miR-153通過戊糖磷酸途徑抑制膠質(zhì)母細(xì)胞瘤干細(xì)胞增殖研究

鄧一帆

【摘要】目的：研究 miR-153通過戊糖磷酸途徑抑制膠質(zhì)母細(xì)胞瘤干細(xì)胞增殖的情況。方法：從惠州市中心人民醫(yī)院收集手術(shù)切除的膠質(zhì)母細(xì)胞瘤組織樣本，原代培養(yǎng)為膠質(zhì)母細(xì)胞瘤干細(xì)胞，分為 miR-153組、空白對照組（無意義寡核苷酸鏈）。分析轉(zhuǎn)染 miR-153對膠質(zhì)母細(xì)胞瘤干細(xì)胞增殖、凋亡的影響。結(jié)果：轉(zhuǎn)染后1.d、5.d， miR-153組和空白對照組的細(xì)胞存活率對比差異不顯著（P>0.05）;轉(zhuǎn)染后2.d、3.d、4.d， miR-153組的細(xì)胞存活率低于空白對照組（P<0.05），其中轉(zhuǎn)染后4.d 出現(xiàn)最小細(xì)胞生存率。miR-153組的細(xì)胞凋亡率高于空白對照組（P<0.05）。結(jié)論：miR-153可以抑制膠質(zhì)母細(xì)胞瘤干細(xì)胞增殖，是膠質(zhì)母細(xì)胞瘤治療的靶點(diǎn)，具有臨床應(yīng)用價(jià)值。

【關(guān)鍵詞】miR-153;戊糖磷酸途徑;膠質(zhì)母細(xì)胞瘤;干細(xì)胞;增殖;凋亡

【中圖分類號】R739.41【文獻(xiàn)標(biāo)識碼】A 【文章編號】2096-5249（2022）05-0038-03

膠質(zhì)瘤是臨床上膠質(zhì)母細(xì)胞瘤（glioblastoma，GBM）的最常見的一種類型，也是四級膠質(zhì)瘤，同時(shí)也是膠質(zhì)瘤中惡性程度最高的一種。其主要發(fā)生在40～60歲的中年人群。腦膠質(zhì)瘤是中樞神經(jīng)系統(tǒng)中最常見的原發(fā)性腫瘤，而其中過半數(shù)是高度惡性的GBM，它的總體預(yù)后并不十分理想[1]。目前成人GBM 規(guī)范化治療后的中位生存期僅14.2個(gè)月[2]。在GBM中存在廣泛的糖代謝改變，其中即包括戊糖磷酸途徑（pentose phosphate pathway，PPP）。 PPP為細(xì)胞增殖提供物質(zhì)基礎(chǔ)并維持細(xì)胞氧化還原狀態(tài)。在GBM 中， PPP起到促進(jìn)增殖和侵襲的作用，但其調(diào)控機(jī)制有待闡明。 miRNAs 是一類內(nèi)源性非編碼單鏈RNA，在進(jìn)化上高度保守，長度為22個(gè)核苷酸作用，抑制mRNAs翻譯或降解靶mRNAs 的途徑，主要為與靶mRNAs3’末端非編碼區(qū)（3’UTR）不完全互補(bǔ)結(jié)合，從而在個(gè)體發(fā)育、細(xì)胞增殖、凋亡等生理過程中參與。有研究表明[3]，miRNAs 能夠?qū)π盘柾吩斐捎绊懀緩綖閷χ匾谢蜻M(jìn)行調(diào)控，從而將與癌基因或抑癌基因類似的功能發(fā)揮出來。膠質(zhì)瘤等多種腫瘤的發(fā)生均和miRNAs 表達(dá)異常關(guān)系密切。因此， miRNAs 能夠?qū)⑿碌恼J(rèn)識提供給膠質(zhì)瘤發(fā)病機(jī)制與治療靶點(diǎn)的研究。本研究為闡明miR-153通過PPP 影響 GBM增殖的分子機(jī)制，提供GBM治療的靶點(diǎn)具有臨床應(yīng)用價(jià)值，報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1主要材料

