小兒咳喘靈顆粒質(zhì)量標準優(yōu)化

楊群，肖文濤，李韋

九江市檢驗檢測認證中心藥品分中心，江西 九江 332000

小兒咳喘靈顆粒配方源自經(jīng)典名方-麻杏石甘湯，是由張仲景所創(chuàng)，由七味藥材組成，分別是金銀花、麻黃、板藍根、甘草、瓜蔞等，味甜、辛、微苦，能夠清宣肺熱、止咳祛痰［1］，多用于治療上呼吸道感染引發(fā)的咳嗽，能夠有效改善支氣管炎、肺炎、哮喘患兒的肺功能及臨床癥狀［2-6］，主要不良反應(yīng)為嘔吐及腹瀉［7］。市售小兒咳喘靈顆粒的質(zhì)量一致性相對較差［8］，對其質(zhì)量標準進行研究有利于提高質(zhì)量標準和質(zhì)量控制。目前小兒咳喘靈顆粒有批準文號100 多個，執(zhí)行標準有部頒標準及不同企業(yè)注冊標準，存在不同程度內(nèi)容不完善、指標不合理、限度差異大等情況［8-11］。對小兒咳喘靈配方進行研究發(fā)現(xiàn)，方中麻黃為君藥，能夠宣肺、平喘、散寒［8,12］。麻黃堿是小兒咳喘靈制劑里面有明確藥效的一種主要成分，量化控制較好。金銀花味甘、性寒，能夠消炎、清熱、解毒，可治熱毒血痢，感染性疾病，其活性成分為綠原酸［13-16］。甘草味甘、性平，能夠補脾、祛痰、益氣、止痛，可治脾胃虛弱，心悸氣短［17-18］。瓜蔞在此前小兒咳喘靈顆粒的研究中未見報道。故本研究對瓜蔞、甘草進行薄層色譜鑒別研究，并采用高效液相色譜同時測定麻黃中鹽酸麻黃堿和金銀花中綠原酸含量，為進一步制定和完善小兒咳喘靈顆粒的質(zhì)量標準提供數(shù)據(jù)支持。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

高效液相色譜儀［沃特世公司E2695，帶紫外檢測器（沃特世公司2489）］；電子天平（賽多利斯公司BSA 124S、BP 211D）；超聲波清洗機（上海藝源超聲設(shè)備有限公司YIY-UL300W-C）；薄層色譜數(shù)碼成像系統(tǒng)（瑞士卡瑪公司TLC Visualizer）。

1.2 對照品

鹽酸麻黃堿（批號：171241-201007,含量以99.7%計）；綠原酸（批號：110753-201716，含量以98.0%計）；甘草苷（批號：111610-201106）；甘草對照藥材（批號：120904-201620）；瓜蔞對照藥材（批號：121596-201903）。均購自中國食品藥品檢定研究院。

1.3 樣品

小兒咳喘靈顆粒［葵花藥業(yè)集團（襄陽）隆中有限公司，批號：191103，191204，191206］。

1.4 試劑

硅膠G（德國默克公司，批號：1056260001）；薄層色譜板（德國默克公司）；乙腈（色譜純）；水為超純水；石油醚、乙酸乙酯、甲酸、冰醋酸、正丁醇均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 薄層鑒別

2.1.1 瓜蔞的薄層鑒別分別取樣品各2 g 于50 mL離心管中，加入40 mL 甲醇，混勻，超聲處理20 min，收集濾液，蒸干后加20 mL 水復(fù)溶，提取復(fù)溶液時分4 次加入40 mL 正丁醇，收集正丁醇液、蒸干得殘渣，再用2 mL 正丁醇溶解得供試品溶液。取瓜蔞對照藥材，相同方法制成對照藥材溶液。使用不含瓜蔞的模擬處方制成不含瓜蔞的空白樣品，取空白樣品，相同方法制成陰性樣品對照溶液。吸取5 μL 供試品、對照藥材、陰性樣品對照溶液，分別點于同一硅膠G 薄層板上，展開劑為甲酸：乙酸乙酯：石油醚（60～90 ℃）（0.1∶1∶4），先展開條帶，再取出，將展開后的薄層板晾干，均勻噴上10%的硫酸乙醇，加熱顯色至明晰（105 ℃），于365 nm 波長的紫外光燈下進行比對。供試品色譜中，在與對照藥材色譜相應(yīng)的位置上，顯相同顏色的主斑點，陰性無干擾。見圖1。

