基于代謝組學(xué)技術(shù)探討水合氯醛致大鼠血生化變化的機制研究*

胡艷輝 陳敏健 周 昆 秦 珩 環(huán) 飛 章 婉 張靜姝 王玉邦

1 南京醫(yī)科大學(xué)附屬逸夫醫(yī)院，江蘇省南京市 211100； 2 南京醫(yī)科大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院衛(wèi)生毒理學(xué)系；3 南京醫(yī)科大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院全球健康中心； 4 南京醫(yī)科大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院流行病學(xué)系； 5 江蘇省醫(yī)藥農(nóng)藥獸藥安全性評價中心

水合三氯乙醛(水合氯醛)是乙醇氯化合成的一種化學(xué)物，它主要作為一種麻醉藥、催眠藥和抗驚厥藥用于動物實驗研究和臨床用藥中。雖然此種藥物并未得到美國FDA和歐盟的認(rèn)證，且存在一定的臨床風(fēng)險，但是依然具有一定的市場。 其使用范圍主要包括：實驗動物(大鼠、小鼠等)、成人、兒童等，由此可見水合氯醛的使用范圍相當(dāng)廣泛。水合氯醛作為常規(guī)麻醉藥在動物實驗中經(jīng)常被使用，會引起一些生化指標(biāo)的變化，這些生化指標(biāo)改變與其對人類健康以及對動物實驗學(xué)結(jié)果的科學(xué)性具有重要意義。而其背后的機制尚不清楚，局限了對水合氯醛不良效應(yīng)的評估、預(yù)防和治療措施的制定。

代謝組學(xué)是比基因組學(xué)、轉(zhuǎn)錄組學(xué)和蛋白組學(xué)更接近表型的一門新興組學(xué)。目前的研究數(shù)量雖然少于其他組學(xué)，但是它的發(fā)展很快。代謝組學(xué)主要對生物體內(nèi)的所有代謝物進行定量分析，研究的對象主要是相對分子質(zhì)量<1 000的小分子物質(zhì)。這些內(nèi)源性小分子代謝物主要涉及以下代謝途徑：能量代謝、糖代謝、脂代謝、氨基酸代謝、輔酶代謝、核酸代謝等。近年來，代謝組學(xué)已經(jīng)被用于從代謝組學(xué)角度探索化學(xué)物毒性和疾病發(fā)生，這也提示代謝組學(xué)研究適合用于水合氯醛潛在毒性效應(yīng)的研究。

肝臟為機體整體代謝的關(guān)鍵臟器；血液反映機體的整體循環(huán)代謝狀態(tài)；胰腺與生化的血糖指標(biāo)關(guān)系密切。本研究采用代謝組學(xué)的技術(shù)整合動物模型來探討水合氯醛麻醉藥使用對機體血生化的影響，并采用高度相關(guān)的代謝組學(xué)技術(shù)分析肝臟、血清胰腺探討分子機制，為其不良效應(yīng)的評估、預(yù)防和治療措施的制定提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 7周齡SD雄性大鼠27只，體重200～300g，由上海西普爾—必凱實驗動物有限公司提供。實驗動物生產(chǎn)許可證號:SCXK(滬)2013-0016，動物飼養(yǎng)于南京醫(yī)科大學(xué)衛(wèi)生分析檢測中心屏障系統(tǒng)[實驗動物使用許可證號：SYXK(蘇)2015-0009]，溫度20～26℃，濕度40%～70%。按照實驗動物使用的3R原則給予人道的關(guān)懷。

1.2 主要儀器與試劑 UPLC Ultimate 3000 system(Dionex)超高效液相色譜儀、Q-Exactive三重四極桿串聯(lián)質(zhì)譜儀、日立7100型全自動血生化儀器、TraceFinder 3.1軟件(Thermo Fisher Scientific)、電子天平(MettlerAE240型、T1000型)、KQ3200B型超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)、XW-80A漩渦混合器(上海青浦滬西儀器廠)、離心濃縮干燥儀(Labconco，USA)等。

