一株細菌素產生菌的分離鑒定及其所產新型細菌素的結構特性研究

＊劉哲 王金澤 黃一剛 任婷 金文剛 裴金金

（陜西理工大學 生物科學與工程學院 陜西 723000）

食品行業非常需要能夠防止腐敗或致病細菌污染的試劑。然而，由于大多數消費者擔心常用食品防腐劑的安全性，人們對天然和安全的防腐劑替代品的需求很高[1]。細菌素是一種對人體具有低口服毒性的低分子量多肽[2]，這些化合物作為生物防腐劑在食品工業中顯示出良好的應用前景。根據Cotter，Hill，Ross[3]，細菌素分為兩大類：I類，以羊毛硫氨酸為基礎的細菌素；II類，非羊毛硫氨酸細菌素。II類細菌素分為4個亞類：IIa類、IIb類、IIc類和IId類[7]。雖然已經發現了大量細菌素，但除了少數I類和IIa類細菌素的作用機制外，它們發揮抗菌作用的相應機制尚不清楚。

康普茶作為中國南方的一種功能性飲料已有數千年的傳統，最近，它因其多種功能特性而受到歡迎。從康普茶中分離到的乳桿菌主要有球狀乳桿菌、嗜熱鏈球菌和植物乳桿菌，大多數研究都集中在康普茶的真菌區系上。在過去的幾年里，研究人員將重點放在從康普茶中分離出的功能性乳酸菌。在這項研究中，從中國漢中市的傳統康普茶中分離的植物乳桿菌#SLG10的無細胞上清液（CFS）中篩選并純化了一種名為植物乳桿菌#SLG10的新型細菌素。隨著證明該肽的分離，我們還闡明了其抗菌作用機制。

1.材料和方法

(1)產細菌素乳酸菌的篩選及鑒定

①乳酸菌的分離

康普茶購自陜西省漢中市。將1g康普茶發酵劑壓碎并浸入10mL無菌蒸餾水中。瓊脂培養基上進行培養（MRS，Solarbio，北京，中國），37℃下培養48h。根據Liu等人[4]的方法獲得無細胞上清液（CFS）。使用瓊脂孔擴散法定量CFS對金黃色葡萄球菌CICC10384和大腸桿菌CICC10302指示菌株的抗菌活性。如果在瓊脂孔周圍沒有觀察到抑制區，則將抑制記錄為陰性。用抑菌活性（Log）和抑菌圈直徑構建標準曲線。抗微生物活性表示為每毫升任意單位（AU），一個AU定義為顯示明顯生長抑制區的最高稀釋度的倒數。

②細菌素產生菌菌株鑒定

用7F和1540R引物進行16SrRNA基因序列分析，鑒定菌株的基因型（5′-CAGAGTTTGATCCTGGCT,3′-AGGAGG TGATCCAGCCGCA）[6]。用Ezup柱狀細菌基因組DNA純化試劑盒提取植物乳桿菌#SLG10的DNA。PCR產物用SanPrep柱DNA凝膠提取試劑盒純化。通過與NCBI數據庫進行比較來執行序列的相似性搜索。

(2)細菌素的純化

①生物色譜制備

根據Tang等人使用的方法的稍微修改版本進行生物色譜設置。用20%（v/v）鹽酸活化二氧化硅8h，然后用去離子水洗滌至中性，在120℃下干燥。2g蛋黃磷脂酰膽堿（EYPC）和1g 1,2-二肉豆蔻酰基-sn-gly-蠟油磷脂酰甘油（鈉鹽）（DMPG）（2:1，w/w）溶于CHCl3/CH3OH（2:1，v/v），與20g 活性二氧化硅混合，并在恒溫（4℃）條件下混合120min，通過旋轉蒸發儀除去溶劑，用N2吹掃干燥的殘余物并真空干燥過夜。脂質膜包被的多孔硅膠在磷酸鹽緩沖鹽水（PBS）中浸泡12h，在4℃下5000×g離心20min，然后用10mM、pH7.2的PBS緩沖液沖洗3次，作為250×4.6mm玻璃柱的填充物。

②細菌素的篩選純化

色譜柱用PBS（10mm，pH7.2，50mM NaCl）洗脫，植物乳桿菌#SLG10的CFS在25℃下以PBS為流動相（0.5mL/min流速）洗脫，洗脫用分光光度法在215nm處監測重復20次。蛋白質含量用Bradford法測定。收集餾分并冷凍干燥，并篩選抗金黃色葡萄球菌CICC10384的抗菌活性，然后使用梯度洗脫對最有效的部分進行反相高效液相色譜（RP-HPLC）（Symmetry C18柱，250×4.6mm，5μm，Waters，Dublin，Ireland）。將B相（100%乙腈）與A相（0.05%（v/v）三氟乙酸（TFA））混合40min，使B相（100%乙腈）的含量從5%增加到100%，從而改變流動相的含量，A相的進樣體積為1mL，流速為0.5mL/min，溫度保持在恒定水平（25℃）。

