前列腺癌組織中LncRNA LINC00355、miR-494-3p、CCND2 的表達及臨床意義

解丹丹 夏 磊 李松果 潘獻柱

1.安徽省第二人民醫院病理科，安徽合肥 230041；2.安徽省第二人民醫院泌尿外科，安徽合肥 230041

前列腺癌是一種嚴重危害男性生命的惡性腫瘤，在我國的發病率也逐年上升[1-2]，不同于歐美前列腺癌人群，我國中晚期前列腺癌患者比例更高[3]。非編碼RNAs 是一類不編碼蛋白質的RNA，包括長鏈非編碼RNA（long non-coding RNA，LncRNA）、微小RNA（microRNA，miRNA）等，參與癌變進展[4-5]。LncRNA LINC 00355 是新近發現的一種LncRNA，在胃癌、膀胱癌等惡性腫瘤中呈高表達，發揮促癌基因作用[6-7]。生物信息工具預測發現，miR-494-3p 可能為LncRNA LINC00355 的靶基因，細胞周期素D2（cyclin D2，CCND2）可能為miR-494-3p 的靶基因。CCND2 是一種細胞周期調控蛋白，高表達可使細胞異常增殖，與癌癥發生發展密切相關[8]。本研究旨在分析前列腺癌組織中LncRNA LINC00355、miR-494-3p、CCND2 mRNA表達及臨床意義，以期為研究前列腺癌相關分子機制提供參考。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取安徽省第二人民醫院2015 年1 月至2017 年12 月收治的91 例前列腺癌患者，年齡42～83 歲，平均（62.15±7.54）歲；病理類型：腺癌72 例，導管腺癌7 例，導管內癌5 例，基底細胞癌4 例，其他類型3 例；腫瘤直徑：≥5 cm 37 例，＜5 cm 54 例；前列腺特異性抗原：≥10 μg/L 64 例，＜10 μg/L 27 例；分化程度：低未分化46 例，中高分化45 例；TNM 分期[9]：Ⅰ期20 例，Ⅱ期35 例，Ⅲ期21 例，Ⅳ期15 例；轉移：淋巴結轉移23 例，骨轉移15 例，內臟轉移7 例；Gleason評分1～7 分，平均（3.82±0.75）分。納入標準：①病理確診為前列腺癌；②首次確診，未接受過放化療等免疫靶向治療；③臨床病理資料及隨訪資料完整；④漢族；⑤患者及家屬均知情研究。排除標準：①合并其他部位的惡性腫瘤；②合并嚴重心、肝、腎等臟器疾病；③合并全身感染性疾病；④并發血液系統疾病。本研究經醫院倫理委員會批準。

1.2 研究方法

手術切除前列腺癌組織及距癌組織≥5 cm 癌旁正常組織，常規石蠟切片，刮出切片部分組織放至EP管，Trizol 總RNA 抽提試劑盒（北京艾德萊生物科技有限公司，貨號：RN0401）提取組織中總RNA，紫外分光光度計和瓊脂糖凝膠電泳檢測RNA 濃度、純度、完整性，TaKaRa 逆轉錄試劑盒（上海易匯生物科技有限公司，貨號：206143）合成cDNA，進行qRT-PCR 反應。反應體系（25 μl）：12.5 μl SYBR Premix Ex TaqⅡ、1 μl 正向引物、1 μl 反向引物、2 μl DNA 模板、8.5 μl dH2O；反應條件：95℃2 min、95℃30 s、60℃30 s，72℃30 s，循環40 次，2-ΔΔCt法計算組織中LncRNA LINC00355（內參GAPDH）、miR-494-3p（內參U6）、CCND2 mRNA（內參β-actin）相對表達量。引物和內參序列見表1。

表1 qRT-PCR 引物序列

1.3 隨訪

患者出院后通過門診復查或電話跟蹤對其進行為期3 年的隨訪，以均值進行分組，比較不同LncRNA LINC00355、miR-494-3p、CCND2 mRNA 表達患者生存狀況，隨訪至2020 年12 月。

1.4 統計學方法

采用SPSS 26.0 軟件進行數據分析，符合正態分布的計量資料用均數±標準差（）表示，兩組間比較采用t 檢驗；計數資料用例數或百分率表示，組間比較采用χ2檢驗；相關性采用Pearson 相關性分析，Kaplan-Meier 法繪制生存曲線，組間生存率log-rank檢驗。以P ＜0.05 為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 前列腺癌組織和癌旁正常組織中LncRNA LINC 00355、miR-494-3p、CCND2 mRNA 表達比較

前列腺癌組織中LncRNA LINC00355、CCND2 mRNA 表達高于癌旁組織，miR-494-3p 表達低于癌旁組織（P ＜0.05）。見表2、圖1。

圖1 電泳條帶

表2 前列腺癌組織和癌旁正常組織中LncRNA LINC00355、miR-494-3p、CCND2 mRNA 表達比較（）

表2 前列腺癌組織和癌旁正常組織中LncRNA LINC00355、miR-494-3p、CCND2 mRNA 表達比較（）

注 LncRNA：長鏈非編碼RNA；miRNA：微小RNA；CCND2：細胞周期素D2

2.2 前列腺癌組織中LncRNA LINC00355、miR-494-3p、CCND2 mRNA 的相關性

前列腺癌組織中LncRNA LINC00355 與miR-494-3p 表達呈負相關，與CCND2 mRNA 表達呈正相關（r=-0.502、0.458，P ＜0.001）；miR-494-3p 與CCND2 mRNA 表達呈負相關（r=-0.493，P ＜0.001）。

