不同pH環境對胃上皮細胞系GES-1蛋白質組的影響

施韻 張玉娟

【摘要】目的：探討不同 pH 環境對胃上皮細胞系 GES-1蛋白質組的影響。方法：購置胃上皮細胞 GSE-1系，分別放置在不同試管中，完成分組、標記。實驗組試管細胞使用由濃鹽酸（HCl）、氫氧化鈉（NaOH）將培養基pH.調節至6.8（酸性）、9.4（堿性），未經調配的 RPMI.1640（pH.7.4）作為對照組，將 GES-1置于酸性、對照組、堿性3種pH.下培養。完成三組細胞總蛋白的提取，用 TMT（Tandem.Mass.Tags）技術對 GSE-1細胞蛋白質組進行分析。借助搜庫軟件 Proteome.Discoverer.2.4（PD2.4，Thermo）檢索不同 run 的圖譜，根據檢索結果實現蛋白質的鑒定與定量。結果：相同初始細胞量的GES-1在pH.6.8、.pH.7.4（CK）、pH.9.4條件下培養7.d后，細胞狀態呈現出明顯差異。而在 pH.9.4中培養的細胞，細胞形態略微變圓，細胞密集度與對照組比有所下降，但總體來說生長狀況良好。與對照組比，在堿性環境中鑒定出的差異表達蛋白僅19個，其中只有1個為下調蛋白; GES-1在弱酸性環境下培養7.d 后蛋白質表達發生了較大變化，與對照組比共鑒定到136個差異表達蛋白，包含96個上調蛋白和40個下調蛋白。結論：胃上皮細胞 GES-1最適合在 pH.7.4的環境中生存，但是對堿性的耐受能力非常強，能在 pH.9.4的強堿性條件下保持較好的狀態;而細胞對酸的耐受力相形見絀，僅僅在 pH.6.8的影響下便難以維持正常的生命活動，多與不同環境下細胞的功能等有關。

【關鍵詞】環境 pH;胃上皮細胞; TMT 定量蛋白質組

【中圖分類號】R573【文獻標識碼】A 【文章編號】2096-5249（2022）06-0183-04

作為人體重要的消化器官，胃的重要性不言而喻。泌酸是胃消化過程中獨特而重要的環節[1]，與人體其他部位比，胃部環境 pH 波動幅度大（pH 參考值2.0～7.4）[2]，某些物質或藥物可破壞胃黏膜屏障， H+迅速向黏膜內侵襲，引起一系列病理：當人體胃部組織中分泌的胃酸過多，則會引起胃受損，增加胃潰瘍等疾病發生率;而胃酸缺乏，細菌容易在胃內過度繁殖，進而引發各種慢性胃黏膜炎病變[3]。同時，多種胃部疾病反過來也會影響胃酸分泌。胃癌屬于發病率較高的消化道惡性腫瘤，且近年來疾病發生率呈上升趨勢。既往研究表明，造成我國胃癌高發的主要原因包括幽門螺桿菌感染（HP）、遺傳因素、飲食習慣、長期精神壓力大等。現有研究表明，胃癌發生與胃內低酸環境相關[4]，隨胃癌病期進展，腫瘤增大，各種亞型的胃癌無酸率均逐漸升高[5]。胃酸改變是胃部疾病的重要特征，因此，本研究在體外模擬了酸堿度改變后人胃黏膜上皮細胞株（GES-1）蛋白質組表達情況的變化，以期從分子角度揭示胃酸對胃黏膜細胞的影響，報道如下。

1 材料與方法

1.1儀器與設備

二氯化鈷，購自于Sigma 公司;胎牛血清、 DMEM 培養液，購自于 Gibco公司;臺式高速低溫離心機，購自于德國Herolab公司; Bradford 蛋白質定量試劑盒，購自于碧云天;基因擴增儀，型號Proflex，購自于 Life? Technologies 公司; Qubit 熒光計，型號： Qubit3.0，購自于 Life Technologies 公司;臺式高速低溫離心機，購自于德國Herolab公司;離心濃縮系統， DNA120，購自于德國 LEICA公司;蛋白酶抑制劑、 HPLC 水、能量吸收分子-芥子酸，購自于美國 Sigma 公司;細胞培養基，含有5%胎牛血清、1%間充質干細胞生長因子、1%青鏈霉素雙抗，購自于美國ScienCell公司。

1.2細胞培養

胃上皮細胞 GSE-1來自美國模式培養物集存庫（ATCC），在添加有10%胎牛血清、100×青霉素-鏈霉素的RPMI 1640（pH 7.4）培養基中于37℃、5%CO2中培養，將細胞分別放置在不同試管中，完成分組、標記。

實驗組試管細胞使用由濃鹽酸（HCl）、氫氧化鈉（NaOH）將培養基 pH 調節至6.8（酸性）、9.4（堿性），未經調配的RPMI 1640（pH 7.4）作為對照組，將 GES-1置于酸性、對照組、堿性3種 pH 下培養，每種 pH 各3個重復，7 d 后用胰酶消化，收集細胞沉淀進行蛋白質組測序，上述所有操作嚴格遵循儀器與試劑盒說明書完成。