(3)細菌素結構表征

分離的植物乳桿菌#SLG10的一級結構通過N-氨基酸分析儀確定，然后在NCBI數據庫中進行同源性搜索。

(4)抗菌活性

細菌素對敏感細菌的最低抑菌濃度（MIC）根據臨床和實驗室標準研究所（CLSI）的程序[6]進行測定。

CICC：中國工業菌種收藏中心；

MIC：能抑制指示菌株生長的細菌素的最低濃度；

MBC：殺滅99.9%(下降三個數量級）的受試微生物所需的最低細菌素濃度。

2.結果與討論

(1)細菌素產生菌的分離鑒定

從康普茶中分離出的7株菌株是潛在的LAB活性菌株。其中，菌株SLG10是唯一能夠同時作用于革蘭氏陽性菌和革蘭氏陰性菌（金黃色葡萄球菌CICC10384和大腸桿菌CICC10302）的菌株。在排除了菌株SLG10抑菌效果與有機酸含量有關的可能性后，選擇菌株SLG10作為細菌素產生菌。基于菌株 SLG10 16S rDNA序列的系統發育樹推測菌株SLG10為植物乳桿菌。因此，我們將菌株SLG10命名為植物乳桿菌#SLG10。

過去幾年，研究人員對康普茶的真菌成分非常關注。同時，康普茶也可以被認為是功能性乳酸菌的潛在豐富來源。如今，植物乳桿菌、益生菌菌株普遍被認為是安全的[8]。植物乳桿菌#SLG10作為一種植物乳桿菌，不僅可以用作產生細菌素的菌株，而且還具有作為發酵食品發酵劑的潛力。

(2)細菌素的純化

生物色譜洗脫如圖1A所示，僅獲得一種洗脫液，抗菌活性試驗表明該洗脫液為細菌素部分，結果表明生物色譜法對細菌素的鑒定具有良好的特異性。合并洗脫液并使用反相高效液相色譜法進一步分離，主峰如圖1B所示，保留時間為21.3min。

圖1 細菌素SLG10的純化

在本研究中，生物色譜法能夠從植物乳桿菌#SLG10的無細胞上清液（CFS）中快速篩選和分離細菌素。

(3)植物乳桿菌#SLG10的結構特性

質譜分析顯示，一個與質量為1422Da的物種有關的特征峰。該化合物的一級結構為十肽，序列為ASN-IleVal-Trp-Gln-Leu-Ile-Gly-Leu-Pro-Ala-Gln-Ala（NIVWQLIGLPAQA）。BLAST分析表明，該序列與NCBI數據庫中已知的細菌素序列不同，因此分離出的多肽是一種新的細菌素，命名為植物乳桿菌#SLG10。植物乳桿菌#SLG10屬于Ⅱ類細菌素，因為它不含羊毛硫氨酸或YGNGVXC。

CD譜表明植物乳桿菌#SLG10呈現不規則的螺旋結構，預測的植物乳桿菌#SLG10的三個結構分區表明它呈現不規則的線性形成。植物乳桿菌#SLG10的理論質量是1422.26Da，這與MS測試的結果一致。

在結構上，植物乳桿菌#SLG10類似于其他具有無規卷曲但具有明確構象的小而疏水的細菌素，這些結構特征可能會增加細菌素在復雜環境中的穩定性。

(4)植物乳桿菌#SLG10的穩定性

在本研究中，植物乳桿菌#SLG10在加熱處理后仍保持其抗菌活性，在37℃儲存14天，甚至在4℃儲存2個月后仍保持其抑制活性（圖2B）。植物乳桿菌#SLG10在pH2.0-7.0范圍內穩定，但在pH8.0及以上時活性下降（圖2C）。這些結果表明植物乳桿菌#SLG10在食品加工過程中將保持顯著的穩定性。有趣的是，植物乳桿菌#SLG10對胰蛋白酶和胃蛋白酶不敏感（圖2A），缺乏敏感性可能歸因于肽的小尺寸。

圖2 酶、溫度和pH對細菌素SLG10的影響

A：T1-脂肪酶；T2-a-淀粉酶；T3-蛋白酶K；T4-木瓜蛋白酶；T5-a-胰凝乳蛋白酶；T6-胰蛋白酶；T7-胃蛋白酶；T8-過氧化氫酶；B：T1-60℃；T2-80℃；T3-100℃；T4-37℃持續14天；T5-4℃持續兩個月；C：T1-pH2；T2-pH3；T3-pH4；T4-pH5；T5-pH6；T6-pH7；T7-pH8；T8-pH9；T9-pH10。三個重復相同，因此沒有標準偏差。

(5)抗菌活性

植物乳桿菌#SLG10的抗菌活性如表1所示，植物乳桿菌#SLG10對革蘭氏陽性菌和革蘭氏陰性菌均有抑制作用，重要的是，植物乳桿菌#SLG10對耐甲氧西林金黃色葡萄球菌也有活性。這種活性可能是因為細菌素的作用方式與抗生素不同。值得注意的是，植物乳桿菌#SLG10也對革蘭氏陰性菌大腸桿菌有活性，根據敏感細菌的不同，植物乳桿菌#SLG10的MIC值為16～32μg/mL（表1）。

表1 細菌素SLG10的抗菌活性

3.結論

綜上所述，SLG10菌株經鑒定為植物乳桿菌（Lactobacillus Plantarum），是從我國南方傳統的康普茶中分離到的。采用生物層析和反相高效液相色譜（RP-HPLC）聯用的方法，從SLG10菌株的CFS中分離純化植物乳桿菌#SLG10。這種新的Ⅱ類細菌素對G+和G-細菌均有抗菌活性。本文發現的新型細菌素是一種很有前途的抗菌劑，在食品保鮮或制藥工業中具有潛在的應用前景。