溶血性曼氏桿菌重要抗原的免疫原性分析

陸奕彤　李垚　楊發龍

摘要：旨在通過分析溶血性曼氏桿菌重要抗原的免疫原性，為疫苗和診斷試劑研制提供依據。在生物信息學分析的基礎上，構建溶血性曼氏桿菌lktA、ompA、plpE、plpF、ompP2和gs60基因的原核重組表達載體，并將其轉化至大腸桿菌BL21（DE3）中進行表達，獲得重組蛋白質。隨后用被抗溶血性曼氏桿菌感染的綿羊血清進行Western-blot和酶聯免疫吸附測定（ELISA），評價各蛋白質的免疫原性并篩選優勢免疫原;用各重組蛋白質免疫小鼠，評價免疫小鼠后誘導其產生的抗體水平，以評價各重組蛋白質作為重組疫苗的潛在價值。Western-blot和ELISA檢測結果表明，各重組蛋白質均具有良好的免疫原性，其中rLktA、rOmpA、rGs60與感染的綿羊血清結合能力最強，為優勢免疫原;各重組蛋白質免疫小鼠后均能誘導其產生體液免疫應答，其中rOmpA、rPlpE和rPlpF免疫小鼠后誘導其產生的抗體在免疫后35 d仍能與全菌蛋白質結合。研究結果為溶血性曼氏桿菌感染血清學診斷試劑的開發和新型疫苗的研制提供了重要的試驗數據。

關鍵詞：溶血性曼氏桿菌;重要抗原;免疫原性

中圖分類號：S852.61+2文獻標識碼：A文章編號：1000-4440（2022）02-0446-07

Immunogenicity analysis of major antigens of Mannheimia haemolytica

LU Yi-tong，LI Yao，YANG Fa-long

Abstract：The purpose of this study is to compare and analyze the immunogenicity of major antigens of Mannheimia haemolytica， and to provide a basis for the development of vaccines and diagnostic reagents. Based on bioinformatics analysis， prokaryotic expression vectors of lktA， ompA， plpE， plpF， ompP2 and gs60 genes were constructed and transformed into Escherichia coli BL21（DE3）， and recombinant proteins were expressed and purified. Subsequently， Western-blot and enzyme-linked immunosorbent assay （ELISA） were performed by using sheep anti-Mannheimia haemolytica serum to evaluate the immunogenicity of each protein， and to screen the dominant immunogens. Meanwhile， mice were immunized with each recombinant protein， and the antibody levels were tested to evaluate potential value of each protein as a recombinant vaccine. The results demonstrated that all tested proteins were good immunogens， while rLktA， rOmpA and rGs60 showed the strongest binding ability to infected sheep serum， suggesting that they were the dominant immunogens of Mannheimia haemolytica. All recombinant proteins could induce humoral immune response in mice， while rOmpA， rPlpE and rPlpF could induce high titer antibody after 35 days post immunization. These results provide important data for developing serological diagnostic tools and new vaccines.

Key words：Mannheimia haemolytica;important antigen;immunogenicity

溶血性曼氏桿菌（Mannheimia haemolytica）屬于巴氏桿菌科曼氏桿菌屬，是一種革蘭氏陰性兼性厭氧球桿菌。其作為一種條件致病菌，溶血性曼氏桿菌常存在于牛、羊等反芻動物上呼吸道中。當動物受到一些應激因素（如天氣驟變、長途運輸或病毒、支原體感染等）影響，造成機體免疫能力下降時，溶血性曼氏桿菌便可入侵動物肺部，引起動物發生嚴重的肺炎[1-2]。溶血性曼氏桿菌是公認的引起牛呼吸道綜合征（Bovine respiratory disease complex，BRDC）的主要病原[3]。近年來，越來越多的研究發現，溶血性曼氏桿菌同樣是導致綿羊和山羊等小反芻動物發生呼吸道疾病的重要病原[4]，還可以導致羔羊敗血癥和母羊乳房炎的發生[5-6]。

目前，中國還缺乏針對溶血性曼氏桿菌的使用廣泛且安全有效的商品化疫苗，同時也沒有特異、敏感的血清學診斷試劑，而國外使用的商品化疫苗僅能提供部分免疫保護[7]。因此，有必要對溶血性曼氏桿菌的病原特征及其重要的免疫原進行深入研究，從而有助于溶血性曼氏桿菌新型疫苗和血清學診斷試劑的研制。

