艾比湖濕地黏細菌的分離鑒定及其抗菌活性

王月娥 牛艷慧 鐘鎮濤 胡文革 李楊

摘要：為了探究艾比湖濕地可培養黏細菌多樣性及該地區黏細菌菌株對病原微生物的拮抗作用。通過傳統的黏細菌分離方法對采自艾比湖濕地15份樣品中的黏細菌進行分離，結合形態學觀察、生理生化特征和16S rDNA序列分析，確定菌株的分類地位，并通過平板對峙法分析其抗菌活性。試驗結果表明，從采集的15份樣品中共分離純化出22株疑似菌株，經鑒定將其歸類為黏球菌屬，其中6株為橙色黏球菌（Myxococcus fulvus），14株為變綠黏球菌（M. virescens），2株只鑒定到屬（Myxococcus sp.）。抗菌活性分析顯示，22株黏細菌表現出不同的抗菌活性，其中14株可以抑制金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）的生長，14株黏細菌均可抑制沙門氏菌（Salmonella typhimurium）和大腸桿菌（Escherichia coli）的生長，15株對枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）的生長表現出抑制作用，17株可以抑制釀酒酵母菌（Saccharomyces cerevisiae）的生長，11株能夠抑制鏈格孢菌（Alternaria alternata）的生長。艾比湖濕地可培養黏細菌多樣性不高，且黏球菌屬為該地區可培養黏細菌的優勢種屬。初步篩選出的2株黏細菌菌株WCX_LG-5和TF_YJC-1，具有廣譜的抗菌活性，是一類極具開發潛力的微生物資源。

關鍵詞：艾比湖濕地;黏細菌;病原微生物;抗菌活性

中圖分類號：S182 ??文獻標志碼： A

文章編號：1002-1302（2022）08-0234-09

植物病害是影響國家糧食安全和作物生產力的主要因素之一，對作物的生長發育和產量有較大的影響，造成巨大的經濟損失[1]，其中70%～80%的病害由病原真菌所致[2-3]，其生物防治的研究具有很大的現實意義。研究表明，芽孢桿菌（Bacillus）、假單胞菌屬（Pseudomonas）、溶桿菌屬（Lysobacter）、木霉屬（Trichoderma）和腐霉屬（Pythium）等病菌產生的毒素、抗生素及蛋白質類物質等代謝產物能夠抑制植物病原菌的生長，其中枯草芽孢桿菌等已被開發為微生物菌劑，應用于農業生產中病害的控制[4-6]。然而，次級代謝產物的產生受到環境因素的影響，這使得拮抗菌株在田間的防治效果較差[7]。目前，大量研究表明在動物病害及蟲害的防治過程中，利用其天敵和捕食關系進行病害防治，可達到較好的防治效果[8-9]。然而，微生物中也存在大量的捕食者，如蛭弧菌屬（Bdellovibrio）、擬桿菌門（Bacteroidetes）、溶桿菌屬（Lysobacter）和黏細菌目（Myxococcales）等[10-12]。其中，黏細菌對病原微生物的捕食特性使其在植物病害防治方面具有較大的潛力，被視為新型的生防微生物類群[13]。

黏細菌是一類能夠滑行運動、具有復雜多細胞行為的革蘭氏陰性菌[14]，主要分布于中性或偏堿性土壤中[15]。然而，在海洋、沙漠、鹽堿地和濕地等特殊生境中也發現了大量的黏細菌資源[16-19]，在這些生境中黏細菌具有良好的穩定性和抗逆性[20]。目前，對于黏細菌生物活性產物及其在生物防治應用領域的研究日漸突出[21]。迄今為止，從黏細菌中分離獲得的活性代謝產物達到600多種[22]，這些產物種類多樣、結構新穎[23]，具有抗真菌、抗細菌和抗腫瘤等生物活性[24]。研究表明，黏細菌產生的活性產物對植物病原菌生長具有較強的抑制作用，且其在土壤中的定殖效果較好[25]。因此，黏細菌是一類極具開發潛力的生物防治因子[26]。然而，獲得大量的黏細菌種質資源是其被開發和利用的關鍵。