1.3總蛋白提取

從-80°C冰箱取出樣本，轉移到1.5 mL離心管中，胰酶消化后收集細胞，采用冰預冷PBS 完成細胞2次清洗，向細胞中加入100μL Western 及 IP裂解液，并加入預先配制好的DB蛋白溶解液（pH=8.5）;充分振蕩后混合均勻;待上述操作完畢后，放置在超聲冰水浴中，連續完成裂解5 min，離心15 min，速度為12000 g，設定離心溫度為4℃，操作結束后取上清，加入DTT10 mM，在56℃下完成1 h反應，加入足量IAM，1 h避光反應[6-8]。使用 Bradford 蛋白質定量試劑盒（購自碧云天）進行質量檢測，上述所有操作均按照Thermo? BCA Protein Assay 蛋白濃度測定試劑盒說明書操作，并于96孔板中制作標準曲線，保證線性系數在0.95以上，待測樣品設置兩個復孔，于37℃恒溫箱中連續進行30min 孵育，然后于酶標儀中570 nm 波長下讀取吸亮度，根據標準曲線換算出蛋白樣品濃度。

1.4蛋白質組分析

用 TMT（Tandem Mass Tags）技術對GSE-1細胞蛋白質組進行分析。取蛋白樣品，酶切后標記TMT（購自Thermo）[9]。使用 L-3000 HPLC 系統進行餾分分離，色譜柱為Waters BEH C18（4.6×250 mm，5μm），柱溫設為45°C。液質檢測使用 Q ExactiveTM HF-X質譜儀（購自Thermo），NanosprayFlexTM（ESI）離子源，設定離子噴霧電壓為2.1 kV，離子傳輸管溫度為320°C。選取全掃描中離子強度TOP 40的母離子使用高能碰撞裂解（HCD）方法碎裂，進行二級質譜檢測，二級質譜分辨率設為30000（200 m/z），C-trap最大容量為5×104，C-trap最大注入時間為54 ms，肽段碎裂碰撞能量設為32%，閾強度設為1.2×105，動態排阻范圍設為20 s。

1.5蛋白質鑒定與定量

借助搜庫軟件Proteome Discoverer 2.4（PD2.4，Thermo）檢索不同 run 的圖譜，根據檢索結果實現蛋白質的鑒定與定量。對于檢索可信度>99%的譜肽（PSMs）稱為可信PSMs。可信PSMs 中需至少包括一個特有肽段的蛋白質（稱為可信蛋白）。保留可信譜肽和可信蛋白并進行驗證;去除不符合要求的肽段和蛋白。借助T-tes t 檢驗完成蛋白質的定量分析，對于兩組定量存在差異的蛋白稱為差異表達蛋白（DEP）。本實驗選擇FC≥1.5（P ≤0.05）的蛋白為上調表達蛋白， FC≤0.67（P ≤0.05）的蛋白為下調表達蛋白，同時使用interproscan軟件對差異表達蛋白進行GO富集分析[10-11]。

1.6統計分析

采用 SPSS 24.0軟件處理。計數資料行χ2檢驗，采用[ n（%）]表示;計量資料行 t 檢驗，采用（±s）表示。若 P<0.05表示差異有統計學意義。

2 結果

2.1不同pH條件下GES-1的生長狀態

相同初始細胞量的 GES-1在 pH 6.8、pH 7.4（CK）、 pH 9.4條件下培養7 d后，細胞狀態呈現出明顯差異。見圖1。

RPMI 1640原本的 pH 值為7.4，以此作為對照組，在該條件下，胃上皮細胞形態正常，生長狀況良好，細胞密集度較高。而在 pH 9.4中培養的細胞，細胞形態略微變圓，細胞密集度與對照組比有所下降，但總體來說生長狀況良好。相比之下，細胞在 pH 6.8中培養后形態變化巨大，與兩外兩種條件下的細胞生長狀況比有肉眼可見的差異，細胞狀態整體較差，大部分細胞趨近于變圓、死亡，細胞數量也更少。這一結果表明，胃上皮細胞 GES-1最適合在 pH 7.4的環境中生存，但是對堿性的耐受能力非常強，能在 pH 9.4的強堿性條件下保持較好的狀態;同時，細胞對酸的耐受力相形見絀，僅僅在 pH 6.8的影響下便難以維持正常的生命活動，這一現象佐證了胃癌發生與胃內低酸環境相關。

2.2 TMT定量質譜分析

TMT技術利用多種同位素試劑標記蛋白多肽N 末端或賴氨酸側鏈基團，經高精度質譜儀串聯分析，共鑒定出7564個蛋白質，差異表達蛋白如火山圖所示，見圖2。與對照組比，在堿性環境中鑒定出的差異表達蛋白僅19個，其中只有1個為下調蛋白; GES-1在弱酸性環境下培養7 d后蛋白質表達發生了較大變化，與對照組比共鑒定到136個差異表達蛋白，包含96個上調蛋白和40個下調蛋白。以上定量質譜結果與細胞在三種環境下的生長狀態相符合。

