雞let-7b在不同生長時期及不同組織中的表達及其生物信息學分析與靶基因預測

黃正洋　王錢?！↑S華云　李春苗　穆春宇　黎壽豐　趙振華

摘要：為探究let-7b在雞不同生長時期和不同組織中的表達規律及生物信息學特點，以蘇禽3號肉雞為試驗材料，檢測雞let-7b在不同時期和不同組織中的表達變化，通過生物信息學工具對常見脊椎動物的let-7b序列特點及基因組定位進行分析，構建系統進化樹，并對靶基因進行預測。結果表明，在雞大腦、心、胸肌和腿肌中，let-7b的相對表達量較高，且90日齡相對表達量顯著高于3日齡。let-7b位于1號染色體基因間隔區，不同物種let-7b的成熟序列同源性較高，進化樹分析結果表明，雞let-7b與鳥類聚為一類。靶基因預測分析共獲得263個靶基因，對獲得的靶基因進行基因本體（GO）功能富集分析，發現靶基因主要富集到蛋白質泛素化、miRNA介導的翻譯抑制和mRNA 3′-非翻譯區（3′-UTR）結合等方面。KEGG通路分析發現，靶基因主要富集到絲裂原活化蛋白激酶（MAPK）、轉化生長因子β（TGF-β）通路和卵母細胞減數分裂等通路?？傊ulet-7b在組織中廣泛表達，物種間較為保守;結合靶基因富集分析結果，推測let-7b可能通過靶向MAPK和TGF-β等信號通路參與調控雞肌肉生長及細胞增殖分化。

關鍵詞：let-7b;靶基因;生物信息學;表達分析;雞

中圖分類號：S831.2文獻標識碼：A文章編號：1000-4440（2022）02-0429-09

Expression of let-7b in different growth stages and different tissues of chicken and its bioinformatics analysis and target gene prediction

HUANG Zheng-yang，WANG Qian-bao，HUANG Hua-yun，LI Chun-miao，MU Chun-yu，LI Shou-feng，ZHAO Zhen-hua

Abstract：For the object of exploring the expression pattern and bioinformatics characteristics of let-7b in different growth stages and different tissues of chickens， Suqin 3 broiler was used as experimental animal， and the expression changes of chicken let-7b in different growth stages and different tissues were detected. Bioinformatics tools were used to analyze characteristics and genome location of let-7b sequences of common vertebrates， phylogenetic tree was constructed and target genes were predicted. The results showed that， the relative expression levels of let-7b in the brain， heart， pecloralis muscle and leg muscle of chickens were higher than in other tissues. The relative expression level of let-7b in chickens of 90 days age was significantly higher than in chickens of three days age. Gene mapping analysis revealed that， let-7b of chickens was located in the intergenic region on chromosome 1， and the mature sequences of let-7b in different species showed high homology. Results of phylogenetic tree analysis indicated that， let-7b of chickens and let-7b of birds assembled into one category. Target gene prediction revealed that， a total of 263 target genes were obtained. Through functional enrichment analysis of gene ontology （GO） for the obtained target genes， it was found that， let-7b targeted genes were mainly enriched in protein ubiquitination， miRNA-mediated translation inhibition and mRNA 3′-untranslated region （3′-UTR） binding. KEGG pathway analysis showed that， target genes were mainly enriched in mitogen-activated protein kinase （MAPK） signaling pathway， transforming growth factor-β （TGF-β） signaling pathway and progesterone-mediated oocyte meiosis pathway. In conclusion， let-7b of chicken is widely expressed in tissues and is relatively conserved among species. Considering the results of target gene enrichment analysis， it is speculated that let-7b may participate in the regulation of muscle growth and cell proliferation and differentiation through signaling pathways such as targeting MAPK and TGF-β.

