抗核抗體檢測和抗核抗體譜檢測在復發性流產診斷中的應用分析

陸子贇 岳朝艷 應春妹

【摘要】目的：通過對復發性流產（RSA）患者抗核抗體（ANA）檢測結果的分析，探討 ANA 檢測與 RSA 的相關性。方法：采用間接免疫熒光法（IIF）測定2020年7～12月收集的1432例 RSA 患者（觀察組）與同時期無不良孕產史的134例正常孕婦（對照組）的 ANA，采用免疫印跡法（LIA）測定其 ANA 譜。比較兩個組別檢測結果，并分析其與 RSA 關系。結果：觀察組中檢出 ANA陽性292例（20.39%）。對照組檢出 ANA陽性9例（6.72%）。觀察組常見 ANA 核型為顆粒型（36.32%）和致密型（32.89%）。觀察組 ANA 譜檢測，各類抗體均有檢出，其中抗 Ro-52抗體（24.55%）和抗 SS-A 抗體（24.19%）檢出率最高， ANA 陰性者也有 ANA 譜檢出。ANA 與 ANA 譜聯合檢測，兩種方法聯合檢測陽性率達到27.65%，兩種方法聯合檢測總體符合率達到.79.40%，觀察組 ANA 和 ANA 譜聯合檢測的靈敏度為 98.49%，特異度為99.61%;觀察組聯合檢測陽性率顯著高于對照組，差異有統計學意義（χ2=20.47， P<0.01）。結論： ANA及 ANA譜聯合檢測有助于 RSA 的臨床診斷。

【關鍵詞】復發性流產;抗核抗體;抗核抗體譜

【中圖分類號】R446【文獻標識碼】A 【文章編號】2096-5249（2022）06-0135-05

Analysis of application of antinuclear antibody detection and an- tinuclear antibody spectrum detection in diagnosis of recurrent abortion

Lu Zi-yun， Yue Chao-yan， Ying Chun-mei△

Department of Laboratory Medicine， Obstetrics and Gynecology Hospital Affiliated to Fudan University， Shanghai 200011， China

【Abstract】Objective：To investigate the correlation between ANTinuclear antibody（ANA）and RSA in pa- tients with recurrent abortion（RSA）. Methods：Indirect immunofluorescence assay（IIF）was used to measure ANA in 1432 RSA patients（observation group）collected from July to December 2020 and 134 normal pregnant women（control group）without adverse pregnancy history during the same period. The results of the two groups were compared，and the relationship between RSA and the two groups was analyzed. Results：In the observa- tion group，292 cases（20.39%） were ANA positive. In the control group，9 cases（6.72%） were ANA positive. The common ANA karyotypes in the observation group were granular（36.32%）and dense（32.89%）. ANA spectrum detection showed that all kinds ofantibodies were detected in the observation group，among which anti-Ro-52 an- tibody（24.55%）and anti-SS-A antibody（24.19%）had the highest detection rates. ANA spectrum detection was also found in ANA negative patients. ANA and ANA spectrum combined detection，the positive rate of the com- bined detection of the two methods reached 27.65%，the overall coincidence rate of the combined detection of thetwo methods reached 79.40%，the sensitivity and speci?city ofthe combined detection of antinuclear antibody and antinuclear antibody spectrum of the observation group was 98.49%，99.61%. The positive rate of combined de- tection in observation group was signi?cantly higher than that in control group，and the di?erence was statistically signi?cant（χ2=20.47，P<0.01）. Conclusion：The combined detection of ANA and ANA spectrum is helpful forthe clinical diagnosis ofRSA.

【Key words】Recurrent spontaneous abortion;Antinuclear antibodies;Antinuclear antibody spectrum

復發性流產（recurrent spontaneous abortion，RSA）也稱為習慣性流產，其定義為連續發生3次或3次以上的自然流產，通常發生的時間在妊娠20周前[1]。引起 RSA 的病因既復雜多又樣，而且可能同時有多種因素異常而致其發病，其中能夠被識別的病因包括染色體異常、生殖道異常、內分泌和免疫功能異常等約占全部病因的50%。進一步研究發現，夫妻染色體異常包括平衡易位、羅伯遜易位等可以影響 RSA 的染色體核型和基因多態性，從而表現為胚胎發育的基因出現病理性異常，影響免疫、內分泌等多種胚胎發育障礙，甚至引起胚胎死亡[2]。引起 RSA 的原因之一是免疫反應，而抗核抗體（antinuclear antibody，ANA）則是免疫反應的常見指標，很多研究表明 ANA 與 RSA 有相關性。本研究旨在通過分析本院2020年7～12月1566例 RSA 患者和正常妊娠孕婦血清中的 ANA 及 ANA譜檢測，分析導致 RSA 的相關指標，為臨床 RSA 患者的診斷和治療提供實驗室依據。

1 對象與方法

1.1研究對象

選取在本院2020年7～12月收集的1432例 RSA 患者作為觀察組，選取同時期就診于本院的正常妊娠婦女共134例作為對照組。觀察組年齡22～47（34.4±4.3）歲，對照組年齡21～41（32.6±3.8）歲。