新疆艾比湖濕地地處阿拉山口大風通道處，位于準噶爾盆地西南邊緣（82°36′～83°50′E，44°30′～45°09′N），是我國溫帶干旱區內陸湖泊的典型代表[27]，總面積2 670.85 km2。艾比湖濕地內分布有沼澤、湖泊、沙漠和鹽漠等不同地理區域，區域內土壤鹽堿化嚴重（土壤電導率為1～12 mS/cm;pH值范圍為8.0～9.0）。鹽角草、檉柳、鹽節木、梭梭、花花柴、蘆葦和胡楊等植物是艾比湖濕地鹽堿環境中的建群植物，具有較強的耐鹽能力，對艾比湖濕地生態環境的恢復具有重要作用。目前，有關濕地鹽堿環境中耐鹽植物群落區黏細菌的分布、多樣性及其活性產物的研究較少。因此，對新疆艾比湖濕地鹽堿地中建群植物根際土壤中可培養黏細菌菌株的分離及其抗菌特性的研究很有必要。

基于傳統的黏細菌分離純化方法，以艾比湖濕地建群植物根際土壤作為主要研究對象，對該地區可培養黏細菌多樣性及其抗菌特性進行研究，這對認識艾比湖濕地可培養黏細菌的種屬分類，以及探究該地區黏細菌的代謝產物提供了科學基礎。

1 材料與方法

1.1 研究區概況

艾比湖濕地位于準噶爾盆地西南邊緣（82°36′～83°50′E，44°30′～45°09′N），地處新疆阿拉山口大風通道下，為典型的大陸性氣候，平均降水量為105.17 mm，蒸發量為1 315 mm。由于艾比湖濕地特殊的地理位置，形成了獨特的濕地生態環境，生長有多種不同鹽生、水生和旱生類植被群落，如鹽角草（Salicornia europaea）、蘆葦（Phragmites australis）和胡楊（Populus euphratica）等，濕地內土壤多為沙質土壤和黏質土壤，且土壤鹽堿化較為嚴重。

1.2 樣品采集與處理

于2018年7月至新疆艾比湖濕地國家自然保護區進行采樣。本試驗共采集新疆艾比湖濕地15份土壤樣品（14份植物根際土壤和1份朽木樣品）。采集土壤樣品時，去除土壤表面的雜質和表層土后進行取樣。利用無菌刷子輕輕將附著在植物根系的土壤刷落，作為該植物群落區根際土壤。將樣品迅速帶回實驗室，立即自然風干、過篩，置于4 ℃冰箱保存備用，于2018年9月進行試驗。采樣地具體信息見表1。

1.2.1 培養基[17] WCX培養基：CaCl2·2H2O 0.1%，4-羥乙基哌嗪乙磺酸（HEPES）0.48%，瓊脂1.5%，pH值7.2。培養基滅菌后，加入終濃度為25 μg/mL的放線菌酮溶液;培養基凝固后用活的大腸桿菌在其表面畫線。

ST21CX培養基：A液，K2HPO4 0.1%，酵母抽提物0.002%，瓊脂1.5%，蒸餾水670 mL;B液，KNO3 0.1%，MgSO4·7H2O 0.1%，MnSO4·7H2O 0.01%，CaCl2·2H2O 0.1%，FeCl3·6H2O 0.02%，蒸餾水330 mL。高壓蒸汽滅菌后將A、B等2個溶液混合，加入放線菌酮溶液（終濃度為25 μg/mL）。為分離嗜纖維素黏細菌，可在培養基表面放置滅過菌的濾紙。

VY/2培養基：安琪酵母0.5%，CaCl2·2H2O 0.1%，MgSO4·7H2O 0.05%，瓊脂1.5%，pH值7.6。高壓蒸汽滅菌后加入VB12溶液（終濃度為 0.5 μg/mL）和放線菌酮溶液（終濃度為25 μg/mL）。