Key words：let-7b;target gene;bioinformatics;expression analysis;chicken

肉雞可以提供肌肉產品，如何提高肌肉的產量和質量，是肉雞育種研究的重要領域之一[1]。近年來，在肉雞飼料配方沒有突破性改進的情況下，對于肉雞肌肉生長的研究主要集中在功能基因的研究上。多個調控肌肉生長的功能基因被克隆出來，其在各個組織中的表達規律也被研究，但是對這些功能基因的調控，卻缺乏深入研究[2-3]。研究相關miRNA在組織中的表達變化規律，對其靶基因進行預測分析，能夠在生物信息學基礎上深入了解相關miRNA的調控機制。

let-7是21世紀初在秀麗隱桿線蟲（Caenorhabditis elegans）中首先發現的miRNA，在細胞的分化、增殖和凋亡等過程中發揮著重要作用[4]。有研究結果表明，let-7有高度的保守性、組織特異性和時空表達性[5]。目前，共發現13個let-7家族成員，廣泛存在于動物各個組織細胞中。赫曉燕等[6]研究了成年羊駝耳部和背部皮膚組織中的miRNA差異，發現let-7b可能參與了皮膚和毛囊更新、生長發育及毛發生長品質的調控。吳明林等[7]利用Solexa測序技術從牙鲆中成功鑒定出let-7家族的10個成員，研究發現，let-7是時序發育過程中的重要調控因子，在促進幼體向成體轉變的發育過程中起著極其重要的作用。曹蕊[8]研究了let-7家族在不同類型豬卵泡中的表達變化，并通過多種試驗技術驗證了let-7對顆粒細胞的影響，推測let-7家族參與調控豬卵泡閉鎖過程，促進顆粒細胞凋亡。江倩[9]研究了let-7a在絨山羊毛囊發育周期中的表達，發現其在不同生育時期均有表達，且Cmyc和FGF5是let-7a的靶基因。目前對let-7的研究，大部分集中在其對哺乳動物卵泡顆粒細胞增殖凋亡方面，對家禽特別是雞肌肉生長的研究還比較少。

鑒于let-7b與肌肉生長及卵母細胞增殖分化的關系密切，本研究以蘇禽3號肉雞為試驗材料，通過文獻和miRBase檢索脊椎動物的let-7b序列，利用Ensembl數據庫確定典型物種的let-7b在基因組中的位置，根據let-7b前體序列構建系統進化樹;使用miRmap、miRDB和TargetScan網站預測let-7b靶基因，并進行基因本體（GO）功能富集分析和KEGG信號通路分析;利用RT-qPCR技術檢測不同生長時期雞let-7b在各個組織中的表達變化，為進一步揭示let-7b在雞骨骼肌生長及細胞增殖分化中的調控作用提供參考。

1材料與方法

1.1試驗材料

選取江蘇省家禽科學研究所選育的蘇禽3號肉雞為試驗對象，隨機選取1日齡健康雛雞（母雞）300羽，在相同的管理條件下飼養，自由采食與飲水，并按常規免疫程序接種。試驗在江蘇省家禽科學研究所邵伯試驗基地進行。肉雞3日齡（生長初期）和90日齡（上市前）時，分別隨機選取5羽母雞取心、肝、腎、胸肌、腿肌、大腦和卵巢等樣品，液氮冷凍保存備用。

1.2主要試劑與儀器

miRcute miRNA提取分離試劑盒（DP501）、miRcute增強型miRNA cDNA第一鏈合成試劑盒（KR211）、miRcute增強型miRNA熒光定量檢測試劑盒（FP411））均購自天根生化科技（北京）有限公司;96孔熒光定量PCR板和 RNase free ddH2O、無酶槍頭、離心管均購自生工生物工程（上海）股份有限公司。5810R高速離心機和PCR儀均購自德國Eppendorf公司，7500實時熒光定量PCR儀購自美國ABI Applied Biosystems公司。

1.3引物設計與合成

根據miRbase上雞gga-let-7b序列（登錄號：MIMAT0026503），利用miRNA Design V1.01軟件設計實時熒光定量引物（加尾法），以U6為內參基因，引物均由生工生物工程（上海）股份有限公司合成，引物信息如表1所示。

1.4miRNA第一鏈cDNA的反轉錄合成

采用miRNA提取分離試劑盒分別提取各組織樣品總RNA。每個樣品取3 μl總RNA，采用加A法進行miRNA第一鏈cDNA的反轉錄，具體步驟按試劑盒說明書進行操作。20.0 μl反應體系為：Total RNA 2 μg，2×miRNA RT Reaction Buffer 10.0 μl，1×miRNA RT Enzyme Mix 2.0 μl，RNase-Free ddH2O補至20.0 μl。反應程序為42 ℃ 60 min，95 ℃ 3 min。合成的cDNA反應液可放置于-20 ℃保存，以備下游熒光定量檢測。