國內外研究者已經在溶血性曼氏桿菌免疫原方面進行了一些相關研究，發現白細胞毒素（LKT）及OmpA、PlpE等多個外膜蛋白質等均具有良好的免疫原性，可誘導機體產生一定的免疫保護作用[8-10]。然而，雖然上述研究對一些潛在的診斷抗原和疫苗的候選蛋白質進行了評價，但對于其中哪些可以作為優勢免疫原誘導機體產生高水平免疫應答尚不清楚。此外，相關研究多以牛源菌株為對象，分析其感染牛后誘導牛產生的免疫應答情況，而對溶血性曼氏桿菌感染羊后誘導羊產生的免疫應答情況的報道甚少。

本研究分析比較了溶血性曼氏桿菌感染羊后LktA、OmpA、PlpE、PlpF、OmpP2、Gs60等6個重要免疫原在羊體內誘導產生的抗體水平以及這些免疫原的重組蛋白質在小鼠體內誘導產生的免疫應答水平，從而為血清學診斷試劑的開發和新型疫苗的研制提供有用的試驗數據。

1材料與方法

1.1菌株、載體及血清

溶血性曼氏桿菌臨床分離株S4由筆者所在實驗室（西南民族大學青藏高原動物遺傳資源保護與利用教育部重點實驗室）分離鑒定和保存;pET-28α（+）載體為Novagen公司產品;大腸桿菌E.coil DH5α、BL21（DE3）感受態細胞為天根生化科技（北京）有限公司產品;35份溶血性曼氏桿菌感染綿羊血清及3份陰性血清由筆者所在實驗室收集并保存。

1.2主要試劑

氨芐青霉素、卡那霉素、異丙基-β-D-硫代半乳糖苷（IPTG）購自美國Sigma公司;金牌Mix（green）Golden Star T6 Super PCR Mix（1.1×）購自北京擎科信業生物公司;核酸相對分子質量標準DNA marker、蛋白質相對分子質量標準品、限制性內切酶Bam HⅠ、XhoⅠ與T4 DNA連接酶購自日本TaKaRa公司;Gel Extraction Kit、Plasmid Miniprep Kit、Cycle Pue Kit購自美國Omega公司;鎳金屬螯合親和[組氨酸（His）標簽蛋白]蛋白質純化柱購自常州天地人和生物科技有限公司;27 mm透析袋（相對分子質量：35 000）購自廣州賽國生物科技有限公司;辣根過氧化物酶（HRP）標記驢抗綿羊、HRP標記山羊抗鼠、SuperLumia ECL HPR Substrate Kit購自美國Abbkine公司;磷酸緩沖鹽溶液（PBS）、酶標抗體稀釋液、血清稀釋液、3，3′，5，5′-四甲基聯苯胺（TMB）顯色液、終止液購自武漢博士德生物工程有限公司;二喹啉甲酸（BCA）蛋白質定量試劑購自江蘇凱基生物技術股份有限公司;酶標板購自Corning公司。

1.3引物設計

為制備原核表達重組蛋白質，對ompA、plpE、plpF、ompP2、gs60基因全長編碼序列（CDS）進行克隆;對于lktA基因，對其2 019～2 819位核苷酸編碼序列進行截短表達。PCR擴增引物用Primer Premier 5軟件設計，由生工生物工程（上海）股份有限公司合成，引物具體信息見表1。

1.4PCR擴增

采用常規酚-三氯甲烷法從溶血性曼氏桿菌S4株中提取總DNA作為模板，利用表1中的引物對各基因片段進行PCR擴增。反應總體系為20 μl，包括Mix（green）Golden Star T6 Super PCR Mix（1.1×）（5 U/μl）10 μl，上游引物、下游引物各1 μl，DNA模板2 μl，去離子水6 μl。反應條件：95 ℃預變性 5 min;94 ℃變性30 s，退火30 s（lktA、ompA、plpF、plpE、ompP2、gs60基因對應的退火溫度分別為60.0 ℃、58.0℃、63.0 ℃、57.7 ℃、57.8 ℃、55.9 ℃）;72.0 ℃延伸（其中gs60基因延伸1 min 30 s，其他基因均延伸40 s），共35個循環;72.0 ℃延伸10 min，16 ℃結束反應。PCR產物用1.5%瓊脂糖凝膠電泳進行檢測。

1.5原核表達載體的構建

利用Gel Extraction Kit對上述各PCR產物進行回收純化。隨后用限制性內切酶Bam HⅠ、Xho Ⅰ對pET-28a（+）載體及純化的目的片段進行雙酶切。利用Cycle Pue Kit純化酶切產物，采用T4 DNA連接酶進行連接反應。將連接產物轉化至DH5α感受態細胞中，然后將重組質粒DH5α工程菌涂布于含有卡那霉素（50 μg/ml）的LB瓊脂選擇培養基上。第2 d挑取疑似陽性菌落，利用質粒提取試劑盒Plasmid Miniprep Kit對其進行質粒提取，隨后進行PCR鑒定和Bam HⅠ、XhoⅠ雙酶切鑒定，將鑒定為陽性的樣本送至生工生物工程（上海）股份有限公司進行測序確認。