從惠州市中心人民醫(yī)院收集手術(shù)切除的 GBM 組織樣本，原代培養(yǎng)為GBM干細(xì)胞，所有患者均為首診首治。購買美國 Invitrogen 公司生產(chǎn)的細(xì)胞培養(yǎng)所需試劑、 DMEM高糖培養(yǎng)基、美國 Abcam 公司生產(chǎn)的抗體、日本Dojindo公司生產(chǎn)的 CCK-8、美國BD 公司生產(chǎn)的 Annexin V-FITC。

1.2方法

1.2.1 GBM干細(xì)胞的培養(yǎng)

收集GBM組織，剪碎，消化后吹打成單細(xì)胞懸液。過濾、離心，在干細(xì)胞培養(yǎng)基中將細(xì)胞重懸，干細(xì)胞培養(yǎng)基包含4μg/L 肝素+20μg/L 表皮細(xì)胞生長因子+20μg/L 成纖維細(xì)胞生長因子+10μg/L 白血病抑制因子+1∶50B27添加劑+1∶100雙抗+Neurobasal 培養(yǎng)基。在37℃、5%二氧化碳細(xì)胞孵箱中放置培養(yǎng)，用 DMEM高糖培養(yǎng)基（含10%胎牛血清）對細(xì)胞分化進(jìn)行誘導(dǎo)。并分為 miR-153組、空白對照組（無意義寡核苷酸鏈）。

1.2.2 GBM干細(xì)胞的鑒定

免疫熒光染色對分選后細(xì)胞巢蛋白（nestin）、CD133表達(dá)進(jìn)行檢測，用DMEM高糖培養(yǎng)基（含10%胎牛血清）對細(xì)胞分化進(jìn)行誘導(dǎo)。免疫熒光染色對神經(jīng)元標(biāo)志物微管相關(guān)蛋白2（microtubule-associated protein 2， MAP2）、分化星形膠質(zhì)細(xì)胞標(biāo)志物神經(jīng)膠質(zhì)纖維酸性蛋白（glial fibrillary acidic protein，GFAP）表達(dá)進(jìn)行檢測，即用40 g/L 多聚甲醛將細(xì)胞固定下來，漂洗后將0.4%Triton X-100加入。將1∶500鼠抗人MAP2單克隆抗體、1∶200鼠抗人巢蛋白單克隆抗體、1∶5000兔抗人GFAP 單克隆抗體、1∶200兔抗人CD133多克隆抗體一抗加入后，將1：200羊抗兔IgG（Alexa ?uor488標(biāo)記）、1∶300羊抗鼠IgG（Alexa ?uor 594）熒光二抗加入，充分混合后對細(xì)胞核進(jìn)行DAPI 染色。

1.2.3 miR-153對GBM干細(xì)胞增殖的影響

構(gòu)建TTN-AS1的野生型、突變型熒光素酶表達(dá)載體，合成miR-153擬似物，通過熒光素酶實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證 TTN-AS1與miR-153的結(jié)合作用和結(jié)合位點(diǎn)。構(gòu)建過表達(dá)和表達(dá)沉默TTN-AS1的GBMCs，檢測miR-153表達(dá)水平變化。過表達(dá)或沉默TTN-AS1后，檢測PPP 相關(guān)分子的表達(dá)變化，包括G6PD、NADPH/NADP+、 GSH/GSSG、ROS、R5P。檢測過表達(dá)或沉默TTN-AS1后， GBMCs增殖、線粒體膜電位、細(xì)胞凋亡水平、 DNA 合成情況的變化。構(gòu)建G6PD 的3’UTR 野生型、突變型熒光素酶表達(dá)載體，通過熒光素酶實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證 miR-153與G6PD的結(jié)合作用和結(jié)合位點(diǎn)。過表達(dá)或沉默miR-153后，檢測PPP相關(guān)分子的表達(dá)變化，包括G6PD、 NADPH/NADP+、GSH/GSSG、ROS、R5P。檢測過表達(dá)或沉默miR-153后， GBMCs增殖、線粒體膜電位、細(xì)胞凋亡水平、DNA 合成情況的變化。運(yùn)用CCK-8法檢測，轉(zhuǎn)染后1d、2 d、3 d、4 d、5 d分別將CCK-8液加入miR-153組、空白對照組細(xì)胞中作用4 h，采用BIO-EEK 酶標(biāo)儀在450 nm處對各培養(yǎng)孔的吸光度（A）值進(jìn)行測定，依據(jù)A值對細(xì)胞增殖情況進(jìn)行判斷。

