帕瑞昔布鈉減輕接受手術應激誘導小鼠調節性T細胞反應性升高和疼痛閾值

楊茂林 鄧程葉 丁玲玲

(1三亞市人民醫院疼痛科，海南 三亞 572000；2首都醫科大學附屬北京中醫醫院麻醉科)

骨關節炎是老年人疼痛和殘疾的最常見原因，其特征在于骨重建、滑膜和軟骨損失〔1〕。雖然骨關節炎被歸類為非炎癥性關節病，但已證明炎癥在疾病進展中起重要作用。這些炎癥過程發生在滑膜，其特征是淋巴細胞和巨噬細胞的侵襲和升高的促炎細胞因子〔2〕。早些時候，骨關節炎患者的疼痛僅通過使用主觀問卷而不是通過測量體感神經系統來評估〔3〕。感覺功能定量感覺測試(QST)是一種科學的測量溫度和壓力及疼痛閾值的方法〔4〕。QST可以檢測由慢性疼痛引起的感覺變化。在疾病進展期間，活化的炎性細胞持續分泌大量炎癥介質〔5～7〕。所有這些慢性過程在滑膜和關節損傷中起主要作用。帕瑞昔布鈉是口服制劑伐地考昔的水溶性前藥，對環氧合酶(COX)-2的效力比COX-1高約28 000倍〔8〕。它是第一種可注射的COX-2抑制劑。COX-2抑制劑是已知的骨關節炎治療劑〔9〕。本研究旨在探究帕瑞昔布鈉對接受手術應激誘導小鼠調節性T細胞反應性升高和疼痛閾值的影響。

1 資料與方法

1.1一般資料 購買8～10周齡的30只BALB/c雄性小鼠在21～24℃和55%～65%濕度的環境中飼養，具有12 h的明暗循環。小鼠自由進食和飲水。

1.2實驗分組 小鼠隨機分為3組：假手術組(n=10)，關節炎模型組(n=10)，帕瑞昔布鈉治療組(n=10)。關節炎模型組和帕瑞苷布鈉治療組建立關節炎模型(麻醉小鼠橫切內側副韌帶并使用手術顯微鏡移除內側半月板)，建模后關節炎模型組小鼠每天1次腹膜內注射0.9%氯化鈉(南京化學試劑，中國)，連續5 d。帕瑞昔布鈉治療組連續5 d注射20 mg/kg帕瑞昔布鈉。假手術組對側膝關節進行假手術，沒有韌帶切斷或半月板切除術，并且在研究期間僅用0.9%氯化鈉注射治療，每日1次。

1.3醫學倫理學問題 本研究根據美國國立衛生研究院動物護理和使用指南第8版〔6〕進行，機構動物護理和使用委員會批準的方案進行動物實驗。

1.4研究方法

1.4.1組織學分析 術后24 h處死小鼠，解剖整個膝關節并在4%多聚甲醛中用磷酸鹽緩沖液固定4 h。用10%乙二胺四乙酸(EDTA)將樣品脫鈣2 w。乙醇脫水、石蠟包埋制成4 μm切片，切片用番紅O-固綠染色。通過軟骨退化評分和國際骨關節炎研究協會(OARSI)評分系統，評估骨關節炎嚴重性。

1.4.2自然殺傷(NK)細胞和調節性T細胞活性測定 根據制造商的說明，使用T細胞分離試劑盒和NK細胞分離試劑盒分離血漿T細胞亞群和NK細胞。通過四甲基偶氮唑藍(MTT)分別檢測NK細胞和調節性T細胞的活性。所有MTT測定一式3份進行。

1.4.3酶聯免疫吸附試驗(ELISA) 小鼠眼眶取血收集血液樣品，離心(3 000 r/min，30 min，4℃)分離血漿，并儲存在-80℃備用。根據制造商的說明制備和測量標準品和小鼠血清中干擾素(IFN)-γ、白細胞介素(IL)-10、IL-6，腫瘤壞死因子(TNF)-α含量。在450 nm下測量光學試劑密度(OD)值。

