植物次生代謝物質對草地貪夜蛾解毒酶活性及相關基因表達的影響

王柄權 程凌寒 方宇 李維薇 劉佳妮

摘要：為探究草地貪夜蛾對毒害物質的反防御策略。以添加0.5%煙堿、0.05%黃酮、0.5%棉酚、0.01%水楊酸、0.1%香豆素5種植物次生代謝物質的人工飼料進行飼養草地貪夜蛾5齡幼蟲，48 h后分別測定草地貪夜蛾中腸和脂肪體的谷胱甘肽-S-轉移酶等4種酶的活性，同時采用半定量RT-PCR方法檢測CYP4L13、CYP4M14基因在中腸和脂肪體中的表達水平。其中取食煙堿、黃酮、棉酚、香豆素和水楊酸均能誘導中腸GSTs活性增強，棉酚、香豆素和水楊酸在脂肪體中可顯著誘導GSTs的活性增強6倍以上。取食棉酚可誘導草地貪夜蛾中腸CarE活性增強1.57倍，而取食煙堿可誘導脂肪體CarE的活性顯著增加。與對照相比，取食煙堿、黃酮、棉酚、香豆素后，草地貪夜蛾頭部AchE活性分別提高1.34、0.50、0.82、0.68倍。草地貪夜蛾中腸和脂肪體中CYPM14、CYPL13可被不同植物次生代謝物質誘導表達增強，同時增加P450含量。與對照相比，取食黃酮、棉酚、水楊酸后，其中腸P450的含量分別增加3.14、2.43、3.93倍。草地貪夜蛾的解毒能力可通過植物次生代謝物質誘導增強，從而提高其對有毒物質的抵抗力。

關鍵詞：植物次生代謝物;草地貪夜蛾;解毒酶;細胞色素P450

中圖分類號：S433.4 ??文獻標志碼： A

文章編號：1002-1302（2022）08-0011-04

對于絕大多數植食性昆蟲而言，植物次生代謝物質對其生長、發育和繁殖產生重要影響，并在化學防御中發揮重要作用。現知的很多植物次生代謝物都對昆蟲具有防御作用[1]。植物次生代謝物質抗蟲效果不僅取決于它們對脆弱昆蟲系統的效力，還取決于昆蟲對這種挑戰的反應[2]。植物和昆蟲在長期的生物演化過程中，為戰勝寄主植物的毒害，植食性昆蟲發展了忌避取食、解毒代謝等多種適應次生代謝物質的途徑，其中解毒代謝中的相關解毒酶系扮演著重要的角色[3]。多種解毒酶的相互作用不僅能影響昆蟲取食，在一定程度上還能使昆蟲對殺蟲劑產生耐藥性和抗藥性的能力增強[4]。有研究表明，通過誘導可顯著增加解毒酶活性，但針對同種誘導，不同昆蟲所作出的應激響應存在顯著差異。細胞色素P450是一類亞鐵血紅素-硫醇鹽蛋白超家族，普遍存在于昆蟲體內，兼具氧化和單氧化相關功能，能參與部分昆蟲保幼激素、蛻皮激素以及植物次生代謝有毒物質的代謝過程，在內源性和外源性代謝中發揮重要作用[5]。大多數昆蟲對寄主植物的適應性主要由細胞色素P450家族基因的代謝解毒作用水平決定[6]。草地貪夜蛾[Spodoptera frugiperda（J.E. Smith）]屬鱗翅目（Lepidoptera）夜蛾科（Noctuidae）灰翅夜蛾屬（Spodoptera），原產于美洲熱帶和亞熱帶地區，是一種遷飛能力極強的世界性害蟲。2019年1月在我國云南省首次發現，至今已在25個省（市、區）造成危害，該蟲主要危害玉米、小麥、花生、高粱、棉花和蔬菜等作物[7]。目前，主要依靠化學方法控制草地貪夜蛾，但長期大量使用化學藥劑，不但害蟲會在短時間內產生抗藥性，而且造成環境污染。本試驗選擇煙堿、黃酮、棉酚、水楊酸和香豆素5種常見的植物次生代謝產物研究草地貪夜蛾的解毒酶活性和相關基因表達，探明草地貪夜蛾適應次生代謝物的生理生化機制，探索廣食性害蟲的耐藥機制。