1.2.4細(xì)胞凋亡檢測

轉(zhuǎn)染后3 d將 Annexin V-FITC 加入 miR-153組、空白對照組細(xì)胞中，采用流式細(xì)胞儀檢測，采用 Cell? Quest 3.3分析軟件分析數(shù)據(jù)。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用 SPSS 21.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理。計(jì)數(shù)資料用[ n（%）]表示，用χ2檢驗(yàn);計(jì)量資料用（±s）表示，用 t 檢驗(yàn)。以 P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 miR-153對GBM干細(xì)胞增殖的影響

轉(zhuǎn)染后1 d、5 d，miR-153組和空白對照組的細(xì)胞存活率對比差異不顯著（P>0.05）;轉(zhuǎn)染后2 d、3 d、4 d， miR-153組的細(xì)胞存活率低于空白對照組（P<0.05），其中轉(zhuǎn)染后4 d 出現(xiàn)最小細(xì)胞生存率，見表1。

2.2 miR-153對GBM干細(xì)胞凋亡的影響

進(jìn)行流式細(xì)胞檢測發(fā)現(xiàn)， miR-153組的細(xì)胞凋亡率高于空白對照組[（9.40±1.97）%比（4.27±0.30）%， t=4.000，P=0.024]。

3 討論

GBM是膠質(zhì)瘤中級別最高的一種類型。膠質(zhì)瘤在世界衛(wèi)生組織中被分為4個(gè)級別，Ⅰ級和Ⅱ級的膠質(zhì)瘤屬于偏良性的膠質(zhì)瘤，也是較低級別的膠質(zhì)瘤;Ⅲ級和Ⅳ級的膠質(zhì)瘤屬于偏惡性的膠質(zhì)瘤，臨床稱為高級別的膠質(zhì)瘤。Ⅳ級膠質(zhì)瘤即 GBM，可分為原發(fā)性和繼發(fā)性。原發(fā)性 GBM。屬于Ⅳ級膠質(zhì)瘤，術(shù)后可能較快復(fù)發(fā)，二次切除后預(yù)后也不佳。繼發(fā)性GBM 是Ⅱ級或Ⅲ級膠質(zhì)瘤，經(jīng)過一次手術(shù)后再次復(fù)發(fā)，但繼發(fā)性 GBM可能復(fù)發(fā)的間隔時(shí)間稍長，預(yù)后比原發(fā)性GBM 稍好。所以，針對不同類型的GBM，預(yù)后不同。

GBM早期可能沒有任何癥狀，但隨著腫瘤的生長，會(huì)產(chǎn)生相應(yīng)的癥狀，可以分為兩類。（1）不同部位的 GBM產(chǎn)生不同的癥狀，如偏癱、感覺麻木、癲癇、患者智力的改變等。（2）腫瘤長得比較大時(shí)，可能會(huì)引起顱內(nèi)壓增高的癥狀。 GBM是一種惡性膠質(zhì)瘤，它是在 WHO 分級里面屬于最惡性的腫瘤之一。目前針對 GBM 的治療原則還是以手術(shù)為主，放化療為輔的一個(gè)原則。 GBM 目前還是神經(jīng)外科難以攻克的一種腫瘤，因?yàn)槠涫亲類盒缘哪[瘤。之所以綜合治療是因?yàn)槿魏我粋€(gè)單獨(dú)的治療都不能達(dá)到一個(gè)很好的效果，所以綜合治療就是手術(shù)為主，輔助的放療和化療，愈后相比較其他腫瘤差。從目前來看，其生存期大概14個(gè)月多一點(diǎn)。最近幾年來，越來越多的研究表明，腫瘤干細(xì)胞在腫瘤的發(fā)生、侵襲、轉(zhuǎn)移、復(fù)發(fā)和對治療的抵抗中發(fā)揮著重要作用[4]。正因?yàn)槿绱耍[瘤干細(xì)胞是非常好的抗腫瘤治療靶標(biāo)。 GBM 干細(xì)胞被不同的研究團(tuán)隊(duì)分離出來，它們具有干細(xì)胞特性，包括自我更新和多向分化能力。與此同時(shí)，它們還具有很強(qiáng)的腫瘤形成能力和更強(qiáng)的對化療放療的抵抗能力[5]。

