一例牛支原體肺炎的診斷報告

王金含 吳翠蘭 岑敏 馬宇毅 班雪花 李軍*

（1，廣西田東縣動物疫病預防控制中心 531500；2，廣西獸醫研究所/廣西獸醫生物技術重點實驗室 530001）

牛支原體最早于1961 年被確認為感染牛的病原體[1]。2008 年，我國首次從疑似肺炎牛的肺部分離出牛支原體[2]。支原體沒有細胞壁，取而代之的是具有不同表面脂蛋白的細胞膜。它們用于生物附著并引起宿主的各種免疫反應。生物體也可以在生物膜中產生并存活，正是這種加上宿主免疫反應的可變逃避，使生物體得以存活并引起疾病[3]。牛支原體能引起牛的肺炎、關節炎、乳腺炎等疾病，危害養牛業健康發展[4]。

2021 年4 月，廣西某牛場從外省引進一批牛，7～14d 后牛群發病，表現為咳嗽、流鼻涕、溫度升高到42℃等癥狀，養殖戶用抗生素和葡萄糖生理鹽水進行用藥治療，未見效果，隨后有2 頭牛出現死亡。對病死牛進行解剖，有肺部和胸部粘連、肺部有壞死灶等癥狀。經臨床診斷和實驗室檢測，確診該病例為牛支原體引起的，現將診斷結果報道如下。

1 實驗室診斷

1.1 細菌分離培養

無菌采取病死牛的肺臟血瓊脂平板，放置37℃培養12～48h 后觀察細菌生長情況。

1.2 支原體分離培養

采取肺臟組織研磨過濾，按照10%的接種量將濾液接種到PPLO 支原體培養基中，37℃培養4d，然后將其接種于支原體固體培養基中37℃培養4d，觀察菌落形態。

1.3 PCR 擴增

將采集病死牛的肺等器官進行研磨。用基因組RNA/DNA提取試劑盒進行提取病料的RNA/DNA，然后用特異性引物進行RT-PCR/PCR 檢測牛支原體、化膿隱秘桿菌、多殺巴氏桿菌、溶血曼氏桿菌、牛傳染性鼻氣管炎病毒、牛冠狀病毒、牛副流感病毒3 型、牛病毒性腹瀉病毒等8 種病原，電泳觀察結果。

1.4 藥敏試驗

選擇多西環素、氟苯尼考、林可霉素、阿莫西林、環丙沙星、替米考星、頭孢拉定、頭孢噻肟、恩諾沙星、氧氟沙星、加米霉素、馬波沙星等12 種藥物進行藥敏試驗。

2 結果

2.1 細菌分離鑒定

肺臟組織在血平板接種24～48h 后未見有菌落生長。

2.2 支原體分離培養

接種的PPLO 支原體培養由玫瑰色變為橘紅色。支原體固體培養基上生長針尖樣菌落，采用光學顯微鏡觀察，可見到“煎蛋樣”菌落，如附圖。

附圖 “煎蛋”樣菌落（4×）

2.3 PCR 擴增

經過采用RT-PCR/PCR 檢測牛支原體、化膿隱秘桿菌、多殺巴氏桿菌、溶血曼氏桿菌、牛傳染性鼻氣管炎病毒、牛冠狀病毒、牛副流感病毒3 型、牛病毒性腹瀉病毒等8 種病原，結果顯示，只有牛支原體引物擴增與之相符的條帶大小。

2.4 藥敏試驗

從藥敏試驗結果可知，該支原體對加米霉素、馬波沙星、恩諾沙星、氧氟沙星、環丙沙星敏感；對多西環素、氟苯尼考、林可霉素、阿莫西林、替米考星、頭孢拉定、頭孢噻肟耐藥。

3 小結與討論

（1）本次通過發病情況、解剖癥狀、細菌分離鑒定、支原體分離培養、PCR 擴增等方法確診該病例是由牛支原體感染引起的。

（2）以呼吸道癥狀發病的病因有很多，主要由病毒（如牛傳染性鼻氣管炎病毒、牛副流感病毒3 型、牛冠狀病毒、牛病毒性腹瀉病毒等）、細菌（如化膿隱秘桿菌、多殺巴氏桿菌、溶血曼氏桿菌等）、支原體、寄生蟲單獨或混合感染及交通運輸壓力、飼舍衛生等因素均可引起牛呼吸系統疾病[5,6]。本病例的發生主要有2 個方面的因素，一是該批牛是從外省引入，經過長途運輸，機體抵抗力有所下降，易引發疾病；二是廣西處于亞熱帶地區，受季風氣候的影響，廣西4 月天氣潮濕溫熱，更易引起牛呼吸道病。而本次試驗對多種病原進行相關檢測，只檢測出牛支原體，說明該病例是由牛支原體感染引起。

（3）牛支原體的實驗室診斷包括血清學、病原學和分子學。血清學常用于流行病學調查和初步診斷，而酶聯免疫吸附試驗（ELISA）是牛支原體流行病學調查中應用最廣泛的血清學方法之一。但不同試劑盒的特異性和準確性存在一些差異。病原菌分離培養方法直觀、可靠、簡潔，是診斷該病最可靠的方法，由于支原體沒有細胞壁，對培養條件要求比較苛刻，一般很難培養，而且培養的周期較長，耗時耗力。通常采用PCR、LAMP、高通量芯片技術可以進行診斷，通過設計特異性引物，如uvrC 和OPPD/F 等，該方法能準確、快速地鑒定牛支原體與其他支原體[7]。本次診斷通過采用支原體分離培養技術和PCR 鑒別診斷技術，兩者均證實從該病例中檢測出牛支原體。

（4）近年來，隨著政府的大力支持，養殖規模不斷加大，隨之而來的動物發病概率也越來越大。由于動物發病在臨床上較為相似，很難鑒別，養殖者往往憑借發病癥狀盲目用藥，易導致細菌或支原體產生耐藥性。如高鐸對牛支原體分離株進行藥敏檢測，結果發現，牛支原體對大環內酯類藥敏耐藥[8]；劉超在比利時、德國和意大利3 個國家奶牛場的牛奶樣品中分離了73 份牛支原體樣本，并進行體外藥敏試驗，結果顯示，這3個國家分離的牛支原體對大環內酯類藥物耐藥性嚴重[9]。本研究對分離株進行藥敏試驗，結果顯示，牛支原體分離株對加米霉素、馬波沙星、恩諾沙星、氧氟沙星、環丙沙星敏感，因此，可以篩選這5 種藥物進行治療。通過藥敏試驗篩選藥物可提高藥物使用率，減少耐藥株的出現。由于引起牛支原體肺炎的因素較多，首先，加強牛群引進管理，剛引進時避免合群混養；其次，堅持自繁自養；第三，重視日常飼養管理工作，保持牛舍清潔、通風，保證飼料的營養均衡；第四，加強疾病預防工作，應堅持早發現、早診斷、早治療的原則。