣不下、跌撲損傷、風濕痹痛、足痿筋攣、尿血血淋治療，臨床療效顯著。化學成分主要有三萜皂苷類[1]、甾酮類[2]及多糖類[3]，有少量的生物堿、黃酮類等成分。近年來，關于川牛膝和懷牛膝的研究主要集中于化學成分鑒定及藥理學研究，其有效成分的提取、分離純化及含量測定研究較少，該研究從主要有效成分三萜皂苷類、甾酮類、多糖類的提取分離及含量測定方面進行綜述，以期為牛膝的進一步開發利用提供借鑒。

1 三萜皂苷

1.1 提取分離方法

三萜皂苷類化合物是川牛膝主要成分之一。羅懿釩等[4]綜述了牛膝中有效成分，發現39種三萜皂苷類化合物，其中7種為川牛膝中含有，主要為齊墩果酸型皂苷。王麗景[5]采用正交試驗考察了乙醇濃度、料液比、提前時間、提取次數等因素對牛膝中皂苷提取效果的影響，最優工藝為乙醇濃度為80%、料液比1∶8、回流提取2次，每次3 h，牛膝總皂苷含量可達1.889 mg/mL，大孔樹脂吸附處理，含量可達60%。王俊等[6]分別以甲醇、乙醇為提取溶劑，比較超聲法、回流提取法和索氏提取法，發現乙醇提取效率明顯高于甲醇，超聲提取法與索氏提取法提取效率相當，均高于回流提取法。程永杰等[7]采用正交試驗法篩選出牛膝中總皂苷的最佳提取工藝為藥材10倍量的80%乙醇為溶劑，提取3次，每次1 h。柳立新等[8]比較了甲醇回流提取、乙醇回流提取、乙醚索氏提取除雜再用甲醇回流提取、水超聲提取和乙醇超聲提取5種方法，發現70%乙醇超聲提取和回流提取總皂苷的含量較高，分別為4.97%和4.75%。尚風琴[9]以70%乙醇為提取溶劑，料液比1∶10，比較了超聲法、回流法和浸漬法3種提取方法，結果顯示最佳提取方式順序為回流提取>浸漬提取>超聲提取，進一步正交試驗考察了乙醇濃度、料液比、提取次數和提取時間4個因素，最優提取工藝為采用90%乙醇為提取溶劑，料液比為1∶12，提取3次，每次1 h，川牛膝總皂苷含量達10.97 mg/g。目前針對川牛膝皂苷類化合物提取分離研究較少，通過上述文獻研究可知，川牛膝皂苷類化合物提取分離可采用乙醇回流提取法，通過有機溶劑萃取去除脂溶性成分，然后經大孔樹脂進行分離純化，該方案簡單易行，且易于工業化。

1.2 含量測定方法

三萜皂苷類化合物含量檢測主要為紫外分光光度法和液相色譜法。衛修來等[10]利用三萜總皂苷可與高氯酸-香草醛試劑顯色的原理，建立了紫外分光光度法測量牛膝總皂苷，以齊墩果酸為對照品，最大吸收波長為544 nm，該方法測得懷牛膝中總皂苷平均含量為6.24%;利用同一比色法方法，最大吸收波長為547 nm，柳立新等[8]測得土牛膝中總皂苷含量最高為4.97%。王麗景[5]選取最大吸收波長為527 nm，測定牛膝提取純化后總皂苷含量為60%，由于比色法所用的顯色劑專屬性較差，可能是造成最大吸收波長差異較大的原因。

歐麗蘭等[11-12]采用高效液相色譜法（HPLC）測定土牛膝中齊墩果酸含量、比較懷牛膝與川牛膝中皂苷含量的不同。尚風琴[9]建立了川牛膝總皂苷的HPLC-MS指紋圖譜，測得大孔樹脂富集后的川牛膝皂苷總提取物含量為52.5%。閆文靜等[13]采用HPLC-ELSD法較好地分離了兩種皂苷，并測定其含量。