1.6重組蛋白質的誘導表達和可溶性分析

將pET-28a（+）-X轉化至Escherichia coli BL21（DE3）感受態細胞中，獲得表達工程菌，將表達工程菌菌種按1∶100的體積比接入100 ml LB液體培養基（卡那霉素質量濃度為50 μg/ml）中，將終濃度為1 mmol/L的IPTG于37 ℃誘導表達9 h，然后取2 ml菌液，于8 000 r/min、4 ℃離心15 min，收集菌體，經pH值為7.4的PBS重懸，與等體積的2×SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳（PAGE）上樣緩沖液混合，加熱煮沸5 min，通過含量為12%的分離膠進行SDS-PAGE檢測。

將檢測正確的樣本在冰水浴中通過超聲波破碎儀于400 W破碎20 min（超聲2 s+暫停6 s為1個循環），破碎后于12 000 r/min、4 ℃離心15 min，分別收集沉淀、上清。取少許沉淀，經pH值為7.4的PBS重懸，然后將沉淀、上清均用含量為12%的分離膠進行SDS-PAGE，對重組蛋白質進行可溶性分析。

1.7重組蛋白質的純化

將上述誘導表達后的菌液于8 000 r/min、4 ℃離心15 min，收集菌體并用PBS重懸，在冰浴中進行超聲破碎（400 W，20 min）。破碎后于12 000 r/min、4 ℃離心15 min，棄去上清，收集沉淀，將沉淀用破碎Buffer（Binding Buffer）溶解，在冰浴中進行二次超聲破碎，于400 W破碎20 min（超聲2 s+暫停 6 s為1個循環），破碎后于12 000 r/min、4 ℃離心20 min，收集上清液，進行鎳瓊脂糖親和層析純化。最后將制備好的各組分蛋白質置于-80 ℃冰箱中保存。

1.8優勢免疫原的篩選

為評價溶血性曼氏桿菌感染羊后蛋白質rOmpA、rPlpE、rPlpF、rOmpP2、rGs60誘導免疫應答的能力，篩選能夠與感染動物血清抗體高效結合的優勢免疫原，以上述純化的各重組蛋白質作為包被抗原，分別以臨床感染綿羊陽性血清、陰性血清作為一抗，進行間接酶聯免疫吸附劑測定（ELISA）。主要過程如下：每孔用100 μl、5 μg/ml重組蛋白質包被酶標板，用PBST（500 ml PBS+25 μl Tween-20）洗滌3次后再用5%（質量體積比）脫脂奶粉在37 ℃作用2 h進行封閉，洗滌3次后加入100 μl按1∶200稀釋的臨床感染動物血清或陰性血清，在37 ℃孵育1 h，洗滌5次后加入100 μl按1∶6 000稀釋的辣根過氧化物酶（HRP）標記驢抗綿羊免疫球蛋白（IgG），37 ℃孵育45 min，洗滌5次后加入100 μl底物3，3′，5，5′-四甲基聯苯胺（TMB），室溫下顯色10 min，加入100? μl終止液，并在酶標儀上讀取OD450。

1.9重組蛋白質的免疫原性分析

將40 μg重組蛋白質與ISA 201佐劑按等體積混合進行乳化，分別免疫6只6～8周齡的雌性BALB/c小鼠，并設PBS對照組。首次免疫14 d后用相同劑量進行二次免疫，并分別于首次免疫后0 d、7 d、14 d、21 d、28 d、35 d采集小鼠血清。以各重組蛋白質作為包被抗原（1孔50 ng），以按1∶50比例稀釋的小鼠血清為一抗進行間接ELISA檢測，從而評價各重組蛋白質誘導產生的抗體水平（用OD450表示）。

2結果與分析

2.1溶血性曼氏桿菌重要抗原編碼基因的PCR擴增

為了構建重要抗原編碼基因的原核表達載體，利用表1中的引物對各基因片段進行PCR擴增，結果均獲得與預期大小一致的條帶，詳見圖1。

2.2原核表達載體的構建及鑒定結果

對目的片段和pET-28a（+）載體進行雙酶切后，將酶切所得基因分別與pET-28a（+）連接，并用連接后的載體分別轉化DH5α感受態細胞，再用含有卡那霉素的LB瓊脂平板篩選疑似陽性菌落，培養后提取質粒，對質粒進行特異性PCR鑒定，且使用Bam HⅠ和XhoⅠ對質粒進行雙酶切鑒定。結果表明，除了在相應位置出現與預期相符的目的條帶外，還在5 800 bp左右處出現了條帶。此外，測序結果顯示，6個質粒均為陽性質粒，表明本研究成功構建了6個重組原核表達載體。