microRNAs（miRNAs）是一類小單鏈RNA分子，非編碼，內(nèi)源性，長度為12～25個(gè)核苷酸，雖然由轉(zhuǎn)錄而來，但是并不對蛋白進(jìn)行編碼，而是通過不完全互補(bǔ)結(jié)合同源mRNA、序列特異性的方式對mRNA 進(jìn)一步翻譯蛋白合成進(jìn)行抑制或剪切降解mRNA。生物信息學(xué)手段證實(shí)，每個(gè)miRNA 可對上百個(gè)靶基因進(jìn)行調(diào)控，而這些受控基因在所有信號通路廣泛分布，好多個(gè) miRNA 也調(diào)控著1個(gè)靶基因，從而促進(jìn)復(fù)雜的miRNA

信息網(wǎng)絡(luò)的形成。在癌癥等很多生理調(diào)節(jié)與發(fā)病過程中，該類分子均發(fā)揮著極為重要的作用。有研究表明[6]，很多miRNAs 和人類各種惡性腫瘤的發(fā)病機(jī)理關(guān)系密切，患者預(yù)后和特殊的miRNAs 表達(dá)量特異性相關(guān)。在中樞神經(jīng)系統(tǒng)腫瘤中，膠質(zhì)瘤最為常見，其是一種惡性腫瘤，患者具有較差的預(yù)后，原因主要為腫瘤的浸潤性生長速度快，臨床無法將腫瘤完全切除。膠質(zhì)瘤本身的異質(zhì)性導(dǎo)致其對臨床藥物具有較強(qiáng)的抵抗性，同時(shí)腫瘤本身在腦內(nèi)分布，藥物的有效作用無法在血腦屏障的限制下發(fā)揮出來。但是這種現(xiàn)狀在癌基因組阿特拉斯計(jì)劃、基因表達(dá)譜、腫瘤干細(xì)胞理論等作用下顯著改變。現(xiàn)階段雖然在膠質(zhì)瘤研究中miRNA 仍然處于起步階段，但是已經(jīng)確定了特異miRNA 在神經(jīng)膠質(zhì)瘤中的表達(dá)譜，將新的依據(jù)提供給了臨床診斷和治療神經(jīng)膠質(zhì)瘤的工作。近年來，有研究表明[7]，在腦腫瘤的診斷中， miRNA 表達(dá)譜可能能夠作為有用的生物標(biāo)記，并成為新的藥物將腫瘤上漲阻止。

miRNAs 的生物合成機(jī)制為 miRNAs 基因在人類所有染色體中分布， Y染色體除外。 RNA聚合酶Ⅱ轉(zhuǎn)錄對 miRNA 進(jìn)行首先編碼的基因?yàn)樵?miRNA，通常情況下，其核苷酸序列較長，達(dá)到了幾百到一千個(gè)。之后，原始 miRNA 將莖-環(huán)二級結(jié)構(gòu)形成，呈發(fā)夾形狀， RNA酶Ⅲ在細(xì)胞核中對其進(jìn)行加工，促進(jìn)前體 miRNA 的形成，長度為60～70nt左右，最后，在轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白 Exprorin-5的作用下，原始 miRNA 被從核內(nèi)向胞質(zhì)中運(yùn)輸，在 Dicer 酶作用下向短雙鏈 miRNA 進(jìn)一步加工，解旋酶解開雙鏈為成熟 miRNA、miRNA*，前者被引導(dǎo)向沉默復(fù)合體中進(jìn)入，翻譯抑制或降解mRNA，后者以較快的速度被降解[8]。