1.5let-7b在雞不同組織內的定量表達檢測

采用SYBR Green I 嵌合熒光法進行miRNA熒光定量檢測，反應條件和程序按照miRcute增強型miRNA熒光定量檢測試劑盒說明書操作。PCR反應在Applied Biosystems 7500熒光定量PCR系統中進行，U6作為內參基因。20.0 μl反應體系：2×miRcute Plus miRNA PreMix （SYBR&ROX） 10.0 μl、上游引物 1.0 μl、下游引物 0.4 μl、miRNA第一鏈cDNA 1.0 μl、50×ROX Reference Dye 1.6 μl，加ddH2O補足。反應程序為95 ℃ 15 min，預變性;94 ℃變性20 s，60 ℃延伸34 s，45個循環;熔解曲線分析。每個樣本重復3次，采用2-△△Ct計算miRNA相對表達量。

1.6let-7b序列的獲得

從miRBase 22.1（http：//www.mirbase.org/）[10]網站下載全部物種miRNA成熟序列，篩選let-7b序列，去除植物以及不常見物種的miRNA序列，只保留脊椎動物的miRNA成熟序列及前體序列。let-7b序列統計結果如表2所示。

1.7let-7b基因定位及序列分析

采用Ensembl數據庫的BLAST程序（http：//asia.ensembl.org/index.html），以牛、家犬、山羊、斑馬魚、雞、人、小鼠、家兔、綿羊和斑胸草雀等10個物種的let-7b前體序列作為查詢序列對其基因組數據庫進行搜索，以確定let-7b在基因組染色體上的位置。選取46種典型物種的46條let-7b的成熟序列，使用MEGA 11.0軟件[11]（https：//www.megasoftware.net/）中Clustal W程序對let-7b基因的成熟序列進行多序列比對（Multiple sequences alignment，MSA），分析序列特點。

1.8系統發生分析

選取46種典型物種的46條let-7b的前體序列，使用MEGA 11.0軟件中Clustal W程序進行多序列比對分析，采用基于距離參數的鄰接法（Neighbor-joining， NJ），并自展分析（Bootstrap） 1 000次，構建let-7b基因的系統進化樹。

1.9let-7b靶基因預測及功能分析

利用3個在線軟件miRmap[12]（https：//mirmap.ezlab.org/）、miRDB[13-14]（http：//www.mirdb.org/.org/）和TargetScan[15]（http：//www.targetscan.org/vert_71/）預測gga-let-7b的靶基因。選取在3個軟件預測中至少出現2次的基因，既可以防止預測到的靶基因過少無法進行后續分析，也能夠降低預測結果的假陽性。對獲得的靶基因使用在線工具DAVID[16]（https：//david.ncifcrf.gov/）進行GO（Gene ontology，GO）功能分析和KEGG pathway（Kyoto encyclopedia of genes and genomes pathway）富集分析。

1.10數據處理

采用2-△△Ct法分析let-7b基因在雞不同組織中的相對表達量，每個樣品重復3次。試驗結果用平均數±標準差（Mean±SD）來表示。用SPSS 26.0軟件單因素方差分析進行差異性分析，以P<0.05作為差異顯著的標準，P<0.01作為差異極顯著的標準。

2結果與分析

2.1let-7b在雞不同組織中的表達檢測

對雞胸肌、腿肌、心和肝等組織中的let-7b表達變化進行了檢測，結果（圖1）顯示，let-7b在雞大腦、心、胸肌和腿肌中的相對表達量顯著高于其他組織（P<0.05）。對3日齡和90日齡的母雞組織器官中let-7b表達變化進行檢測，發現與3日齡的雛雞相比，90日齡雞大腦、心、胸肌和腿肌中let-7b的相對表達量都顯著上升（P<0.05），肝、卵巢和腎中let-7b的相對表達量差異不顯著（P>0.05）。

2.2let-7b基因定位

通過文獻和miRBase檢索共搜索46種脊椎動物46條let-7b序列，發現雞、人、小鼠、家犬和綿羊等46種脊椎動物都只具有let-7b一種形式。由于家族基因命名的不同，導致let-7b呈現出以下2種名稱變化：let-7b和let-7b-5p，在雞中也只發現了一種let-7b的成熟體。