2 甾酮

2.1 提取分離方法

川牛膝中甾酮類化合物多達13種，主要為杯莧甾酮及其類似物，是川牛膝發揮藥理作用的重要化學成分。2020版《中國藥典》規定，川牛膝中杯莧甾酮含量不得少于0.03%。王龍等[14]采用正交試驗法考察了水量、提取溫度、提取時間和次數3個因素對牛膝中甾酮的提取效率影響，最優工藝為料液比1∶50，溫度50～100 ℃，提取2次，每次2 h，水煮提取物中蛻皮甾酮含量為9.30%。同時，還以水為溶劑提取牛膝總甾酮[15]，分別按料液比1∶20、1∶15水煎煮2次，每次2 h，提取液經D型大孔樹脂處理，考察pH、吸附流速、洗脫液種類及用量對牛膝總甾酮的影響，在最優分離條件下，D型大孔樹脂對牛膝甾酮的吸附量為28.9 mg/g，純化后的牛膝總甾酮含量達60%，蛻皮甾酮含量達10%。孟大利等[16-17]以乙醇為提取溶劑，采用回流提取法，經大孔樹脂脫糖純化、系統溶劑萃取、硅膠色譜柱層析分離，得到漏蘆甾酮B、旌節花甾酮D和紅莧甾酮;林大專等[18]采用類似提取分離方法得到3種蛻皮甾酮。蒙漢富等[19]以甲醇或水為提取溶劑，采用正交試驗法考察了甲醇濃度、提取時間、提取次數、溶劑倍量4種因素，最佳提取工藝為60倍量30%甲醇超聲提取2次，每次1.5 h。孔飛飛等[20]采用回流提取法考察了乙醇濃度、溶劑倍量及提取時間3個因素對杯莧甾酮的提取效率影響，最優提取工藝為用70%乙醇加熱回流提取2次，料液比分別為1∶12和1∶10，提取時間均為2 h。孫亮亮等[21]采用響應面分析法優化了超聲法提取甾酮，以正丁醇水溶液為提取溶劑，考察了溶劑、料液比及提取時間對β-蛻皮甾酮提取效率的影響，最優工藝為45%正丁醇溶液，料液比為1∶15，提取時間1.7 h。歐陽文等[22]采用甲醇回流提取3次，每次2 h，提取液濃縮后經制備型ODS層析柱、硅膠柱層析分離得β-蛻皮箔酮、牛膝甾酮、水龍骨甾酮3種單體化合物。朱婷婷等[23]采用乙醇滲漉提取，濃縮液經系統溶劑萃取、柱層析分離得25S-牛膝甾酮、25R-牛膝甾酮和β-牛膝甾酮單體化合物。

除了上述常規溶劑提取法外，鄭義哲[24]采用二氧化碳超臨界流體萃取法提取蛻皮甾酮，首先探索夾帶劑對提取蛻皮甾酮的影響，確定最優工藝條件是以二甲亞砜為夾帶劑，壓力25 MPa、溫度70 ℃，夾帶劑流速0.5 mL/min，靜態萃取時間10 min，動態萃取時間1 h，二氧化碳流量2 L/min。

綜上可知，鑒于試驗條件及制備量的因素，川牛膝中甾酮類化合物可采用有機溶劑提取法，大孔樹脂分離純化，再結合有機溶劑（乙酸乙酯、正丁醇）萃取法可得到含量較高的甾酮類化合物，如分離單體化合物須經多次層析分離等方法來實現。

2.2 含量測定方法

甾酮類與三萜皂苷具有相似的結構母核，可以采用香草醛-高氯酸比色法測量甾酮含量。王龍等[25]利用該方法，以β-蛻皮甾酮為對照，在最大吸收峰550 nm處，紫外分光光度法測得大孔樹脂富集后的牛膝提取物總甾酮含量為53.3%。劉姣等[26]以同樣的方法，采用最大吸收波長243 nm，測定懷牛膝中總甾酮含量為2.089%。

顯色法專屬性較差，目前甾酮類化合物含量檢測主要為高效液相色譜法。 胡亮等[27-28]采用反向色譜柱測定粗毛牛膝、野生牛膝和柳葉牛膝、杯莧甾酮含量。尚風琴[9]利用HPLC-MS法構建懷牛膝和川牛膝總甾酮指紋圖譜。川牛膝中甾酮類化合物主要為杯莧甾酮、羥基杯莧甾酮、森告甾酮等，2020版中國藥典規定了川牛膝中杯莧甾酮的檢測方法，采用HPLC法，以十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑，甲醇-水為流動相進行梯度洗脫，檢測波長為243 nm。