2.3 前列腺癌患者LncRNA LINC00355、miR-494-3p、CCND2 mRNA 表達與預后的關系

隨訪3～36 個月，中位22 個月，死亡33 例，術后3 年總生存率為63.74%（58/91），LncRNA LINC00355高表達（≥2.552）患者與低表達（＜2.552）患者術后3 年總生存率分別為52.38%（22/42）、73.47%（36/49）；miR-494-3p 高表達（≥0.272）患者與低表達（＜0.272）患者術后3 年總生存率分別為76.09%（35/46）、51.11%（23/45）；CCND2 mRNA 高表達（≥2.196）患者與低表達（＜2.196）患者術后3 年總生存率分別為47.50%（19/40）、76.47%（39/51）。Kaplan-Meier 曲線顯示，LncRNA LINC00355 高表達、miR-494-3p 低表達、CCND2 mRNA 高表達患者術后3 年總生存率低于LncRNA LINC00355 低表達、miR-494-3p 高表達、CCND2 mRNA低表達患者（log-rank χ2=7.516、6.097、10.016，P=0.006、0.014、0.002）。見圖2。

圖2 不同LncRNA LINC00355、miR-494-3p、CCND2 mRNA 表達前列腺癌患者術后3 年的生存曲線

3 討論

LncRNA 是一類轉錄本＞200 個核苷酸的非編碼RNA，參與調控染色質修飾、運輸、轉錄與抑制、基因組印記等過程，與細胞生長、分化、增殖等過程密切相關[10-11]。LncRNA LINC00355 是近年新發現的一種LncRNA，有研究指出，其能通過靶向調控miRNA 影響下游靶基因的表達，以參與肝癌、結腸癌等腫瘤的癌變進展[12-14]。本研究結果顯示，前列腺癌組織中LncRNA LINC00355 表達明顯高于癌旁正常組織，提示LncRNA LINC00355 在前列腺癌中發揮促癌基因作用。進一步分析顯示，LncRNA LINC00355 高表達患者術后3 年總生存率明顯降低，提示LncRNA LINC00355表達上調可能是前列腺癌患者預后不良的生物標志物。Jiang 等[15]利用癌癥基因組圖譜數據庫發現，LncRNA LINC00355 為前列腺癌差異表達LncRNA，并與患者生存率相關。張建育等[16]通過小干擾RNA 下調前列腺癌細胞（DU145）LncRNA LINC00355 發現，DU145 細胞增殖、侵襲、遷移能力明顯降低。再次證實LncRNA LINC00355 參與了前列腺癌的發生發展。

miRNA 在多種腫瘤中均有表達，轉錄后可以參與腫瘤病理生理過程[17-18]。Zhu 等[19]研究報道，miR-494-3p 能通過調節磷酸酶與張力蛋白同源物/磷脂酰肌醇3-激酶/蛋白激酶B 通路促進子宮內膜癌細胞增殖、遷移、入侵。Chen 等[20]研究報道，miR-494-3p 能通過抑制Bmi1 蛋白表達，抑制乳腺癌細胞增殖能力。提示miR-494-3p 在不同腫瘤中表達及功能均有差異。本研究結果顯示，前列腺癌組織中miR-494-3p表達低于癌旁正常組織，miR-494-3p 高表達患者術后3 年總生存率明顯升高，提示miR-494-3p 在前列腺癌中發揮抑癌基因作用，miR-494-3p 表達下調可能是前列腺癌患者預后不良的生物標志物。其機制可能與miR-494-3p 能靶向CXC 趨化因子受體4 抑制前列腺癌細胞惡性行為有關。CXC 趨化因子受體4 是一種趨化因子受體，研究表明，癌細胞上大量表達CXC 趨化因子受體4 時，能促進癌細胞遷移和轉移[20-21]。Shen 等[22]通過生物信息學預測發現，CXC 趨化因子受體4 為miR-494-3p 的靶基因，上調miR-494-3p 表達能靶向下調CXC 趨化因子受體4 抑制前列腺癌細胞增殖、遷移、侵襲和促進凋亡。

CCND2 作為一種細胞周期調控蛋白，其異常表達促進癌細胞異常增殖、遷移、侵襲的作用已被證實[8,23]，本研究亦證實前列腺癌組織中CCND2 高表達，同時CCND2 高表達患者術后3 年總生存率明顯降低。lncRNA可作為內源競爭RNA 競爭占有胞內miRNA，像海綿樣緩沖削減并干涉靶基因mRNA 編碼蛋白的能力[24]。研究表明，miR-34、miR-21、miR-155、miR-221 等能靶向調節CCND2 參與前列腺癌發生發展[25]。本研究結果顯示，前列腺癌組織中LncRNA LINC00355、miR-494-3p、CCND2 mRNA 指標間均有一定的關系，提示三者可能共同參與前列腺癌進展。上調前列腺癌細胞LncRNA LINC00355 表達能抑制miR-494-3p 表達，上調CCND2 表達，促進前列腺癌細胞增殖、遷移、侵襲。雙熒光素酶報告實驗證實LncRNA LINC00355 與miR-494-3p 存在靶向關系，miR-494-3p 與CCND2存在靶向關系[16]。提示LncRNA LINC00355 可能通過競爭內源RNA 抑制miR-494-3p 表達，從而上調CCND2 表達，參與前列腺癌的發展。

綜上所述，前列腺癌組織中LncRNA INC00355、CCND2 mRNA 表達上調，miR-494-3p 表達下調，LncRNA LINC00355 可能通過抑制miR-494-3p 上調CCND2 mRNA 表達，促進前列腺癌的進展。