水合氯醛(中國藥品生物制品檢定所，批號:100121-199903)、生理鹽水(安徽雙鶴藥業(yè)有限責(zé)任公司)、胰高血糖素試劑盒(北京北方生物技術(shù)研究所)、胰島素試劑盒(北京北方生物技術(shù)研究所)、甲醇、乙腈(≥99.9%，Merck，German)、甲酸(≥98.0%，Sigma-Aldrich，St.Louis，MO，USA)、超純水(PURELAB Ultra純水儀，英國ELGA公司)等。

1.3 方法 7周齡雄性SD大鼠 27 只，置于代謝籠飼養(yǎng)，適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后，隨機分為溶劑對照組、5%水合氯醛腹腔注射組、10%水合氯醛腹腔注射組，每組9只。溶劑對照組大鼠采用頸椎脫臼方式直接進行腹主動脈采血，5%水合氯醛腹腔注射麻醉10min后進行腹主動脈采血，10%水合氯醛腹腔注射麻醉5min后進行腹主動脈采血。采血前禁食16h。全自動血生化儀器檢測血清中谷草轉(zhuǎn)氨酶、谷丙轉(zhuǎn)氨酶、血糖、甘油三酯、總蛋白、白蛋白、尿素氮的變化。胰高血糖素和胰島素試劑盒檢測胰高血糖素和胰島素的水平。UPLC-QE代謝組分析平臺檢測血清、胰腺、肝臟代謝譜的變化。

1.4 代謝組學(xué)分析

1.4.1 血清前處理。取血清10μl，按甲醇相∶水相=3∶1沉淀蛋白，渦旋30s，冷凍離心機中4℃16 000g離心15min，將上清液轉(zhuǎn)移至1.5ml進口EP管，并將上清液在室溫條件下于離心濃縮干燥儀(Labconco，USA)中濃縮至干，復(fù)溶，待分析。

1.4.2 肝臟、胰腺組織前處理。取組織50mg加入750μl超純水進行稀釋，然后用解剖用剪刀剪碎進行超聲勻漿(功率=30%，每超聲3s間隔1s，EP管置于冰上)，取混合液150μl，按甲醇相∶水相=3∶1沉淀蛋白，冷凍離心機中4℃ 20 000g 離心15min，將上清液轉(zhuǎn)移至1.5ml進口EP管，并將上清液在室溫條件下于離心濃縮干燥儀(Labconco，USA)中濃縮至干，復(fù)溶，待分析。

1.4.3 超高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜分析。(1)色譜條件：采用 Hypersil GOLD C18色譜柱 (100mm×2.1mm，粒徑1.9μm Thermo Scientific，Germany)，流動相A乙腈(含0.1%甲酸)，流動相B超純水(含0.1%甲酸)，流速0.40ml/min。采用梯度洗脫的方式，柱溫：40℃，進樣量：5μl，流動相梯度變化為：0.00～3.00min范圍，流動相A為1.0%；3.00～10.00min范圍，流動相A為1.0%～99.0%；10.00～13.00min范圍，流動相A為99.0%～99.0%；13.00～13.10min范圍，流動相A為99.0%～1.0%；13.10～15.00min范圍，流動相A為1.0%。(2)質(zhì)譜條件：代謝物標(biāo)準(zhǔn)品庫建立和樣本實際檢測之前，分別采用正負(fù)離子校正液對質(zhì)譜儀質(zhì)量數(shù)進行24h內(nèi)定期校正。采用加熱電噴霧電離方式(HESI)，正負(fù)離子模式噴霧電壓分別為3.5kV和2.5kV，兩種模式下加熱器溫度為425℃，毛細(xì)管溫度為250℃，輔助氣氣流為13AU，鞘氣氣流為50AU，反吹氣氣流為0AU，透鏡電壓為60V。采用全掃模式進行掃描，掃描范圍：70～1 050m/z，分辨率為70 000。