綜上可知，可利用HPLC法測定川牛膝甾酮類單體化合物的含量，該方法簡單，結果可靠。

3 多糖

3.1 提取分離方法

最新研究表明，川牛膝多糖類成分具有很好藥理活性。劉穎華等[29]采用水提醇沉法得川牛膝多糖粗品，經陰離子交換樹脂和凝膠分離，得多糖純品，總收率為22.5%。趙磊等[30]以熱水為提取溶劑，經氯仿萃取，濃縮后醇沉得到川牛膝粗多糖，考察提取時間、料液比、溫度、提取次數4種因素對多川牛膝粗多糖提取效率的影響，最優工藝參數為料液比1∶15，提取溫度60 ℃，浸提時間2 h，提取1次，醇沉濃度85%，川牛膝多糖的收率為49.18%。侯劍萍等[31]采用水煎煮法提取粗多糖，經脫蛋白、脫鹽和醇沉法純化，最佳提取純化工藝為料液比1∶10，提取3次，每次2 h，采用三氯乙酸（TCA）法脫蛋白，分子篩法脫鹽處理，80%乙醇沉淀。梁歌等[32]采同樣的水提醇沉法提取川牛膝粗多糖，通過正交試驗考察了提取溫度、提取時間、料液比、乙醇濃度對多糖得率的影響，最佳提取工藝為提取溫度100 ℃，提取時間8 h，料液比1∶20，95%乙醇溶液。黃志芳等[33]采用75%乙醇回流提取，經水提取、濃縮、醇沉，收集沉淀，再用三氯乙酸除去蛋白、醇沉、有機溶劑洗滌等步驟得到牛膝多糖，收率為7.2%，含量達12.85%。

劉傳敏等[34]采用酶解超聲法提取川牛膝多糖，正交試驗考察了酶解時間、酶用量、pH、酶解溫度對酶解效果的影響和樣品粒度、料液比、超聲時間、超聲次數對提取效果的影響。最佳工藝條件為酶解1 h，酶用量15 U/g，pH 5.0，酶解溫度50 ℃，粒度20目，料液比1∶40，超聲時間20 min。谷旭晗等[35]采用同樣的酶法提取川牛膝多糖，通過正交試驗確定最佳工藝條件為藥材粒徑550～830 μm、酶用量4 mg/g、酶解溫度50 ℃、酶解時間90 min、溶劑pH為5.0、料液比1∶60，提取時間30 min，在此條件下，川牛膝多糖收率為71.7%。葉秀娟等[36]以復合酶解法進行提取，最佳提取工藝為料液比1∶20、復合酶用量0.7%、pH 6.0、溫度45 ℃，該條件下提取的川牛膝多糖含量大于52%。

魏濤等[37]利用超聲波輔助提取懷牛膝多糖，經石油醚和乙醇脫脂除雜，水為溶劑，正交試驗確定最優提取條件為超聲功率1 000 W、提取溫度60 ℃、提取時問60 min、料液比1∶30，懷牛膝多糖提取率為6.1%。姜艷等[38]采用同樣方法提取牛膝多糖，最后經醇沉得到牛膝多糖，收率達到11.7%。趙玥琪等[39]以川牛膝為原料，比較了超聲輔助提取法與煎煮法提取多糖的效率，發現在相同的提取溫度、時間和料液比情況下，超聲波提取法比煎煮提取效率高9.8%。

除了上述超聲波提取法，微波輔助法也應用于牛膝多糖的提取分離研究中[40-41]。此外，蒸汽爆破預處理法有助于牛膝多糖的提取[42]。多糖純化工藝中，采用醇沉、萃取法除蛋白等方法較多，殼聚糖為絮凝劑有助于川牛膝的總多糖絮凝純化[43]。

3.2 含量測定方法

多糖測定方法主要為苯酚-硫酸法和蒽酮-硫酸法比色法。丁淑彬等[44-45]采用紫外分光光度法、苯酚-硫酸顯色法，在490 nm波長處對川牛膝中多糖的含量進行了測定，該法簡單快速、靈敏度高、重現性好。張純等[46]改良了蒽酮-硫酸比色法測牛膝多糖，經典的蒽酮-六十顯色法反應條件為蒽酮試劑濃度為0.2%，反應溫度100 ℃，反應時間10 min，波長620 nm，發現反應溫度會改變最大吸收波長，優化后的反應條件更改為反應溫度20 ℃，其他條件不變。李根林等[47]比較了苯酚-硫酸法和蒽酮-硫酸法2種方法對多糖含量檢測的影響，發現苯酚-硫酸法顯色靈敏度高于蒽酮-硫酸顯色法。

除了上述比色法測量多糖外，多糖經水解為單糖后可利用高效液相色譜法進行測定，王小燕等[48]利用牛膝多糖的柱前衍生化，建立懷牛膝多糖的柱前衍生化-HPLC指紋圖譜及單糖含量測定方法，可為懷牛膝飲片質量評價提供參考。