圖1 瓜蔞鑒別圖譜

2.1.2 甘草的薄層鑒別分別取樣品各2 g于回流瓶中，加入40 mL 甲醇，混勻，加熱回流30 min，濾過，收集濾液，蒸干后加20 mL 水復(fù)溶，提取復(fù)溶液時，分3 次加入60 mL 正丁醇，收集合并提取液，用20 mL水洗滌3 次，蒸干正丁醇液，得殘渣，再用5 mL 甲醇溶解得供試品溶液。取0.5 g 甘草對照藥材于回流瓶中，相同方法制得對照藥材溶液。取甘草苷對照品，加甲醇溶解稀釋得1 mg/mL 甘草苷對照品溶液。使用不含甘草的模擬處方制成不含甘草的空白樣品，取空白樣品，相同方法制成陰性樣品對照液。吸取2 μL上述六種溶液，分別點于同一硅膠G 薄層板（1%氫氧化鈉溶液制成）上，展開劑為乙酸乙酯∶水∶冰醋酸∶甲酸（15∶2∶1∶1），先展開條帶，再取出，將展開后的薄層板晾干，均勻噴上10%的硫酸乙醇，加熱顯色至明晰（105 ℃），于365 nm 波長的紫外光燈下進行比對。供試品色譜中，在與對照藥材色譜和對照品色譜相應(yīng)的位置上，顯相同顏色的斑點，陰性無干擾。見圖2。

圖2 甘草及甘草苷鑒別圖譜

2.2 含量測定

2.2.1 高效液相法色譜條件色譜柱：Venusil MP C18柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）；流動相：乙腈-0.1%磷酸，梯度洗脫，見表1；流速：1.0 mL/min；檢測波長：0～15 min，207 nm；15～25 min，327 nm；25～40 min，207 nm；柱溫：25 ℃；進樣量：10 μL。

表1 流動相梯度洗脫程序表

2.2.2 對照品制備精密稱取15.79 mg 鹽酸麻黃堿對照品，置25 mL 的容量瓶中，超聲15 min，加甲醇定容，得629.7 μg/mL 的鹽酸麻黃堿儲備液。精密稱取綠原酸對照品9.32 mg，置25 mL 的容量瓶中，超聲15 min，加甲醇定容，得365.3 μg/mL 的綠原酸儲備液。

2.2.3 樣品制備取樣品研細，精密稱取2 g，加入甲醇25 mL，稱重，超聲20 min（功率300 W，頻率25 kHz），放冷后再次稱重，用甲醇補足減少的重量，先搖勻，再濾過，然后取續(xù)濾液，即得樣品溶液。

按照顆粒處方比例和制備工藝制備出缺麻黃和金銀花的陰性對照制劑，同樣使用“樣品制備”的方法制得陰性對照溶液。

2.2.4 線性關(guān)系考察取綠原酸對照品儲備液，加入適量甲醇稀釋，制得1mL 中含18.3、36.6、73.2、183.0、366.0 μg 綠原酸的標準系列溶液，使用高效液相色譜儀進行測定，以其質(zhì)量濃度作為橫坐標，峰面積作為縱坐標，得出標準曲線。結(jié)果：回歸方程Y=21 084.595 2X+28.329 1，相關(guān)系數(shù)為0.999，說明綠原酸在18.3～366.0 μg/mL 范圍內(nèi)符合線性要求。

取鹽酸麻黃堿對照品儲備液，加入適量甲醇稀釋，制得1 mL 中含6.3、12.6、25.2、63.0、126.0 μg鹽酸麻黃堿的標準系列溶液，使用高效液相色譜儀進行測定，以其質(zhì)量濃度作為橫坐標，峰面積作為縱坐標，得出標準曲線。結(jié)果：回歸方程Y=25 351.509X-5 999.754 3，相關(guān)系數(shù)為0.999，說明鹽酸麻黃堿在6.3～126 μg/mL 范圍內(nèi)線性條件良好。

2.2.5 精密度考察取濃度為182.7 μg/mL 的綠原酸對照品溶液，按上述色譜條件連續(xù)測定6 次峰面積，相對標準偏差（RSD）為0.38%。取濃度為62.97 μg/mL 的鹽酸麻黃堿對照品溶液，按上述色譜條件連續(xù)測定6 次峰面積，RSD 為0.38%，符合精密度要求。