1 材料與方法

1.1 供試材料

草地貪夜蛾幼蟲采集于2020年4月昆明學院安寧象石村實習基地農場，在實驗室室內飼養，溫度為（26 ±2） ℃，濕度為60%～80%，光—暗周期為 14 h—10 h。剛孵化的草地貪夜蛾幼蟲放入裝有人工飼料的飼養箱（30 cm×18 cm×5 cm）中[8]，每天添加新鮮飼料并觀察記錄[8]，清理糞便。挑選大小一致的5齡幼蟲分別用含有0.5%煙堿、0.05%黃酮、0.5%棉酚、0.01%水楊酸、0.1%香豆素的人工飼料進行飼養，對照為正常取食人工飼料的草地貪夜蛾。飼喂48 h后，分別提取貪夜蛾中腸和脂肪體，每個處理20頭蟲，重復3次，-80 ℃保存備用。

1.2 試驗方法

1.2.1 酶源提取 將5齡幼蟲置于冰上，沿背中線剖開蟲體，輕輕用鑷子取出中腸，加入預冷的 0.04 mol/L 的磷酸緩沖液中沖洗，并置于離心管中，5頭幼蟲合并1個檢測樣，-80 ℃保存備用，重復3次。加入1 000 μL 0.1 mol/L緩沖液（pH值7.6）勻漿，全部溶液合并后于4 ℃下10 000 g離心 20 min，保留上清液待測。

1.2.2 各種酶活性測定 酶活性的測定采用以下方法：谷胱甘肽-S-轉移酶（GST）活力測定參照文獻[9]的方法;羧酸酯酶（CarE）活力測定參照文獻[10]的方法;乙酰膽堿酯酶的活力參考Ellman的方法[11]進行改良測定;細胞色素P450含量的測定參照文獻[12]的方法。

1.2.3 引物設計 PCR擴增引物根據GenBank中草地貪夜蛾的CYP4L13（FP340412.1）和CYP4M14（FP340419.1）序列設計[13]，以EF-1a（Elongation factor-1a）（U20129）為內標基因，引物分別為：CYP4L13 F（5′-ACGAACGTGAGTCTGCCTATGTGA-3′）、CYP4L13 R（5′-ACGSCGTCCGGACCAAAAATC-3′）、CYP4M14 F（5′-TGATCYCGGACTTGCACTTG-3′）、CYP4M14 R（5′-GTCCAGCGCTGAAAGGAATA-3′）、EF-1a F（5 ′-GACAAACGTACCATCGAGAAG-3′）。

1.2.4 總RNA提取 采用TRIzol Reagent（Invitrogen，USA）的方法進行總RNA的提取。將剛解剖的草地貪夜蛾中腸和脂肪體置于裝有預冷的磷酸緩沖液（pH值7.8）中充分研磨，利用Nanodrop ND-1000檢測總RNA濃度和純度。

1.2.5 半定量RT-PCR檢測 依據iScript cDNA Synthesis kit（Bio-Rad，USA）方法進行cDNA合成。半定量RT-PCR采用25 μL反應體系：10×Buffer 2.5 μL;cDNA模板1.0 μL;2.5 mmol dNTP 2.0 μL;ddH2O 18.3 μL;r Taq聚合酶0.2 μL;上下游引物各0.5 μL。反應條件為 94 ℃ 3 min;94 ℃ 30 s，60 ℃ 30 s，72 ℃ 45 s，35個循環。電泳后凝膠成像系統檢測目的基因表達量。

1.3 數據統計分析

采用SPSS 19.0進行試驗數據統計與分析。

2 結果與分析

2.1 植物次生代謝物質對草地貪夜蛾幼蟲乙酰膽堿酯酶活性的影響

研究發現，人工飼喂含有0.5%煙堿、0.05%黃酮、0.5%棉酚、0.1%香豆素的人工飼料48 h后，幼蟲頭部AChE活性較對照分別提高1.34、0.50、0.82、0.68倍（F=18.146，P<0.001）。而飼喂0.01%水楊酸人工飼料48 h后幼蟲頭部AChE活性有所降低。表明通過飼喂煙堿、黃酮、棉酚、香豆素能夠顯著誘導增強草地貪夜蛾頭部AChE活性（表1）。