1.5 物質(zhì)定性分析 采用TraceFinder 3.1軟件(Thermo Fisher Scientific)，對代謝物進行定性，以相對定量進行統(tǒng)計分析。

2 結(jié)果

2.1 5%、10%水合氯醛腹腔注射后血清生化指標(biāo)、胰高血糖素和胰島素的變化 如表1所示，與對照組比較，5%、10%水合氯醛腹腔注射后血糖水平呈現(xiàn)明顯上升；膽固醇、甘油三酯、總蛋白、白蛋白、谷草轉(zhuǎn)氨酶水平呈現(xiàn)不同程度的下降；尿素氮、谷丙轉(zhuǎn)氨酶和肌酐水平并未發(fā)生變化；胰高血糖素和胰島素水平也未發(fā)生變化。

表1 不同濃度水合氯醛腹腔注射后對SD大鼠血生化指標(biāo)、胰高血糖素和胰島素的影響

2.2 血清代謝譜變化 共檢測到123個血液代謝物，刪除檢出率<15%的化學(xué)物后，最終留下96個代謝物進行分析。對所有QC樣本分析后發(fā)現(xiàn)，所有化學(xué)物的RSD均<30%，說明分析具有較好的穩(wěn)定性和可靠性。這些化學(xué)物17個分布在氨基酸代謝，16個分布在脂質(zhì)代謝，12個分布在碳水化合物代謝，10個分布在核酸代謝，7個分布在維生素和輔酶代謝，1個分布在內(nèi)分泌代謝，3個分布在其他氨基酸代謝，2個分布在外來物質(zhì)的降解和代謝，2個分布在消化系統(tǒng)代謝，26個分布在其他代謝(圖1)。

圖1 血清樣本篩選的代謝物所在代謝通路分布圖

2.3 肝臟代謝譜變化 共檢測到183個肝臟代謝物，刪除檢出率<15%的化學(xué)物后，最終留下133個代謝差異物進行分析。對所有QC樣本分析后發(fā)現(xiàn)，所有化學(xué)物的RSD均<30%，說明分析具有較好的穩(wěn)定性和可靠性。這些化學(xué)物27個分布在氨基酸代謝，19個分布在脂質(zhì)代謝，15個分布在碳水化合物代謝，16個分布在核酸代謝，13個分布在維生素和輔酶代謝，1個分布在內(nèi)分泌代謝，4個分布在其他氨基酸代謝，2個分布在外來物質(zhì)的降解和代謝，2個分布在消化系統(tǒng)代謝，1個分布在運輸和代謝，33個分布在其他代謝(圖2)。

圖2 肝臟樣本篩選的代謝物所在代謝通路分布圖

2.4 胰腺代謝譜變化 共檢測到157個胰腺代謝物，刪除檢出率<15%的化學(xué)物后，最終留下129個代謝物進行分析。對所有QC樣本分析后發(fā)現(xiàn)，所有化學(xué)物的RSD均<30%，說明分析具有較好的穩(wěn)定性和可靠性。這些化學(xué)物27個分布在氨基酸代謝，18個分布在脂質(zhì)代謝，14個分布在碳水化合物代謝，16個分布在核酸代謝，9個分布在維生素和輔酶代謝，1個分布在內(nèi)分泌代謝，3個分布在其他氨基酸代謝，4個分布在外來物質(zhì)的降解和代謝，1個分布在運輸和代謝，2個分布在消化系統(tǒng)代謝，34個分布在其他代謝(圖3)。