1.4.4疼痛閾值測量 使用QST參數測量疼痛閾值：冷檢測閾值(CDT)、熱檢測閾值(WDT)、冷痛閾值(CPT)和熱痛閾值(HPT)。為排除混淆因素，實驗均由同一研究員完成。在測試過程中，QST室溫保持在20～23℃。在測試之前，使小鼠在安靜的QST室中處于放松狀態，首先將接觸式熱電極(3×3 cm)連接并用帶子固定到小鼠爪子上，然后固定到膝關節的遠端髕骨極的下部皮膚表面。從熱電極的基線溫度32℃開始，溫度以每秒1℃的速率連續增加或減少。作為安全預防措施，截止溫度設定為最高50℃且最低為0℃。然后進行所有溫度測試3次。3次測量的平均值用作結果參數。通過確定CDT和WDT開始測試。當小鼠首次感知到溫度變化時，停止刺激。按下停止按鈕時記錄熱電極的溫度。繼續測試按順序確定CPT和HPT。隨著熱電極溫度下降/增加，小鼠一感覺到不適就立即按下停止按鈕。

1.4.5壓力疼痛閾值(PPT) 通過用壓力測量儀測定PPT。校準輸送100～1 000 kPa，相當于0.1 kg施加重量，以每秒0.5 kg/cm2的速率增加，接觸面為1 cm2。在與熱閾值相同的位置進行3次壓力測量，取平均值。

1.4.6mRNA表達分析 通過RT-qPCR評估B細胞淋巴瘤(Bcl)-2和Bcl-2相關X蛋白(Bax)mRNA表達。使用Trizol試劑提取總RNA，并使用AMV逆轉錄酶逆轉錄cDNA用于PCR擴增，引物序列見表1。使用2-ΔΔCt方法計算數據，對每個單獨的樣品進行3次重復實驗。

表1 RT-qPCR引物序列

1.4.7肌酸激酶(CK)、乳酸脫氫酶(LDH)、超氧化物歧化酶(SOD)、丙二醛(MDA)檢測 采用Western 印跡檢測CK、LDH、SOD、MDA蛋白表達。

1.5統計學分析 采用SPSS22.0進行方差分析、t檢驗。

2 結 果

2.1小鼠關節軟骨評分 與假手術組相比，關節炎模型組軟骨退化評分和OARSI評分均顯著升高(P<0.05)。帕瑞昔布鈉治療組較關節炎模型組軟骨退化評分和OARSI評分顯著降低(P<0.05)。見圖1、表2。

圖1 各組脛骨軟骨內側部分的組織學檢測(番紅O-固綠染色，×100)

2.2NK細胞和調節性T細胞 與假手術組相比，關節炎模型組血漿NK細胞百分比顯著降低，CD4+/CD8+比率顯著上調(P<0.05)，帕瑞昔布鈉治療組較關節炎模型組血漿NK細胞百分比顯著升高，CD4+/CD8+比率顯著下調(P<0.05)。見表2。

2.3ELISA檢測特異性炎性細胞因子 與假手術組相比，關節炎模型組IFN-γ、IL-10、IL-6和TNF-α蛋白含量均顯著增加(P<0.05)，帕瑞昔布鈉治療組較關節炎模型組IFN-γ、IL-10、IL-6和TNF-α蛋白含量顯著降低(P<0.05)。見表2。

表2 小鼠關節軟骨評分、NK細胞和調節性T細胞的活性、炎癥因子水平比較

2.4疼痛閾值及壓力疼痛閾值比較 與假手術組相比，關節炎模型組CDT和CPT顯著增加，WDT、PPT和HPT顯著降低(P<0.05)，說明關節炎小鼠敏感性增加。帕瑞昔布鈉治療組較關節炎模型組CDT和CPT顯著降低，WDT、PPT和HPT顯著增加(P<0.05)，說明帕瑞昔布鈉治療小鼠敏感性降低。見表3。

表3 3組疼痛閾值檢測

2.5Western印跡檢測CK、LDH、SOD、MAD蛋白表達 與假手術組相比，關節炎模型組CK、LDH和MDA蛋白含量均顯著增加，SOD蛋白含量顯著降低(P<0.05)，而帕瑞昔布鈉治療組較關節炎模型組CK、LDH和MDA蛋白含量均顯著降低，SOD蛋白含量顯著增加(P<0.05)。見表4。

2.6Bcl-2和Bax mRNA表達 與假手術組相比，關節炎模型組Bcl-2 mRNA表達量顯著升高，Bax mRNA表達量顯著降低(P<0.05)，帕瑞昔布鈉治療組較關節炎模型組Bcl-2 mRNA表達量顯著降低，Bax mRNA表達量顯著升高(P<0.05)。見表4。