2.2 植物次生代謝物質對草地貪夜蛾GSTs活性的影響

與對照相比，5齡幼蟲飼喂含有0.5%煙堿、0.05%黃酮、0.5%棉酚、0.1%香豆素、0.01%水楊酸的人工飼料48 h后，其中腸中的GSTs活性分別增加1.69、0.97、0.41、1.41、2.05倍（F=19.217，P<0.001）。而在脂肪體中，所有的植物次生物質都可顯著誘導增強GSTs的活性，其中棉酚、香豆素和水楊酸GSTs活性與對照相比顯著增強6倍以上（F=33.147，P<0.001）（表2）。表明人工飼喂煙堿、黃酮、棉酚、香豆素、水楊酸均能在一定程度上誘導增強草地貪夜蛾中腸和脂肪體中的GSTs活性。

2.3 植物次生代謝物質對草地貪夜蛾CarE活性的影響

草地貪夜蛾5齡幼蟲取食含有0.5%棉酚的人工飼料48 h后，其中腸中CarE活性顯著增加0.57倍（F=21.317，P<0.001），而飼喂0.1%香豆素、0.01%水楊酸的中腸CarE活性受到抑制，分別為對照的0.83、0.91倍，且與對照相比存在顯著差異。而在脂肪體中，0.01%水楊酸CarE活性受到抑制，為對照的0.68倍，其余次生代謝物質與對照相比有所增加，其中0.5%煙堿誘導CarE的活性顯著增加，其余無顯著差異（表3）。綜上所述，草地貪夜蛾取食植物次生物質后，其中腸和脂肪體中的CarE活性的變化存在一定差異，且中腸中CarE活性表現得更為敏感。

2.4 植物次生代謝物質對草地貪夜蛾細胞色素P450含量的影響

與對照相比，各處理中細胞色素P450含量變化存在一定差異，其中飼喂含有0.05%黃酮、0.5%棉酚、0.01%水楊酸人工飼料48 h后的中腸P450的含量分別增加3.14、2.43、3.93倍，且飼喂黃酮和水楊酸的增加效果更為顯著;而飼喂0.5%煙堿、0.1%香豆素對其含量無顯著影響。在脂肪體中，取食含有0.5%煙堿、0.05%黃酮、0.01%水楊酸人工飼料48 h后，其P450含量與對照相比分別增加0.56、1.69、2.25倍，且存在顯著差異;而飼喂0.5%棉酚、0.1%香豆素對P450含量無顯著影響（表4）。

2.5 植物次生代謝物質對草地貪夜蛾CYP4L13、CYP4M14表達的影響

草地貪夜蛾5齡幼蟲經飼喂含有不同植物次生代謝物質的人工飼料后，其體內2部位中的CYP4L13、CYP4M14均有所表達，且不同處理間誘導程度呈現一定差異。其中取食含有0.5%煙堿、0.05%黃酮、0.5%棉酚的人工飼料48 h后，中腸CYPL13的表達量和對照無明顯差異，沒有被誘導表達;取食含有0.01%水楊酸、0.1%香豆素的人工飼料其中腸CYPL13的表達量明顯減少。草地貪夜蛾幼蟲在取食含有0.05%黃酮、0.5%棉酚的人工飼料48 h后，其中腸CYPM14的表達量與對照相比均明顯增加，而取食含有0.5%煙堿、0.01%水楊酸、0.1%香豆素人工飼料48 h后的CYPM14均未被誘導。在脂肪體中，取食含有0.05%黃酮、0.5%棉酚的人工飼料48 h后CYPL13的表達量略有增加，而其余的無明顯表達;同時在各處理中CYPM14的表達量均呈現不同程度的增加，且CYPL13、CYPM14表達量在中腸與脂肪體2部位中存在一定差異（圖1）。