CAS液體培養基：酪蛋白胨0.3%，MgSO4·7H2O 0.1%，pH值7.2。

VY/4培養基：安琪酵母0.25%，CaCl2·2H2O 0.1%，瓊脂1.5%，pH值7.2。

1.2.2 試驗菌株 大腸桿菌（Escherichia coli）、枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）、釀酒酵母菌（Saccharomyces cerevisiae）均由筆者所在實驗室提供;金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）、沙門氏菌（Salmonella typhimurium）和鏈格孢菌（Alternaria alternata）分別由石河子大學動物科技學院和農學院提供。以上菌株用于測定黏細菌的抗菌活性。

1.3 試驗方法

1.3.1 黏細菌菌株的分離 利用兔糞誘導法[28]、大腸桿菌劃線誘導法和濾紙誘導法[29]對艾比湖濕地可培養黏細菌進行分離。取適量樣品置于已滅菌的培養皿內，于58 ℃烘箱內處理1～2 h，以除去樣品中不耐熱的雜菌及變形蟲[30]。用100 μg/mL的放線菌酮溶液浸泡樣品過夜。次日，倒掉廢液，取黃豆粒大小的樣品接種于WCX大腸桿菌劃線培養基、ST21CX濾紙誘導培養基及ST21CX兔糞誘導培養基中，封口。30 ℃恒溫培養7 d，持續觀察子實體的形成情況。每組試驗設置3個重復。

1.3.2 黏細菌的純化和驗純 用無菌竹簽挑取兔糞表面及大腸桿菌周圍的子實體，采用直接純化法、反復轉接純化法、加熱純化法（58 ℃）和冷凍純化法（-80 ℃）進行純化。挑取純化后的菌株接種于CAS液體培養基中，搖床過夜培養。若培養基澄清則說明該菌株已純;若培養基渾濁，則在VY/2固體培養基上繼續純化。將已純菌株用25%的甘油于-80 ℃進行長期保存。

1.3.3 黏細菌的形態學分類 利用熒光顯微鏡對菌株的菌落形態、子實體形態、營養細胞及黏孢子形態進行觀察[16-17，31]并拍照。參考《Bergeys manual of systematic bacteriology》[31]和《The prokaryotes》（第2版）[32]的分類標準，對獲得的純菌株進行初步鑒定。

1.3.4 菌株生理生化測定 根據《伯杰細菌鑒定手冊》（第8版）中對黏細菌理化特征的描述，對菌株進行LB液體培養、明膠液化、吐溫-80利用、脲酶利用、硝酸鹽還原、剛果紅試驗、纖維素降解、過氧化氫反應、淀粉水解與牛奶胨化等試驗。

1.3.5 黏細菌16S rDNA系統發育分析 采用十六烷基三甲基溴化銨（CTAB）法提取菌株的基因組DNA，利用細菌16S rDNA通用引物27F[33]和1495R[34]對黏細菌16S rDNA序列進行擴增。擴增產物送至北京華大基因研究中心有限公司進行測序。將測序所得的序列在NCBI網站上進行BLAST序列比對，再用MEGA 5.0軟件（Neighbor-Joining法）構建系統發育樹，對艾比湖濕地可培養黏細菌多樣性進行分析。本研究的測序序列已提交至GeneBank數據庫。

1.3.6 黏細菌抗菌活性分析 將黏細菌菌株接種在VY/2固體培養基上培養7 d，待其長滿平板后，用滅過菌的打孔器打孔，制備黏細菌菌餅若干。

黏細菌抗細菌及抗釀酒酵母菌活性分析將試驗菌株：大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、沙門氏菌和枯草芽孢桿菌分別接種至牛肉膏蛋白胨液體培養基內，將釀酒酵母菌接種至馬鈴薯葡萄糖瓊脂（PDA）液體培養基內，37 ℃、180 r/min振蕩培養至菌液吸光度（D600 nm）為0.5。各取一定量的菌液，分別均勻涂布至牛肉膏蛋白胨固體培養基和PDA固體培養基上，晾干。用滅過菌的竹簽扎取黏細菌菌餅倒扣在涂有試驗菌株的培養基的一側，另一側放置同樣大小的無菌的VY/2瓊脂塊作為空白對照，封口。37 ℃恒溫培養7 d，觀察抑菌圈大小。每組試驗設置3個重復。