表4 3組CK、LDH、SOD、MAD蛋白水平及Bcl-2和Bax mRNA表達

3 討 論

帕瑞昔布鈉是一種高選擇性COX-2抑制劑，用于圍術期鎮痛/抗炎治療。帕瑞昔布鈉是伐地考昔的前藥，已被開發為唯一可用于腸外制劑的COX-2選擇性抑制劑〔10〕。在靜脈內或肌內注射后，它在肝臟中迅速代謝成活性形式伐地考昔，峰值血漿伐地考昔濃度發生在30 min至3.5 h，消除半衰期約為8 h〔11〕。本研究的結果表明，在關節炎模型中帕瑞昔布鈉治療降低疼痛閾值并降低臨床關節炎評分、抑制炎性因子(包括IFN-γ、IL-10、IL-6和TNF-α)的表達，降低氧化應激因子CK、LDH和MDA蛋白含量，增加SOD活性。

本研究最重要的發現是骨關節炎小鼠PPT顯著低于假手術組。疼痛水平越高，PPT越低，通過了解不同類型的疼痛閾值與骨關節炎患者的臨床評分相關，可以調整和區分疼痛治療。在術后即刻階段采用精心設計的急性疼痛治療方案可能會限制神經向慢性疼痛發展。經常使用涉及非甾體抗炎藥(NSAID)、COX-2抑制劑、N-甲基-D-天冬氨酸受體(NMDA)拮抗劑、冷凍療法和使用添加劑的局部麻醉的經典藥物治療可減少術后阿片類藥物的用量〔12～14〕。在本研究中，骨關節炎小鼠顯示出比假手術組更低的PPT、WDT和HPT，更高的CDT和CPT，表現出致敏跡象。而帕瑞昔布鈉治療能夠恢復關節炎小鼠疼痛閾值的升高或降低。骨關節炎小鼠中，軟骨退化評分和OARSI評分顯示與QST參數高度相關。這些結果可能有助于優化那些評分最差的骨關節炎患者的疼痛治療。

IL-6與IL-10一起被證明可促進Treg遷移至某些腫瘤，因此可能在Treg信號傳導中起關鍵作用〔15〕。研究表明，CD4+CD127-Treg的百分比與血漿IL-6呈正相關〔16〕。來自小鼠的間充質干細胞顯示促進未定型的幼稚T細胞向叉頭框蛋白(Fox)P3+調節性T細胞的分化，該研究〔16〕表明，IL-6可能是調節T細胞平衡的關鍵介質。

關節滑膜中的炎性細胞浸潤是類風濕關節炎進展的突出特征之一。這些活化的炎癥細胞不斷分泌IFN-γ、IL-10、IL-6和TNF-α等促炎因子。這些過度表達的炎癥介質可能導致炎癥加重，導致軟骨和骨骼的破壞。在炎癥反應中，IL-10是由活化的巨噬細胞表達的重要細胞因子，在許多細胞活動如細胞增殖、分化甚至細胞凋亡中起重要作用〔17〕。IL-6被認為是一種內源性熱原，特別是在發熱和脂多糖(LPS)誘導的初始免疫反應中普遍存在〔18〕。TNF-α已經被鑒定為失調的免疫應答中的關鍵細胞因子，并且發現它的產生對于LPS處理的巨噬細胞中一氧化氮(NO)合成的協同誘導是至關重要的〔19〕。在滑液和血清中產生過量的炎癥標記后，可以同時檢測到炎癥信號的擴增及水腫、疼痛和關節活動受損的發生。本研究結果表明，帕瑞昔布鈉治療通過抑制大多數炎癥介質改善類風濕關節炎，并增加了氧化應激，阻斷了COX-2在疾病進展中表達的關鍵轉化。因此，帕瑞昔布鈉治療可以對促炎因子及其在慢性炎性疾病中的級聯反應具有廣泛而深刻的抑制作用。

IFN-γ是膠原誘導的關節炎起始和進展中的關鍵介質之一，它通過加速Bcl-2表達來加速關節軟骨的破壞和膠原合成的減少〔20〕。同時，IL-6炎癥信號參與Bcl-2依賴性細胞遷移和侵襲能力的調節。Bcl-2主要由間充質細胞、巨噬細胞和外周血單核細胞產生，過度表達與關節的病理生理變化密切相關。

綜上，帕瑞昔布鈉減輕骨關節炎模型應激誘導的調節性T細胞反應性升高和疼痛閾值。帕瑞昔布鈉可以限制關節破壞并逆轉病理生理改變，包括促炎性細胞因子減少，Bcl-2抑制，炎癥標志物減弱，炎癥細胞凋亡及氧化應激降低。帕瑞昔布鈉可能是骨關節炎治療的新型補充劑。