3 討論與結論

黃敏燕等通過向斜紋夜蛾5齡幼蟲飼喂不用濃度沒食子酸、蕓香苷等植物次生代謝物質的方法研究斜紋夜蛾的解毒機制，發現不同類型的植物次生代謝物質和解毒酶活性基因的表達共同影響了斜紋夜蛾的解毒代謝[14]。Zou等發現，不同寄主植物對斜紋夜蛾幼蟲的取食適應從高到低依次為甘藍、黃瓜、甘薯、花生和辣椒，其谷胱甘肽-S-轉移酶SlGSTE1可能與寄主植物的攝食適應有關[15]。10種宿主植物對草地貪夜蛾GSTs的誘導作用不同，歐洲防風誘導能力最強，棉花誘導能力最弱[16]。與此同時，植物次生代謝物質不同，作用于昆蟲體內解毒酶系的效果也有所差異，王瑞龍等研究發現，水楊酸、花椒毒素、香豆素能夠誘導增強斜紋夜蛾中腸和脂肪體中GSTs的活性[17]。本研究結果表明，0.5%煙堿、0.05%黃酮、0.5%棉酚、0.1%香豆素、0.01%水楊酸能夠有效增強中腸GSTs活性，其中棉酚、香豆素和水楊酸在脂肪體中可誘導GSTs活性顯著增強6倍以上。另外，0.5%棉酚可誘導草地貪夜蛾中腸CarE活性增加，而0.1%香豆素和0.01%水楊酸誘導后CarE活性受到抑制，而在脂肪體中0.5%煙堿誘導CarE的活性顯著增加。劉佳妮等通過對馬鈴薯塊莖蛾進行連續5代的含煙堿飼料飼喂，發現煙堿處理后其體內解毒酶CarE和GST的含量呈逐漸降低的趨勢，可能是馬鈴薯塊莖蛾為了適應煙堿而作出的響應[18]。

細胞色素P450是昆蟲體內的主要解毒酶系，對昆蟲的生長、發育以及抵御外界脅迫等方面發揮著重要作用[19]。目前已鑒定的細胞色素P450大多屬于CYP4等27個家族，其中CYP4家族主要參與生物合成與代謝、外源有毒物質代謝以及響應外部環境脅迫，同時也與適應寄主植物和耐藥性、抗藥性的形成密切相關[20]。張繼紅等通過向飼料中添加煙堿和棉酚的方法研究次生物質對棉鈴蟲生長以及體內酶系的影響時發現2個處理對其生長無明顯影響，但其中腸P450酶系的組成以及酶活性存在一定差異[21]。本研究發現，草地貪夜蛾僅在取食含有黃酮和棉酚人工飼料后，CYPM14在中腸的表達量增加，而取食含有煙堿、黃酮、棉酚、水楊酸和香豆素5種次生代謝物質后，脂肪體CYPM14表達量均有增加。草地貪夜蛾中腸CYPL13表達量的變化趨勢與CYPL14一致，僅在取食含有黃酮和棉酚人工飼料后，脂肪體中CYPL13的表達量略有增加，其余的無明顯表達。在中腸中，飼喂水楊酸和香豆素人工飼料后，CYPL13表達量減少。表明不同植物次生代謝物質能誘導草地貪夜蛾中腸和脂肪體中CYPM14和CYPL13的表達增強，同時增加P450含量。煙草天蛾（Manducasexta）的幼蟲可以通過增加體內P450含量來提高對次生代謝物質的解毒作用[22]。薛明等發現，甜菜夜蛾幼蟲取食轉Bt基因棉后，其體內AchE活性較取食普通棉花相比顯著增高[23]。本研究中草地貪夜蛾取食各植物次生物質后表現出其頭部AchE活性增強的結論與之一致。

植物次生代謝產物在昆蟲和植物的共同進化中起關鍵作用，植物次生代謝物的類型很多，闡明次生代謝物誘導和調控昆蟲解毒酶的機制，對于揭示植物與昆蟲之間的協同進化關系以及制定害蟲防治策略都具有重要意義。

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