黏細菌抗鏈格孢菌活性分析：用滅過菌的竹簽扎取2～3塊黏細菌菌餅，將其倒扣在VY/4固體培養基上[35]，在超凈臺內放置1夜。次日，在離黏細菌菌餅約1 cm處的位置放置1塊相同大小的鏈格孢菌菌餅，另一側放置同樣大小的無菌的VY/2瓊脂塊作為空白對照，封口。30 ℃恒溫培養7 d，觀察抑菌圈大小。每組試驗設置3個重復。

2 結果與分析

2.1 不同樣品中黏細菌的分離與純化

試驗分析了不同樣品中黏細菌的分離情況。利用傳統的黏細菌分離方法，從新疆艾比湖濕地采集的15份樣品中共分離出60株疑似黏細菌菌株，經純化得到22株純菌株，純菌率為36.7% （表2）。研究結果表明，胡楊、蘆葦和鹽角草樣品中均能誘導出球形（或卵球形）、肉粉色（或橘紅色）的子實體，且從胡楊根際土壤中分離到的黏細菌菌株數最多;朽木、鹽角草和蘆葦樣品中均能誘導出黃色（或黃綠色）、橢圓形或形狀不規則的子實體，且鹽角草根際土壤中誘導出的該類黏細菌是最多的;花花柴根際土壤中僅誘導出單個分布的圓形或近圓形的黃色子實體。然而，其余土壤樣品中未誘導純化出黏細菌菌株，這可能與各群落區的土壤類型、根系分泌物及土壤理化因子等有關。

2.2 黏細菌菌株的鑒定

2.2.1 菌株的形態特征 根據菌株的子實體形態、菌落形態、營養細胞及黏孢子形態，將22株疑似黏細菌菌株分為3類，結果如表3所示。這些菌株形態各異，種類多樣，在VY/2固體培養上可形成不同形狀的菌落，呈圓形（或同心圓）擴展或呈放射狀波紋，同時在菌落邊緣可形成薄而半透明的膜;子實體肉眼可見，以粉紅色、黃色和金黃色為主，形狀主要為球形或卵圓形，能產生大量的黏液;其營養細胞為細長桿狀、兩端稍尖、可彎曲，大小一般為（0.6～1.0） μm×（2～10） μm，為Ⅰ型營養細胞;黏孢子主要為橢圓形、卵圓形或圓形。部分菌株形態特征如圖1所示。

2.2.2 菌株的生理生化特征 對22株菌株進行理化性質檢測，發現所有菌株均不能在LB液體培養基中生長，且能夠利用吐溫-80、吸附剛果紅、可使硝酸鹽還原、淀粉水解、牛奶胨化;菌株WCX_LG-5對濾紙有輕微地降解作用，其余菌株均不能使濾紙降解。所有菌株理化特征與《伯杰氏細菌手冊》中對黏球菌屬特征的描述相符，進一步結合形態特征，初步認定22株純菌株為黏球菌屬菌株。

2.2.3 菌株16S rDNA系統發育分析 通過形態鑒定并結合菌株理化性質，初步認定22株菌株為黏球菌屬菌株。為進一步確定其分類，通過CTAB法提取了22株菌株的基因組DNA，利用細菌通用引物對菌株的16S rDNA序列進行PCR擴增，并將擴增產物送至華大基因公司進行測序。將測序后所得序列在NCBI上進行BLAST序列比對，利用MEGA 5.0軟件中的Neighbor-Joining 法構建系統發育樹，對其進行系統發育分析。由圖2可看出，以脫硫弧菌（Desulfovibrio desulfuricans）作為外群菌株，22株菌株分為3個分支。Ⅰ類菌株的分支屬于黏球菌屬（Myxococcus sp.，2株）;Ⅱ類菌株的分支屬于黏球菌屬中的變綠黏球菌（Myxococcus virescens，14株）;Ⅲ類菌株的分支屬于黏球菌屬中的橙色黏球菌（Myxococcus fulvus，6株）。然而，這3類菌株均屬于黏球菌屬（Myxococcus），這與菌株的形態鑒定結果相一致。由此可以看出，黏球菌屬為艾比湖濕地可培養黏細菌的優勢種屬，且該地區可培養黏細菌多樣性不高，這可能與該地區特殊的土壤環境、植被類型和氣候等因素有很大關系。