長鏈非編碼 RNA（Long non-coding RNA，LncR-NA）是一類長度大于200nt的非編碼 RNA，其在轉(zhuǎn)錄沉默、轉(zhuǎn)錄激活、染色體修飾、核內(nèi)運(yùn)輸?shù)染哂兄匾墓δ堋ncRNAs在多種惡性腫瘤，包括GBM 中發(fā)揮重要調(diào)控作用。此外，LncRNAs還是比較靈敏的腫瘤標(biāo)志物，能夠用于腫瘤的早期診斷和預(yù)后評價(jià)。 TTN-AS1起到促進(jìn)食管癌細(xì)胞增殖、轉(zhuǎn)移的作用。但TTN-AS1在 GBM 中的表達(dá)水平及功能尚未見報(bào)道。 miRNA 是由大約23個(gè)核苷酸組成的非編碼單鏈RNA，它與目標(biāo)mRNA 的（3’UTR）互補(bǔ)配對結(jié)合，在轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)控成百上千個(gè)基因的表達(dá)，具有廣泛的生物學(xué)功能[9]。由于存在 miRNA的結(jié)合位點(diǎn)， LncRNA 可以作為內(nèi)源性競爭性RNA，通過競爭性結(jié)合 miRNA，在細(xì)胞中起到 miRNA 海綿的作用，進(jìn)而解除 miRNA 對其靶基因的抑制作用，升高靶基因的表達(dá)水平。前述TTN-AS1和 G6PD 并不存在直接作用。 TTN-AS1可能作為某些 miRNAs 的ceRNA發(fā)揮作用，并間接調(diào)控PPP。綜上所述，申報(bào)人提出科學(xué)假說：由于與 miR-153存在結(jié)合位點(diǎn)， TTN-AS1減弱了 miR-153對下游靶基因的負(fù)調(diào)控作用，最終促進(jìn)PPP 及 GBMCs 惡性增殖。 miRNAs 廣泛參與著腫瘤發(fā)生發(fā)展的調(diào)控，在GBM 中，有些過表達(dá)的 miRNAs 起到了癌基因的作用，而另一些降低表達(dá)的 miRNAs 則起到抑癌基因的作用[10-11]。與此同時(shí)， miRNAs 還廣泛參與對 GBM 干細(xì)胞的干細(xì)胞特性的調(diào)控[12]。

GBM 中存在著顯著的糖代謝異常，其中即包括 PPP[13]。顯著上調(diào)的PPP是GBM快速生長的重要因素，也是 GBM治療的有效切入點(diǎn)，但調(diào)控PPP 的確切機(jī)制有待闡明[14-15]。前期研究發(fā)現(xiàn)，TTN-AS1在 GBM 中高表達(dá)，起到促進(jìn)PPP 和 GBM 增殖的作用。 TTN- AS1負(fù)調(diào)控 miR-153，從而減弱 miR-153對 PPP的關(guān)鍵限速酶 G6PD 的抑制作用，最終促進(jìn)PPP 及 GBM 惡性增殖。為了闡明TTN-AS1、miR-153、G6PD 在調(diào)控軸中的調(diào)控機(jī)制，本研究需要對不同節(jié)點(diǎn)的兩兩結(jié)合調(diào)控關(guān)系進(jìn)行驗(yàn)證。在前期研究中，我們已經(jīng)初步研究了TTN-AS1對 miR-153、miR-153對 G6PD 的調(diào)控作用。本研究闡述miR-153通過戊糖磷酸途徑抑制 GBM干細(xì)胞增殖的情況，結(jié)果表明，轉(zhuǎn)染后1 d、5 d， miR-153組和空白對照組的細(xì)胞存活率對比差異不顯著（P>0.05）;轉(zhuǎn)染后2 d、3 d、4 d，miR-153組的細(xì)胞存活率低于空白對照組（P<0.05），其中轉(zhuǎn)染后4 d出現(xiàn)最小細(xì)胞生存率。 miR-153組的細(xì)胞凋亡率高于空白對照組（P<0.05），說明 miR-153顯著抑制 GBM 干細(xì)胞增殖，并驗(yàn)證了 miR-153可以作為 GBM 治療的新靶點(diǎn)，具有潛在藥物開發(fā)價(jià)值。

綜上所述，此次研究 miR-153通過 PPP抑制 GBM 增殖的分子機(jī)制，提供GBM治療的靶點(diǎn)，具有臨床應(yīng)用價(jià)值。

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（收稿日期：2021-10-25）