以雞、人、小鼠和斑馬魚等10個物種的let-7b前體序列作為查詢序列，分別對這些生物的基因組進行BLAST搜索，確定各序列在基因組中的位置，基因定位結果（表3）顯示，let-7b家族的成員均位于基因間隔區，且主要分布在1號和5號等染色體上，大部分在過氧化物酶體增殖物激活受體基因（PARAA）和無翅型鼠乳腺腫瘤病毒（MMTV）整合位點家族成員7B基因（WNT7B）附近。其中雞let-7b位于1號染色體上WNT7B與PPARA基因間隔區。

2.3let-7b序列分析

選取46種典型物種的46條let-7b的成熟序列進行多序列比對分析，結果如圖2所示，let-7b的成熟序列同源性很高，序列長度相近，均為21～22 nt，保守的堿基數18個，分別為第1～11位堿基、第13～14位堿基、第16～18位堿基以及第20～21位堿基，說明let-7b在不同物種間高度保守。圖2顯示，let-7b在部分物種中第12位和第15位堿基出現了G>U突變，在第19位堿基出現了G>A突變，在第22位末端的堿基存在不同程度的缺失。

2.4let-7b系統進化樹的構建

采用MEGA 11.0軟件，以代表性物種的let-7b序列構建基于距離參數的鄰接法系統發育進化樹。結果（圖3）顯示，let-7b基因主要分布于哺乳類、鳥類、魚類和兩棲類動物中，而雞的let-7b與斑胸草雀等其他鳥類聚為一類，哺乳動物的let-7b獨自聚為一類。這表明let-7b基因在鳥類、魚類和哺乳動物中廣泛存在。

2.5let-7b靶基因預測及功能分析

使用3種miRNA在線靶基因預測軟件（miRDB、TargetScan和miRmap）分別預測到564個、360個和717個gga-let-7b靶基因，取3個軟件預測結果中至少出現2次的基因，并集后共得到263個靶基因（圖4）。

對預測獲得的靶基因使用在線工具DAVID進行GO功能富集分析，結果如圖5所示。在生物學過程分類中，靶基因主要富集到DNA模板的轉錄調控、細胞對氨基酸刺激的反應、泛素依賴性蛋白質分解代謝過程、蛋白質泛素化、細胞遷移的正調控、miRNA介導的翻譯抑制、蛋白激酶B信號的正調控、基因表達調控和細胞對轉化生長因子β（TGF-β）刺激的反應等過程。在細胞組分分類中，靶基因主要富集到細胞質、細胞核、核膜、細胞內膜結合的細胞器、細胞質mRNA加工體、IV型膠原三聚體和干細胞因子（SCF）泛素連接酶復合物中。在分子功能分類中，靶基因主要富集到金屬離子結合、轉錄因子活性（序列特異性DNA結合）、細胞外基質結構成分、核苷酸結合、受體信號蛋白絲氨酸/蘇氨酸激酶活性、miRNA結合和mRNA 3′-非翻譯區（3′-UTR）結合等分子功能。對靶基因進行KEGG pathway富集分析，結果如圖6所示，靶基因主要富集到焦點粘連、細胞外基質受體的相互作用、絲裂原活化蛋白激酶（MAPK）信號通路、卵母細胞減數分裂、TGF-β信號通路和孕酮介導的卵母細胞成熟等通路。

3討論

let-7b是let-7家族的重要成員之一，let-7家族成員在顆粒細胞的閉鎖及細胞凋亡過程中發揮著重要作用，所以let-7b在這個過程中也發揮著重要的功能。眾所周知，miRNA是一種起調控作用的內源性基因，參與了多種調控過程。先前的研究發現，miRNA主要是通過序列中的種子序列與靶基因的3′UTR堿基互補配對，從而發揮調控功能。