納入標準： RSA 診斷符合世界衛生組織的相關標準：妊娠在20周以前終止，胎兒體重在500 g以下;均為自然受孕。

排除標準：合并有生殖器感染、畸形等相關病變;有自然流產史、死胎和死產史;精神異常不能配合研究。

1.2方法

1.2.1試劑

ANA 檢測由德國歐蒙公司EUROBlotMasterⅡ全自動免疫印跡儀及相應配套試劑進行相關檢測。

1.2.2試驗方法

抽取靜脈血2 mL，靜置30 min后離心（3000r/ min，10 min）。血清操作過程嚴格按照儀器使用說明書進行并進行結果判定。

1.2.3原理

檢測 ANA 采用猴肝片及HEP-2細胞作為抗原基質，應用間接免疫熒光法（IIF）檢測位置抗原和抗體。

采用免疫印跡法（LIA）檢測 ANA譜，將高分辨率凝膠電泳和免疫化學分析技術相結合，首先進行 SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE），然后進行電轉移和酶免疫定位，綜合SDS-PAGE 的高分辨力和 ELISA法的高特異性和敏感性，根據抗原抗體的特異性結合檢測樣品中的某種蛋白。

1.3統計學方法

應用 SPSS 24.0進行數據統計和分析。計數資料用[ n（%）]表示，應用χ2檢驗;計量資料符合正態性分布，則選擇獨立性 t 檢驗進行分析，以（±s）表示。以 P<0.05認為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 ANA檢測結果對比

本研究中，觀察組共1432例血清樣本，檢出ANA 陽性292例（20.39%）;對照組134例血清樣本，檢出 ANA 陽性9例（6.71%）。觀察組與對照組的 ANA 檢測結果陽性率比較，差異有統計學意義（P<0.0001），見表1。

2.2 ANA核型分布對比

通過熒光顯微鏡下的細胞形態以及熒光染色模型的特征對 ANA 核型進行分類。本研究患者血液樣本中主要分離出顆粒型、胞漿型、致密型和核仁型，其中觀察組顆粒型和致密型最常見，所占比例為36.30%和33.22%，對照組顆粒型和胞漿型更常見，所占比例為33.33%和33.33%。觀察組和對照組 ANA 核型分布比例比較無顯著統計學差異（P>0.05），見表2。

2.3 ANA譜檢測結果對比

對觀察組1432例血液樣本進行 ANA譜檢測結果得出， ANA譜陽性的有205例（14.32%），相較于對照組134例樣本的 ANA譜檢測陽性的7例（5.22%）明顯增高，差異具有統計學意義（P<0.001），見表3。

2.4 ANA與ANA譜聯合檢測結果比較

觀察組 ANA 的陽性率為20.39%（292/1432），ANA 譜的陽性率為14.32%（205/1432）。兩種方法聯合檢測時，396例樣本為陽性，陽性率達到27.65%，兩種方法聯合檢測的總體符合率達到79.40%;對照組中 ANA 檢測陽性率為6.72%（9/134），ANA譜檢測陽性率為5.22%（7/134）。兩種檢測方法聯合檢測時陽性率為9.70%（13/134），總體符合率達到92.54%。兩種方法聯合檢測時，觀察組結果和對照組檢測結果差異有統計學意義（P<0.001），見表4。

2.5 ANA譜抗體類型分布對比

ANA譜可檢測15種特異性抗體，包括核糖核蛋白（nRNP）抗體、抗史密斯抗體（Sm）、抗組氨酰轉運 RNA 合成酶（Jo-1）抗體、干燥綜合征相關抗體SSA 和 SSB、 ROPM-Scl、CENPB、抗增殖細胞核抗原（PCNA）抗體、抗雙鏈 DNA（dsDNA）抗體、抗核小體抗體（AnuA）等。

本研究中，觀察組中有205例 ANA譜陽性，各種不同 ANA譜抗體共檢出277例次，百分比居前2位的抗體分別是抗Ro-52抗體和抗SS-A抗體，所占比例分別是24.55%和24.19%，見表5。

本研究中，對照組中有3例 ANA 陽性和 ANA譜同時陽性的樣本，8例樣本 ANA 陰性而 ANA譜呈陽性，共計檢出11例次 ANA譜陽性抗體。觀察組與對照組 ANA譜抗體類型分布無統計學差異（P>0.05），見表5。

2.6抗核抗體和抗核抗體譜聯合檢測的準確性

將觀察組1432例 RSA 患者的血清樣本進行Wsetern-Blot 檢測抗核抗體，將結果與ANA 和 ANA 譜聯合檢測方法進行比較， ANA 和 ANA譜聯合檢測的靈敏度為98.49%，特異度為99.61%，見表6。