2.3 黏細菌菌株的抗菌特性分析

利用平板對峙法，初步探究了22株黏細菌對6種指示菌株的抗菌活性。將指示菌株與黏細菌分別在牛肉膏蛋白胨固體培養基、PDA培養基及VY/4固體培養基上共同培養一定時間后，觀察黏細菌抑菌情況并記錄抑菌圈的大小。黏細菌抗菌活性檢測結果顯示，22株黏細菌均表現出對1種或多種指示菌株產生抗性，如圖3所示。其中，有14株黏細菌均可抑制大腸桿菌和沙門氏菌的生長，15株對枯草芽孢桿菌的生長表現出抑制作用，14株對金黃色葡萄球菌的生長表現出抑制作用，17株可以抑制釀酒酵母菌的生長，11株黏細菌能夠抑制鏈格孢菌的生長。然而，菌株WCX_LG-5和TF_YJC-1對6種指示菌株均具有抑制作用，具有廣譜的抗菌活性。此外，筆者所在課題組還發現歸屬于同一個種的黏細菌菌株對6種指示菌株的抗性具有一定的差異，結果如表4所示。從表5中可以看出，黏球菌屬菌株和橙色黏球菌能夠抑制釀酒酵母菌和鏈格孢菌的生長，而變綠黏球菌對大腸桿菌、枯草芽孢桿菌、釀酒酵母菌、沙門氏菌、金黃色葡萄球菌和鏈格孢菌均有抑制作用，這說明變綠黏球菌具有廣譜的抗菌活性。

3 討論

3.1 影響艾比湖濕地可培養黏細菌多樣性的因素

利用傳統的黏細菌分離方法，從新疆艾比湖濕地14份土壤樣品及1份朽木樣品中分離純化到14株變綠黏球菌、6株橙色黏球菌和2株黏球菌屬菌株，提示艾比湖濕地黏細菌多樣性不高，這與張鮮姣等對新疆鹽堿化土壤中黏細菌多樣性研究結果[18]一致。分析其原因主要有：（1）土壤理化因子（鹽堿度）。鹽堿地土壤顯著的特點是土壤的pH值、含鹽量較高，土壤肥力缺乏[36]，土壤pH值、含鹽量及土壤中的營養物質含量與根系微生物多樣性呈顯著負相關[37]。通常，黏細菌在中性或偏堿性及有機質豐富的土壤中較為常見[15，38]。而艾比湖濕地土壤鹽堿化嚴重，土壤養分及營養物質均處于較低水平[39]，因此該地區的鹽堿環境不利于黏細菌的生長。此外，在這種特殊的極端鹽堿環境中，可能有一些新種未被發現。（2）土壤性質。黏細菌為土壤中常見的腐生菌，通常一小撮土壤就可分離出較多的黏細菌[31]，但在不同的土壤環境中黏細菌的分布是不均勻的[40]。黏細菌在營養豐富的土壤樣品中較為豐富，而在含沙土壤中黏細菌含量較少[41]。艾比湖濕地的土壤多為沙性鹽堿土且土壤腐殖質含量較低，這可能是影響黏細菌分布及其多樣性的重要因素之一。（3）植被類型。從14種植物根際土壤樣品中分離篩選黏細菌菌株，其中在鹽角草、蘆葦、胡楊和花花柴根際土壤樣品中分離獲得了黏細菌菌株，其余植物根際土壤樣品中未分離純化出黏細菌。此外，從朽木、鹽角草和蘆葦樣品中都分離到了變綠黏球菌，然而從鹽角草樣品中分離到最多;從胡楊樣品中分離到的橙色黏球菌最多，而從花花柴樣品中只分離到2株黏球菌屬的菌株，而其他樣品中均未分離出黏細菌菌株，這說明不同的植被類型及根系分泌物可能會影響黏細菌的分布及其多樣性特點。（4）黏細菌分離方法。蟻爍星等通過改進分離方法，大大提高了誘導出的黏細菌的種類和數目[42]。而傳統的黏細菌分離方法本身具有一定的局限性[43]，兔糞誘導法和大腸桿菌誘導法主要針對嗜細菌、黏細菌的分離，而濾紙誘導法主要分離嗜纖維素黏細菌菌株[44]，所以每種方法并不適用于樣品中所有黏細菌菌株的分離。此外，有的黏細菌在純化過程中，其子實體會隨著純化傳代次數的增加而出現不生長、甚至出現死亡等情況[45]。因此在黏細菌分離純化過程中可能會丟失一些種屬，所以分離方法在一定程度上也會影響黏細菌的多樣性。