2.3差異蛋白GO富集分析

分別對在堿性、酸性環境中差異表達的蛋白質進行 GO 功能富集分析。在堿性環境中差異表達的蛋白與脂質、蛋白質等生物大分子的合成、運輸、加工有關;在酸性環境中差異表達的蛋白傾向于膜蛋白，功能上通過改變氧化還原酶的活性來調控氧化還原過程，也與細胞的免疫應激相關，見圖3。

3 討論

酸堿平衡是人體維持內環境穩定的重要因素。對于正常細胞而言，細胞外液 pH 值為7.35～7.45[12]。但是，在一些病理或生理條件下，如：組織缺氧、酸中毒或堿中毒時， pH 能在6.5～8.1波動，并由此引起血管張力改變，增加疾病發生率。既往研究表明， pH 是通過細胞內 pH 值影響細胞代謝及信號傳遞途徑，改變細胞的功能。胃是人體重要的消化器官，近年來隨著人們生活方式的改變，導致胃癌發生率呈上升趨勢。目前，胃癌是危害我國公共健康較為嚴重的惡性腫瘤之一，而我國最為胃癌高發國家，全球每年新發病例中，42%新發病例來自我國，發病人數超過40萬人。多數胃癌由于癥狀不明顯，確診時常為晚期，導致患者臨床治療難度較大。因此，加強胃癌患者早期診斷及治療成為當前研究熱點。

國外學者研究表明[13]，胃癌的發生是一個多因素過程，除了與遺傳因素有關外，亦與環境、生活方式存在緊密的聯系。既往研究表明，腫瘤微環境是適合腫瘤細胞生長的內環境，環境中PH值等能直接參與疾病的發生、發展。因此，研究不同 pH 值環境對位上皮細胞增殖和蛋白質組的影響，能為臨床制定干預措施提供參考依據。目前，臨床上常見的胃部疾病較多，包括：胃潰瘍、胃癌等，發病后部分患者伴有出血。但是，由于患者發病后胃酸分泌量較多，能對細胞增殖、生長的內環境產生影響[14]。本研究中，比較不同 pH 值下胃上皮細胞GES-1的生長狀態，結果表明：胃上皮細胞 GES-1最適合在 pH 7.4的環境中生存，但是對堿性的耐受能力非常強，能在 pH 9.4的強堿性條件下保持較好的狀態;同時，細胞對酸的耐受力相形見絀，僅僅在 pH 6.8的影響下便難以維持正常的生命活動。從本研究結果看出，胃癌的發生多與胃內低酸環境有關。出現這種現象主要是由于，酸性環境下回破壞抗原抗體反應的穩定性，能破壞紅細胞的細胞膜，引起血紅蛋白抗原消失，并對胃上皮細胞的增殖與生長產生影響，導致細胞發生突變，增加胃癌發生率。

定量蛋白質組學（TMT技術）屬于是一種新型的技術，能實現基因組表達的全部蛋白，精準的鑒定、測量混合體系內的所有蛋白。目前， TMT技術廣泛用于尋找或篩選差異性表達蛋白，揭示不同細胞的病理和生理功能與作用[15]。為了進一步分析不同 pH 環境對正常胃上皮細胞系 GES-1細胞蛋白質組的影響，本研究中引入TMT技術，結果表明：與對照組比，在堿性環境中鑒定出的差異表達蛋白僅19個，其中只有1個為下調蛋白; GES-1在弱酸性環境下培養7 d后蛋白質表達發生了較大變化，與對照組比共鑒定到136個差異表達蛋白，包含96個上調蛋白和40個下調蛋白。以上定量質譜結果與細胞在三種環境下的生長狀態相符合，從本研究結果看出，弱酸性環境下，胃上皮細胞 GES-1蛋白發生明顯的變化，而堿性環境中蛋白發生變化相對較少。此外，本研究中分別對在堿性、酸性環境中差異表達的蛋白質進行 GO功能富集分析，進一步驗證不同 pH 環境下蛋白變化的原因，結果表明：對于堿性環境下胃上皮細胞 GES-1中差異蛋白相對較少，其蛋白差異可能與脂質、蛋白質等大分子的運輸、合成及加工等有關。但是，在酸性環境下，差異蛋白數量較多，其功能亦發生明顯變化，多與細胞在該環境下細胞免疫應激有關。

綜上所述，胃上皮細胞GES-1最適合在 pH 7.4的環境中生存，但是對堿性的耐受能力非常強，能在 pH 9.4的強堿性條件下保持較好的狀態;而細胞對酸的耐受力相形見絀，僅僅在pH 6.8的影響下便難以維持正常的生命活動，多與不同環境下細胞的功能等有關。

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（收稿日期：2021-11-15）