4 小結

該研究主要對川牛膝和懷牛膝中三萜皂苷類、甾酮類及多糖3種主要成分的提取分離與含量測定進行綜述，發現研究主要集中在化學成分和藥理學研究，對3種主要成分的批量純化工藝研究較少，對單體化合物的檢測方法研究還不足。川牛膝做為川產道地藥材，未來可進一步針對有效成分的分離及純化進行深入研究，為進一步開發川牛膝的應用提供有力支撐。

安徽農業科學2022年

參考文獻

[1] LIU Y H，HE K Z，YANG M，et al.Structure of a bioactive fructan from the root of Cyathula officinalis[J].Acta botanica sinica，2004，46（9）：1128-1134.

[2] 馬英，畢開順，王璽，等.HPLC法測定川牛膝中杯莧甾酮的含量[J].中草藥，2000，31（6）：427-428.

[3] 李祖倫，石圣洪，陳紅，等.川牛膝多糖的免疫活性研究[J].中藥材，1998，21（2）：90-92.

[4] 羅懿釩，歐陽文，唐代鳳，等.牛膝中皂苷和甾酮類物質基礎及藥理活性研究進展[J].中國現代中藥，2020，22（12）：2122-2136.

[5] 王麗景.牛膝指紋圖譜和牛膝皂苷的提取及其藥理作用的研究[D].揚州：揚州大學，2009.

[6] 王俊，王芳，唐燦.川牛膝中齊墩果酸提取工藝研究[J].瀘州醫學院學報，2010，33（4）：389-391.

[7] 程永杰，楊興鑫，張艷利，等.正交試驗法優選牛膝的提取工藝[J].山西醫科大學學報，2010，41（1）：42-44.

[8] 柳立新，張毅.不同提取方法對土牛膝總皂苷含量測定的影響[J].安徽醫藥，2013，17（8）：1296-1297.

[9] 尚風琴.懷牛膝與川牛膝功能活性成分的比較研究[D].武漢：中國科學院大學（中國科學院武漢植物園），2016.

[10] 衛修來，高昌琨，高建，等.懷牛膝中總皂苷含量測定[J].安徽醫藥，2007，11（5）：424-425.

[11] 歐麗蘭，余昕，張椿，等.土牛膝的生藥學鑒定[J].安徽農業科學，2012，40（9）：5204-5206，5290.

[12] 劉偉華.高效液相色譜法比較懷牛膝與川牛膝中三萜皂苷含量[J].現代中西醫結合雜志，2017，26（24）：2725-2726，2736.

[13] 閆文靜，仲彥穎，汪豪，等.HPLC-ELSD法測定川牛膝中兩種三萜皂苷的含量[J].藥學與臨床研究，2014，22（4）：336-338.

[14] 王龍，胥秀英，鄭一敏，等.正交實驗法研究牛膝中甾酮的水煮提取工藝[J].時珍國醫國藥，2005，16（11）：1116-1117.

[15] 王龍，胥秀英，鄭一敏，等.大孔吸附樹脂提取分離牛膝總甾酮[J].精細化工，2004，21（S1）：130-132，139.

[16] 孟大利，侯柏玲，汪毅，等.中藥牛膝中的植物甾酮類成分[J].沈陽藥科大學學報，2006，23（9）：562-564，576.

[17] 趙婉婷.中藥牛膝化學成分的研究[D].沈陽：沈陽藥科大學，2007.

[18] 林大專，王廣樹，楊曉虹，等.牛膝中新蛻皮甾酮類成分的研究[J].中國藥學雜志，2006，41（17）：1295-1297.

[19] 蒙漢富，銀勝高，蔣娟，等.土牛膝中蛻皮甾酮的正交提取工藝研究[J].企業科技與發展，2018（6）：49-51.

[20] 孔飛飛，郭良君，譚興起.川牛膝中杯莧甾酮的提取、分離及純化工藝研究[J].現代中西醫結合雜志，2013，22（18）：2023-2026.

[21] 孫亮亮，吳劍，張葉，等.響應面分析方法優化懷牛膝藥材超聲提取工藝研究[J].現代中藥研究與實踐，2017，31（6）：48-51.

[22] 歐陽文，羅懿釩，李震，等.土牛膝抗炎成分分離、鑒定與含量測定研究[J].天然產物研究與開發，2020，32（7）：1171-1181.