2.2.6 穩(wěn)定性考察取樣品2 g，精密稱定，按“2.2.3”的方法制備樣品溶液，分別放置0，2，4，8，12，24 h 后進樣測定，綠原酸峰面積RSD 為1.2%，鹽酸麻黃堿峰面積RSD 為1.1%，24 h 內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.2.7 加樣回收率實驗取六份樣品，每份2.0 g，精密稱定，分別置25 mL 量瓶中，各加入含鹽酸麻黃堿對照品（0.113 mg/mL）、綠原酸對照品（3.024 mg/mL）0.8、0.8、1.0、1.0、1.2、1.2 mL，加入 甲醇15 mL，超聲（功率300 W，頻率25 kHz）處理20 min，先定容，再搖勻，然后濾過，按色譜條件來測定含量，計算回收率。見表2，表3。

表2 綠原酸回收率

表3 鹽酸麻黃堿回收率

2.2.8 檢出限測定經(jīng)測定鹽酸麻黃堿的檢出限0.006 3 μg/mL，綠原酸的檢出限為0.000 36 μg/mL。

2.2.9 樣品含量測定精密稱取適量小兒咳喘靈顆粒樣品，按“2.2.3”的方法制備樣品溶液，按“2.2.1”項下色譜條件重復(fù)進樣測定4 次，計算樣品中2 種成分的含量，結(jié)果見表4。

表4 樣品測定含量（mg/g）

3 討論

查閱文獻，小兒咳喘靈顆粒中有檢測麻黃、金銀花等［19-23］的相關(guān)報道，但尚未見對瓜蔞有任何研究，對樣品質(zhì)量控制存在空白。本研究對瓜蔞進行TLC 鑒別研究，曾選用乙酸乙酯:甲酸:甲醇:水（12∶0.1∶1∶0.1）作為展開劑，但效果不好，有陰性樣品干擾，易造成假陰性。通過反復(fù)多次試驗，最終確定使用甲酸:乙酸乙酯:石油醚（60～90 ℃）（0.1∶1∶4）作為展開劑，展開效果良好，陰性無干擾。通過對18 家企業(yè)18 批樣品檢驗，結(jié)果有2 家樣品未檢出與瓜蔞對照藥材相同顏色的斑點，由于目前尚未見有任何標準對此有規(guī)定，提示是否存在投料風(fēng)險。

對于甘草鑒別，參考文獻，比較了甲醇超聲和甲醇回流后再用飽和正丁醇提取兩種方法，前種方法陰性樣品有一定的干擾，后種方法特異性強，陰性無干擾。

測定木犀草苷、綠原酸大多使用高效液相色譜法［15,22］，本研究將綠原酸和鹽酸麻黃堿兩個成分在一個系統(tǒng)中檢測出來，曾選用甲醇-0.1%磷酸、乙腈-0.1%磷酸和乙腈-水溶液（15∶85，用磷酸調(diào)節(jié)至pH3.0），最后確定的流動相為乙腈-0.1%磷酸溶液，用梯度洗脫的方式，取得較好分離效果，做到了檢測效率的提高和試驗成本的降低。

通過多批次樣品的調(diào)研檢驗發(fā)現(xiàn)，部頒標準執(zhí)行覆蓋面最廣，但項目設(shè)置不完善，僅有兩個理化鑒別項目，無法有效控制藥品質(zhì)量。各注冊標準項目設(shè)置差異大，項目設(shè)置不完善，相同指標方法及規(guī)定限度差別較大。為進一步完善統(tǒng)一現(xiàn)行質(zhì)量標準，本研究增加制劑中瓜蔞、甘草的薄層鑒別，增加麻黃、金銀花的有效成分指標控制，望能幫助企業(yè)提高產(chǎn)品質(zhì)量。

對18 家企業(yè)50 批樣品進行檢驗，其中綠原酸、麻黃堿最高含量分別為5.056、0.519 mg/g，最低含量分別為0.114、0.041 mg/g，分別相差了44 倍和12 倍。不同廠家乃至同一廠家不同批次生產(chǎn)的樣品中各成分含有量均有較大差異，質(zhì)量參差不齊，可能與藥材產(chǎn)地、采收季節(jié)、生產(chǎn)工藝等因素有關(guān)，具體原因有待進一步研究，提示相關(guān)監(jiān)管研究部門引起重視。