圖3 胰腺樣本篩選的代謝物所在代謝通路分布圖

2.5 通過代謝組學(xué)方法檢測SD大鼠血清和胰腺兩種樣本結(jié)果 與對照組比較，10%水合氯醛腹腔注射后血清代謝差異物共篩選出42種，均呈現(xiàn)明顯下降趨勢；胰腺樣本代謝差異物共篩選出20種，均呈現(xiàn)明顯下降趨勢。因此，可以得出10%水合氯醛對SD大鼠腹腔注射后，會導(dǎo)致大鼠機體代謝發(fā)生紊亂(表2)，提示動物實驗中采用水合氯醛作為麻醉劑應(yīng)慎重考慮。

表2 血清和胰腺樣本篩選的代謝差異物

2.6 肝臟樣本篩選出1種代謝差異物 10%水合氯醛組與對照組比較，結(jié)果顯示2-羥基棕櫚酸上升2.48倍，具有統(tǒng)計學(xué)差異(P=0.035)。

2.7 血清、肝臟、胰腺多樣本的關(guān)鍵代謝物通路匯總圖 將上述差異代謝物用KEGG號注釋，然后基于KEGG通路繪制網(wǎng)絡(luò)圖(https://www.kegg.jp/)，見圖4。代謝網(wǎng)絡(luò)顯示共有3條代謝通路在水合氯醛作用下發(fā)生改變分別為：三羧酸循環(huán)代謝通路、脂質(zhì)代謝通路(含膽固醇代謝)、氨基酸代謝通路(含谷胱甘肽代謝)；在水合氯醛作用下代謝網(wǎng)絡(luò)通過三羧酸循環(huán)為核心，通過聯(lián)系上游糖酵解途徑以及相關(guān)的脂質(zhì)代謝、氨基酸代謝，影響血生化指標(biāo)。

圖4 關(guān)鍵代謝物形成的通路匯總圖(血清、肝臟、胰腺樣本結(jié)果匯總)

3 討論

水合氯醛作為一種麻醉藥，本研究發(fā)現(xiàn)腹腔注射后機體血生化指標(biāo)出現(xiàn)不同程度的異常，這與之前文獻報道是一致的[1-2]。然而，其影響機制尚無相關(guān)報道。

本研究的生化結(jié)果顯示水合氯醛導(dǎo)致的生化代謝改變體現(xiàn)在糖(血糖)、脂(膽固醇、甘油三酯)、蛋白質(zhì)(總蛋白、白蛋白、酶蛋白)相關(guān)指標(biāo)的紊亂，而代謝組學(xué)分析發(fā)現(xiàn)的代謝網(wǎng)絡(luò)以三羧酸循環(huán)為核心。值得注意的是，有研究指出三羧酸循環(huán)為聯(lián)系糖、脂、氨基酸(蛋白質(zhì))代謝的核心，這揭示了水合氯醛導(dǎo)致生化指標(biāo)紊亂的機制。

本研究的關(guān)鍵生化指標(biāo)改變?yōu)檠呛可仙?，這主要與血液中6-磷酸葡萄糖下降有關(guān)，提示水合氯醛導(dǎo)致葡萄糖無法有效轉(zhuǎn)化為6-磷酸葡萄糖，而導(dǎo)致血糖的堆積，并且干擾下游三羧酸循環(huán)代謝[3-5]。三羧酸循環(huán)通路中間代謝物能代謝成氨基酸，氨基酸是合成蛋白質(zhì)的前體，因此會導(dǎo)致血生化中總蛋白、白蛋白以及酶蛋白含量的變化[6]。三羧酸循環(huán)直接影響脂質(zhì)和膽固醇代謝通路，因此導(dǎo)致了血生化中甘油三酯和膽固醇含量下降。對這些代謝標(biāo)志物的檢測和干預(yù)有望實現(xiàn)對水合氯醛毒性的監(jiān)測和防治。

本研究首次從代謝組學(xué)角度闡明了水合氯醛腹腔注射后血生化指標(biāo)的變化機制，且形成了關(guān)鍵的代謝網(wǎng)絡(luò)，為今后水合氯醛在動物實驗和臨床用藥的安全性以及毒性的預(yù)防和治療提供了指導(dǎo)依據(jù)。