[23] 朱婷婷，梁鴻，趙玉英，等.牛膝甾酮25位差向異構體的分離與鑒定[J].藥學學報，2004，39（11）：913-916.

[24] 鄭義哲.牛膝中甾酮類成分的提取分離[D].杭州：浙江大學，2008.

[25] 王龍，胥秀英，鄭一敏，等.紫外分光光度法測定牛膝總甾酮含量[J].時珍國醫國藥，2005，16（1）：18-19.

[26] 劉姣，李清，曹秀蓮，等.懷牛膝藥材中牛膝總甾酮的含量測定[J].河北中醫藥學報，2007，22（2）：34-35.

[27] 胡亮，方磊，李瑞蓮，等.特色民族藥土牛膝中β-蛻皮甾酮的含量測定[J].中國藥師，2020，23（8）：1625-1627.

[28] 陳幸，黎萬壽，朱久武，等.RP-HPLC法測定川牛膝中杯莧甾酮的含量[J].藥物分析雜志，2000，20（4）：234-237.

[29] 劉穎華，何開澤，張軍峰，等.川牛膝多糖的分離、純化及單糖組成[J].應用與環境生物學報，2003，9（2）：141-145.

[30] 趙磊，王書林，楊慧，等.川牛膝多糖提取工藝研究[J].科技資訊，2008（25）：5-6.

[31] 侯劍萍，王春霞.牛膝多糖的提取純化工藝研究[J].中國藥房，2008，19（36）：2822-2824.

[32] 梁歌，曾富強，殷中瓊，等.川牛膝多糖的提取及含量測定[J].安徽農業科學，2009，37（14）：6423-6424.

[33] 黃志芳，黃志紅，胡吉林，等.土牛膝中齊墩果酸、牛膝多糖的提取與鑒定[J].中國實用醫藥，2010，5（17）：6-7.

[34] 劉傳敏，邵樂，李金貴.酶解超聲法提取川牛膝多糖的正交試驗研究[J].中獸醫醫藥雜志，2009，28（5）：52-54.

[35] 谷旭晗，劉傲霞，成悅，等.纖維素酶法提取川牛膝多糖[J].生物加工過程，2015，13（6）：75-80.

[36] 葉秀娟，黃穎賢，李少鳳.復合酶法優化川牛膝多糖提取工藝研究[J].中國藥物經濟學，2018，13（7）：24-26.

[37] 魏濤，何培新，封盛雪，等.懷牛膝多糖的超聲波輔助提取工藝及其抗氧化性活性[J].食品與發酵工業，2011，37（2）：191-194.

[38] 姜艷，許海丹.超聲波輔助提取牛膝多糖的工藝研究[J].廣州化工，2015，43（13）：109-110，147.

[39] 趙玥琪，郝婧瑋，王鏡哲.單因素法考察川牛膝多糖提取工藝[J].中國林副特產，2019（4）：17-20.

[40] 陳艾萌，潘潔，胡博，等.川牛膝多糖抗氧化活性測定和微波提取工藝優化[J].中成藥，2017，39（1）：80-84.

[41] 郭婕，李季平，劉中華.懷牛膝多糖的微波提取工藝研究[J].中國果菜，2017，37（4）：16-19.

[42] 易軍鵬，王賽，李欣，等.蒸汽爆破提取牛膝多糖工藝優化及抗氧化性研究[J].食品與機械，2018，34（6）：145-151.

[43] 成悅，劉傲霞，夏玉婷，等.殼聚糖絮凝法精制川牛膝總多糖酶提取液的工藝研究[J].機電信息，2015（29）：31-36.

[44] 丁淑彬，魯洪，紀耀華.牛膝中總多糖的含量測定[J].時珍國醫國藥，2001，12（12）：1062.

[45] 彭宏宇.紫外分光光度法測定川牛膝中多糖的含量[J].西華師范大學學報（自然科學版），2005，26（2）：203-204.

[46] 張純，郭文彪，王雯佶，等.改良硫酸蒽酮比色法測定牛膝多糖的含量[J].中華臨床醫藥雜志，2003，4（19）：17-18.

[47] 李根林，杜天信，梁生旺.懷牛膝中多糖的含量測定[J].中國實驗方劑學雜志，2002，8（5）：6-7.

[48] 王小燕，郭常潤，常軍民，等.懷牛膝多糖的柱前衍生化-HPLC指紋圖譜建立及單糖成分含量測定[J].中國藥房，2021，32（3）：294-300.