2.3重組蛋白質的誘導表達和可溶性分析

將誘導的菌液離心，用PBS重懸沉淀并洗滌沉淀后在冰水浴中進行超聲破碎，破碎完成后，離心分離上清液和沉淀，分別使用上清液、沉淀進行SDS-PAGE。可溶性分析檢測結果顯示，6個重組蛋白質破碎后的上清液中均沒有出現條帶，而沉淀中出現與預期相符的目的條帶（圖2），說明6個重組蛋白質都以包涵體的形式表達。

2.4重組蛋白質的純化

將菌體經過第1次PBS重懸破碎洗滌后，留下的沉淀再用含有8 mol/L尿素的Buffer Ⅱ 溶解破碎，將離心后留下的上清液過鎳柱，進行鎳柱親和層析純化。在洗雜和洗脫過程中，使用具有不同咪唑濃度（20 mmol/L、50 mmol/L和500 mmol/L）的Wash Buffer進行梯度洗脫，對收集到的蛋白質進行SDS-PAGE檢測。由圖3可以看出，各基因對應的重組蛋白質經電泳后均有單一且符合預期大小的目的條帶，表示重組蛋白質的純化效果良好。對純化結果良好的蛋白質組分進行透析復性、濃縮及二喹啉甲酸（BCA）試劑盒蛋白質濃度檢測，以便進行進一步的研究。

2.5優勢免疫原的篩選結果

使用按上述步驟制備的純化重組蛋白質作為包被抗原，以臨床感染動物血清及陰性血清作為一抗，進行間接ELISA檢測，其目的是為了能夠篩選與感染動物血清高效結合的優勢免疫原。由圖4可以看出，溶血性曼氏桿菌感染羊后，本研究選擇的6種免疫原蛋白質在綿羊體內產生的6種抗體水平存在明顯差異，可見不同重組蛋白質與感染血清的結合能力也有差異，按OD值從高到低排序為 rOmpA、rLktA、rGs60、rPlpE、rOmpP2、rPlpF。由此可見，rOmpA、rLktA和rGS60是進行溶血性曼氏桿菌血清學診斷試劑開發的良好候選蛋白質。

2.6重組蛋白質疫苗誘導小鼠產生的抗體水平

為了評價制備的重組蛋白質作為亞單位疫苗候選蛋白質的潛力，將具有相同蛋白質劑量（40 μg）并且經無菌檢驗及物理性狀檢驗的重組蛋白質疫苗分組后經皮下注射免疫小鼠，以免疫后不同時間的小鼠血清作為一抗，以純化的重組蛋白質作為包被抗原，進行間接ELISA檢測，以評價重組蛋白質免疫小鼠后能否使小鼠產生特異性抗體、抗體水平的變化及抗體的持續時間。由圖5可以看出，6個重組蛋白質均能使小鼠產生免疫應答，其中rLktA、rOmpA、rPlpE、rPlpF、rGs60經過2次免疫后，抗體水平不斷上升，并持續至試驗首免后35 d仍未下降。其中，rOmpA產生的抗體水平較高;rOmpP2產生的抗體水平較低，并且持續時間較短，在首免后28 d開始下降。由此可見，除rOmpP2外，其他重組蛋白質均具有作為亞單位疫苗候選蛋白質的潛力。

2.7抗重組蛋白質抗體與溶血性曼氏桿菌全菌蛋白質結合能力的評價

為了評價各重組蛋白質免疫后產生的抗體能否與溶血性曼氏桿菌的菌體結合，從而具有潛在的免疫保護作用，以各重組蛋白質免疫小鼠后的血清作為一抗、以制備的溶血性曼氏桿菌全菌蛋白質作為包被抗原進行ELISA檢測。由圖6可以看出，rOmpA、rPlpE、rPlpF免疫后誘導產生的抗體能與溶血性曼氏桿菌的全菌蛋白質高效結合，抗體水平明顯高于陰性對照，并且在免疫后35 d仍能與全菌蛋白質結合。由此可見，rOmpA、rPlpE、rPlpF可能具有潛在的免疫保護作用。

