晚期糖基化終末產(chǎn)物的測(cè)量分析

王海璇 徐顧航 王智旖

摘要：晚期糖基化終末產(chǎn)物（AGEs）是人體內(nèi)過量糖與蛋白質(zhì)結(jié)合產(chǎn)物。人體內(nèi)AGEs有兩個(gè)來源，一種體內(nèi)過量糖與蛋白質(zhì)在體內(nèi)合成AGEs，另一種是通過食物攝入AGEs。體內(nèi)過量AGEs是誘發(fā)慢性炎癥的主要原因，本文就目前AGEs檢測(cè)方法進(jìn)行綜述。

關(guān)鍵詞：晚期糖基化終末產(chǎn)物;熒光檢測(cè)法;免疫學(xué)檢測(cè)法

晚期糖基化終末產(chǎn)物（AGEs）是葡萄糖或其他糖類衍生物與蛋白質(zhì)或脂質(zhì)通過非酶促反應(yīng)產(chǎn)生的。AGEs促進(jìn)氧化應(yīng)激反應(yīng)，活化多種轉(zhuǎn)錄因子并產(chǎn)生大量促炎細(xì)胞因子。AGEs包括羧甲基賴氨酸（CML）、羧乙基賴氨酸（CEL）、吡咯啉、戊糖苷和甲基乙二醛-賴氨酸二聚體（MOLD）等。目前生物樣本中AGEs的檢測(cè)方法主要為色譜法和免疫學(xué)法。色譜法包括HPLC/MS、GC-MS和LC-MS/MS等，免疫學(xué)法包括ELISA法和免疫印跡法。

AGEs熒光法檢測(cè)法非常簡單，是一種無創(chuàng)快速地檢測(cè)皮膚內(nèi)AGEs水平的方法。大量臨床研究結(jié)果也證實(shí)皮膚中AGEs熒光強(qiáng)度與HPLC法檢測(cè)所得血清總AGE濃度存在顯著相關(guān)性。由于糖化血紅蛋白僅能反映1個(gè)月以內(nèi)短期血糖水平的異常，而皮膚內(nèi)AGEs自發(fā)熒光水平已經(jīng)被證明是長期糖尿病患者預(yù)測(cè)并發(fā)癥發(fā)生的重要指標(biāo)。不同膚色也影響著皮膚內(nèi)AGEs自發(fā)熒光光水平，深色皮膚受試者AGEs測(cè)量值低于淺色皮膚者。皮膚內(nèi)AGEs水平與機(jī)體氧化應(yīng)激水平有關(guān)。高水平的氧化應(yīng)激反應(yīng)會(huì)誘發(fā)糖尿病并發(fā)癥的發(fā)生，該方法適用于健康人群和患病人群日常健康監(jiān)測(cè)。雖然皮膚內(nèi)AGEs自發(fā)熒光水平可以監(jiān)測(cè)個(gè)體的代謝健康水平，但仍存在局限性，如皮膚內(nèi)還存在各種其他熒光物質(zhì)（煙酰胺腺苷二核苷酸等），具有相同的激發(fā)和發(fā)射光譜范圍（分別為350～410 nm和420～600 nm），會(huì)產(chǎn)生干擾效應(yīng)，該技術(shù)在臨床中使用還需要進(jìn)一步完善。

現(xiàn)有的色譜學(xué)技術(shù)，包括質(zhì)譜和氣/液相色譜技術(shù)，可以精確的測(cè)定AGEs含量，但這些技術(shù)需要專業(yè)操作人員，且儀器成本也高昂。上述原因?qū)е逻@些技術(shù)難以廣泛使用。LC-MS/MS技術(shù)的靈敏度遠(yuǎn)高于熒光檢測(cè)法，該技術(shù)可以用于分析檢測(cè)樣本中非揮發(fā)性化合物。其一個(gè)顯著的特點(diǎn)是通常不需要衍生處理。GC-MS技術(shù)已經(jīng)廣泛用于血漿和尿液中兩種AGEs，包括CML和CEL的檢測(cè)分析，并可以精確定量分析食物樣本中 CML含量。目前還有一種基于超高壓液相色譜（UHPLC） 的新技術(shù)，可以實(shí)現(xiàn)更高的分辨能力和更快的分析速度。