3 討論

當今社會女性生育問題得到了一定重視，不過由于過快的生活節奏、人工流產手術、輔助生殖技術增加等各種原因的出現，生育期婦女復發性流產的比例也在提高，引起了人們的注意。引發 RSA 的病因其實十分復雜，結合目前國內外相關研究，可能同時有多種因素異常而致其發病，其中能夠被識別的病因包括染色體異常、生殖道異常、母體內分泌和免疫功能異常等約占全部病因的50%，其中染色體畸形異常是主要病因，早期 RSA 大多數均由胚胎的染色體畸變導致[3]。進一步流行病學相關研究表明，黃體功能不全可能伴發于23%～60%的 RSA患者，分析可能與黃體功能不全導致黃體酮水平過低，子宮內膜剝脫和轉換障礙，導致RSA。追根溯源，如果患者體內雄激素增高、催乳素增高等能夠引起黃體功能障礙的危險因素也能導致流產和RSA的發生[4]。以上引發RSA因素中，免疫因素相關調查研究結果在近年逐漸被引起重視。母體受孕過程中的胚胎著床過程本質從免疫學角度來說是一種同種異體移植過程，這個過程中母體的免疫系統對于胚胎抗原不會識別為一體抗原，也不會產生自身免疫反應，即母-胎免疫耐受自身免疫病所致[5]。自身免疫相關抗體檢測中發現存在ANA 陽性者發生 RSA 的風險較正常人明顯升高但機制尚未完全闡明。

本研究通過相關免疫檢測，顯示觀察組的 ANA 和 ANA譜檢測結果陽性率均高于對照組，證明這兩項檢測結果對于預測 RSA 的發生有顯著的價值，與以往相關文獻報道結果一致。文獻指出， RSA 主要由自身抗體異常導致，目前相關研究標表明主要相關抗體有 ANA、抗磷脂抗體、抗甲狀腺抗體等，這些抗體的檢測也能為 RSA 的確診和相關病因的篩查提供重要依據，尤其是上述抗體的聯合檢測更進一步提高診斷的靈敏度和特異性[6]。Veglia等[7]發現 RSA 患者的 ANA+血清注射進小鼠腹部體外研究發現小鼠妊娠丟失率顯著增加，并且發現小鼠胎盤中補體C3沉積增加，分析 RNS 發生可能與 ANA+所致免疫反應補體增加致胎盤損傷有關。 Girardi 等[8]在 APS 小鼠模型上也證實了 ANA 通過介導補體因子的激活導致妊娠丟失事件發生。進一步探究其機制發現，妊娠女性對胚胎半抗原有天然的免疫耐受，而 ANA 相關的免疫復合物則會被母體免疫系統識別并釋放炎癥因子，發生體液免疫應答，反之更加加劇了炎癥因子和 ANA 的產生，更促進了免疫復合物沉積和補體的過度激活，造成血管壁破裂，子宮收縮引起流產的發生[9-10]。 ANA 對體內的自身免疫過程反應的敏感性很高， ANA 陽性則能明確免疫反應發生在母體內并且干預了胎盤的發育，免疫反應復合物極易沉著于胎盤血管內壁，造成管壁損傷和 RSA 的發生[11]。此外研究發現母體凝血異常也與 ANA抗體密切相關， ANA 陽性影響血流動力學，導致胎盤血管內微血栓形成，嚴重的可導致胎盤梗死，胎兒發生缺氧窒息[12]。

此外，本研究采用 ANA 和 ANA譜兩種方法聯合檢測時，兩種方法的總體符合率都較高分別為79.40%和92.54%。聯合檢測的靈敏度為98.49%，特異度為99.61%;聯合檢測時，觀察組陽性率也顯著高于對照組，提示 ANA 和 ANA譜聯合檢測更有助于提高 RSA的臨床診斷能力。既往研究發現[13]，ANA 和 ANA譜聯合檢測時， ANA 的陽性檢出率可高達96.7%，且減少假陰性，選擇一個敏感度較高的檢測組合顯得得十分必要。 IIF 和 LIA是臨床上最常用的兩種檢測方法，其中IIF優勢在于檢測位置抗原和抗體，但是存在假陰性[14]，LIA 的優勢在于包被抗原是純化的抗原，不僅能提高檢測敏感性，還能保證測定抗原的準確性和特異性[15]，但目前許多自身抗體的確切抗原尚不明確，許多抗原不易被純化，故僅有少部分抗原有純化的產品能用于特異性檢測。另外，在本研究中發現， RSA 患者和普通孕產婦的 ANA 核型分布中以顆粒型和致密型的分布比例較高，但兩者間無顯著差異。本研究未發現 ANA 核型分布與 RSA 發病機制的關系，既往研究亦尚未給出明確結論，有待進一步研究。

綜上所述， RSA 的發生與 ANA 和 ANA譜陽性有密切聯系， ANA、ANA譜檢測陽性率有助于 RSA 臨床診斷;當兩種方法聯合檢測時，陽性率相對更高，為臨床提供更有效診斷依據，讓患者能得到準確診斷和及時治療。

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（收稿日期：2021-03-12）