3討論

溶血性曼氏桿菌作為引起牛、羊等反芻動物呼吸道疾病的重要病原，給國內外養殖業造成了巨大的經濟損失[11-13]，僅在北美地區，每年給肉牛養殖業造成的經濟損失就高達數十億美元[14]，因此對該病進行有效控制尤為緊迫。開發敏感的診斷工具和高效的疫苗是對該病進行防控的重要措施[15]，目前國外使用的商品化疫苗僅能提供部分免疫保護[7]。因此，為了更好地對該病進行防控，有必要對溶血性曼氏桿菌的免疫原分子進行更全面的認識，國內外學者已進行了一些相關研究。例如，2010年Ayalew等[16，9]通過免疫蛋白質組學分析證實了55種可能具有免疫原性的溶血性曼氏桿菌的外膜蛋白質，包括OmpA、OmpP2、LktA、PlpE等。其中，脂蛋白PlpE是最早發現于溶血性曼氏桿菌中的一種脂蛋白，Yalew等[17]通過對PlpE的研究發現，重組PlpE免疫牛后可誘導牛產生良好的免疫應答，隨后他們用重組溶血性曼氏桿菌OmpA對牛進行免疫，用補體介導的方式刺激機體產生了高抗體反應[8]。Omaleki等[18]后來將PlpE與LktA進行融合表達，結果表明，融合表達后免疫小鼠能夠使其產生良好的保護效果。為了進一步評價溶血性曼氏桿菌中各重要功能蛋白質在感染動物后的免疫原性，并篩選適合的免疫原蛋白質，后續進行血清學診斷方法的研究和新型疫苗的研制。本研究從綿羊源溶血性曼氏桿菌中對lktA、ompA、plpE、plpF、ompP2、gs60等6個基因進行了克隆和原核表達，隨后評價了各蛋白質的免疫原性及重組蛋白質誘導機體產生的免疫應答水平。

建立血清學檢測方法的關鍵是所采用的抗原能否與大多數臨床感染血清反應，并且能夠高效結合。為了篩選溶血性曼氏桿菌中適合作為診斷抗原的優勢免疫原蛋白質，本研究采用間接ELISA方法分析比較了6種免疫原與35份臨床感染陽性血清和3份陰性血清的結合反應能力，結果發現，雖然所有6種蛋白質均能不同程度地與臨床感染血清結合，但各自的結合能力有差別。其中rOmpA、rLktA、rGs60可與絕大多數感染動物血清反應，且具有很強的結合能力，說明它們是優勢免疫原，可以作為溶血性曼氏桿菌血清學診斷試劑開發的良好候選蛋白質。但是，各蛋白質作為診斷抗原的特異性還需要進行進一步的驗證。

開發新型亞單位疫苗是溶血性曼氏桿菌疫苗研發的重要方向。作為疫苗候選蛋白質，必須在免疫后能誘導機體產生強烈和持續的免疫應答。本研究采用制備的6種重組蛋白質免疫小鼠，發現所有重組蛋白質均可以誘導機體產生較高水平的體液抗體。其中，rLktA、rOmpA、rPlpE、rPlpF、rGs60免疫后產生的抗體水平高，且在試驗結束時（免疫后35 d）仍可保持較高水平，說明上述5種重組蛋白質，特別是rOmpA具有作為亞單位疫苗候選蛋白質的潛力。

本研究在優勢免疫原篩選評價中rLktA能夠檢測出更多的陽性血清，是作為血清學診斷試劑開發的良好候選蛋白質。然而，采用rLktA免疫小鼠后產生的特異性抗體與溶血性曼氏桿菌全菌蛋白質的結合能力較弱，可能是由于白細胞毒素（LKT）在溶血性曼氏桿菌生長的對數期分泌于培養液的上清液中[19]，作為釋放于胞外的毒素蛋白質，在全菌蛋白質中其成分含量很低。因此，作為溶血性曼氏桿菌最為重要的毒力因子，在開發新型亞單位疫苗時，將OmpA、PlpE與LKT進行融合表達將是重要的策略之一。

本研究對6個重要的溶血性曼氏桿菌免疫原蛋白質的免疫原性及其重組蛋白質誘導的體液免疫應答水平進行了比較分析，為進一步將這些蛋白質作為抗原開發血清學診斷試劑和新型疫苗提供了重要的參考依據。

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（責任編輯：徐艷）

收稿日期：2021-09-06

基金項目：四川省重點研發項目（2021YFN0008）;西南民族大學研究生創新項目（CX2020SZ57）

作者簡介：陸奕彤（1996-），女，遼寧錦州人，碩士研究生，研究方向為動物病原生物學。（E-mail）981489868@qq.com

通訊作者：楊發龍，（E-mail）yang.falong@swun.edu.cn