羅文[17]通過篩選參與調控雞成肌細胞增殖和分化的候選miRNAs，發現let-7b和miR-128的表達以及MAPK通路活性在不同類型骨骼肌中存在顯著差異。趙博文[18]基于公開的魚類小RNA組信息，系統分析了魚類let-7的系統進化，并以團頭魴（Megalobrama amblycephala）為研究對象，探討了let-7對魚類生長和性腺發育的表達調控作用，結果發現let-7a/b在團頭魴不同發育時期卵巢、腦和垂體中表達量最高，let-7a/b在團頭魴性腺發育過程中可能扮演著重要角色。路璐等[19]對鵝不同生殖周期內的let-7表達變化以及基因序列進行了分析，結果發現let-7g與let-7h在就巢期的表達量顯著高于其他時期，說明let-7在鵝生殖周期內有著一定的調節作用。王建蒙等[20]以內蒙古絨山羊皮膚為試驗材料，探索了褪黑激素（MT）對let-7家族成員及其靶基因周期性表達的影響，發現褪黑激素可通過影響let-7家族重要成員的表達水平，進而在皮膚毛囊的周期性生長過程中發揮重要作用。在本研究中，對雞胸肌、腿肌、心和肝等組織的let-7b表達變化進行了檢測，結果發現let-7b在雞大腦、心、胸肌和腿肌中的相對表達量高于其他組織。對3日齡和90日齡的母雞組織器官中let-7b的相對表達量進行檢測，發現與3日齡的雛雞相比，90日齡母雞的大腦、心、胸肌和腿肌中let-7b相對表達量都顯著上升，肝、卵巢和腎臟中let-7b的相對表達量差異不顯著。這表明，在雞生長發育的早期，新陳代謝活動旺盛，抑制因素較少;但是到了生長發育的中期，個體已經到達成熟期，有多個因素制約生長發育活動，此時let-7b表現為高表達。

目前，已經發現let-7b存在于不同的物種之中，有多個靶基因，如GHR[21]、IGF2BP3[22]、EDA[23]、TGFβR I[24]、Penk1[25]、MAP3K1[26]、和FGF5[27]等。這表明，let-7b可能具有多個靶基因，其作用的發揮可能是通過作用多個靶基因，從而從多個通路來調控細胞增殖、凋亡的過程。

生物信息學分析發現，在46種常見的脊椎動物中共發現46條let-7b序列，也就是說幾乎所有物種都只有1條成熟序列;對let-7b進行基因定位分析，發現雞let-7b位于1號染色體上的PPARA與WNT7B基因間隔區。結構決定功能，這說明let-7b的功能正常發揮，可能與PPARA與WNT7B基因關聯密切。常見物種let-7b成熟序列多序列比對分析結果表明，不同物種let-7b的序列較為保守，這表明let-7b可能發揮著重要的生理功能。進化樹分析結果表明，雞let-7b與斑胸草雀等其他鳥類聚為一類，這表明let-7b在鳥類進化過程中是保守的。let-7b靶基因預測和功能分析發現共有263個靶基因。GO功能富集分析結果表明，靶基因主要富集到DNA模板的轉錄調控、細胞對氨基酸刺激的反應、泛素依賴性蛋白質分解代謝過程、蛋白質泛素化、細胞遷移的正調控、miRNA介導的翻譯抑制、蛋白激酶B信號的正調控、基因表達調控和細胞對TGF-β刺激的反應等生物學過程，細胞質mRNA加工體、IV型膠原三聚體和SCF泛素連接酶復合物等細胞組分，金屬離子結合、轉錄因子活性（序列特異性DNA結合）、受體信號蛋白絲氨酸/蘇氨酸激酶活性、miRNA結合和mRNA 3′-UTR結合等分子功能。KEGG pathway分析結果表明，靶基因主要富集到焦點粘連、細胞外基質受體的相互作用、MAPK信號通路、卵母細胞減數分裂、TGF-β信號通路和孕酮介導的卵母細胞成熟等通路。這些通路均與細胞增殖分化密切相關。本研究首次研究了let-7b在雞不同生長階段和不同組織中的表達規律，并對其進行了生物信息學分析，預測了其在雞肌肉生長過程中的功能，但是let-7b的作用機制及其靶基因的靶向關系驗證尚待進一步的試驗研究。

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（責任編輯：陳海霞）

收稿日期：2021-07-26

基金項目：現代農業產業技術體系建設專項（CARS-41-Z05）;江蘇省農業科技自主創新基金項目[CX（20）2012];江蘇省科技成果轉化項目（BA2019049）

作者簡介：黃正洋（1987-），男，河南信陽人，博士，助理研究員，主要從事家禽遺傳育種研究。（E-mail）zyhuang@qq.com

通訊作者：趙振華，（E-mail）zzh0514@163.com