免疫學(xué)方法具有簡便快速等優(yōu)勢(shì)，但制備高質(zhì)量的單克隆抗體是關(guān)鍵，但目前仍沒有定量檢測(cè)AGEs的標(biāo)準(zhǔn)免疫學(xué)方法。雖然ELISA法已廣泛用于檢測(cè)血清或其他生物樣本以及食物中的AGEs含量，該方法仍存在局限性，包括現(xiàn)有的抗體缺乏特異性，蛋白質(zhì)糖化交聯(lián)物易導(dǎo)致高檢測(cè)背景，以加熱或堿液預(yù)處理樣本易產(chǎn)生無糖化合物干擾。最新研究結(jié)果表明，人血漿或尿液以及各種食物中的CML可以代表總AGEs含量，并且ELISA法檢測(cè)CML結(jié)果可靠，與LC-MS/MS法檢測(cè)結(jié)果相關(guān)性顯著。此外，血清中AGEs、RAGEs 和sAGEs含量也可以通過蛋白質(zhì)印跡方法來測(cè)量。蛋白質(zhì)印跡技術(shù)較ELISA法具有更高的靈敏度和特異性，能夠檢測(cè)到樣品中僅0.1 ng的目的標(biāo)蛋白質(zhì)。盡管蛋白質(zhì)印跡技術(shù)具有很高的靈敏度和特異性，但它仍可能產(chǎn)生不可靠的結(jié)果。例如當(dāng)抗體與某種蛋白質(zhì)發(fā)生交叉反應(yīng)時(shí)則可能出現(xiàn)假陽性，當(dāng)大分子量蛋白質(zhì)沒有足夠時(shí)間完全轉(zhuǎn)移至PVDF膜上時(shí)則可能會(huì)出現(xiàn)假陰性。此外還可能會(huì)出現(xiàn)條帶褪色或多條帶等現(xiàn)象，并可能影響結(jié)果的判讀。總的來說，蛋白質(zhì)印跡技術(shù)的完成需要專業(yè)的實(shí)驗(yàn)人員和實(shí)驗(yàn)室設(shè)備，整個(gè)過程耗時(shí)耗力，任何一個(gè)步驟的細(xì)小錯(cuò)誤就可能會(huì)危及整個(gè)過程。蛋白質(zhì)印跡技術(shù)與ELISA技術(shù)的最大區(qū)別在于，蛋白質(zhì)印跡技術(shù)可以同時(shí)檢測(cè)多個(gè)目標(biāo)蛋白，而 ELISA法只檢測(cè)一種目標(biāo)蛋白，同時(shí)蛋白質(zhì)印跡技術(shù)還可以分析目標(biāo)蛋白的分子量。因此我們還可以通過蛋白質(zhì)印跡技術(shù)分定量分析待檢樣本中AGEs或RAGEs的含量。

總之，檢測(cè)樣本中AGEs含量的最佳技術(shù)的選擇取決于以下幾種因素，包括訓(xùn)練有素的人員、可用的實(shí)驗(yàn)室、資金和研究對(duì)象（AGE濃度、樣品數(shù)量、樣品類型等）。選擇合適的AGEs檢測(cè)方法可以為臨床診療提供可靠數(shù)據(jù)，而穩(wěn)定可靠的檢測(cè)數(shù)據(jù)可以為健康監(jiān)測(cè)、糖尿病患者體內(nèi)炎癥反應(yīng)水平和疾病嚴(yán)重程度評(píng)估提供可靠的實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)結(jié)果。

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作者簡介：王海璇（2000—），女，江蘇徐州人，本科在讀，研究方向（糖尿病及其并發(fā)癥發(fā)病機(jī)制研究）

本論文受江蘇大學(xué)大學(xué)生科研立項(xiàng)資助（20AD0131）