3.2 黏細菌抗菌活性分析

黏細菌作為第三大類藥源微生物類群，其次級代謝產物的抗菌活性在其捕食細菌的過程中發揮著重要作用[20]，而β-1，6-葡聚糖酶是目前報道的唯一的具有糖苷水解酶活性的外膜蛋白，是黏細菌捕食真菌的關鍵因子[35]。由于黏細菌不同種屬之間的特性差異較大，導致其捕食研究較為緩慢。試驗初步探究了22株黏細菌對指示細菌和植物病原真菌的抗菌特性。結果表明，22株黏細菌菌株均對一種或多種指示菌株產生抗性，這可能與黏細菌的捕食作用及其產生的次級代謝產物有關。

大腸桿菌是腸道桿菌中的一種，可以引起人或動物的腸道感染，此外還會引起尿道和膀胱等感染[46]。金黃色葡萄球菌是常見的食源性致病菌，在適當的條件下，金黃色葡萄球菌能夠產生腸毒素，引起食物中毒，它是僅次于沙門氏菌和副溶血桿菌的第三大微生物致病菌。分離得到的22株黏細菌中，14株變綠黏球菌不僅能夠抑制大腸桿菌和金黃色葡萄球菌的生長，而且對枯草芽孢桿菌和沙門氏菌具有抑制作用，具有廣譜的抗菌活性，這可能是由于變綠黏球菌通過分泌蛋白酶、溶菌酶等裂解酶對指示菌株進行消化和捕食的結果。試驗中分離得到的6株橙色黏球菌對大腸桿菌、枯草芽孢桿菌及金黃色葡萄球菌均無抑制作用，這與惠明等對橙色黏球菌抗菌活性分析結果[47]不一致，這可能與分離黏細菌的樣地及產生代謝產物菌株的特異性有很大關系。此外，試驗結果顯示同一種屬的黏細菌對指示菌株的抗性具有一定的差異性，這可能與黏細菌產生的活性代謝產物的種類有關。

我國大面積種植梨樹，其果肉營養豐富。其果實和葉片等往往會被鏈格孢菌侵染，引發梨黑斑病，這嚴重影響梨的產量和品質[48]。因此，對梨黑斑病病原微生物的生物防治是一件刻不容緩的事情。抗菌結果顯示，分離得到的14株黏細菌能夠抑制鏈格孢菌的生長，這為梨黑斑病病原微生物的防治及微生物農藥的開發提供了新方案，同時也為黏細菌菌株代謝產物的深入研究提供了理論數據，具有較好的現實意義。此外，通過對黏細菌抗菌活性的初步探究，發現菌株WCX_LG-5和TF_YJC-1對6種指示菌株的生長均具有抑制作用，具有廣譜的抗菌活性，是一類具有開發為菌劑潛力的微生物資源，在今后的研究中有望對其代謝產物進行更深入的研究。

4 結論

利用黏細菌傳統分離方法，從新疆艾比湖鹽堿濕地中分離出22株黏細菌菌株。所有菌株最終被鑒定為橙色黏球菌、變綠黏球菌和黏球菌屬菌株。由此可知，艾比湖濕地可培養黏細菌多樣性不高，黏球菌屬為該地區可培養黏細菌的優勢種屬。

黏細菌能夠抑制病原微生物的生長。22株黏細菌對一種或多種指示細菌和植物病原真菌的生長具有抑制作用，且同一種屬的黏細菌對指示菌株的抗性具有一定的差異性。

有的黏細菌已被開發為微生物菌劑用于農業生產。菌株WCX_LG-5和TF_YJC-1具有廣譜的抗菌活性，是一類具有開發為微生物農藥前景的微生物資源，為其代謝產物的進一步研究提供了基礎。

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