從生物礦化到仿生礦化：構筑新功能生命體

周玥旻，王曉雨，唐睿康,

1浙江大學化學系，杭州 310027

2浙江大學求是高等研究院，杭州 310027

生物礦化作為自然界中普遍存在的現(xiàn)象，是指有機生命體調(diào)控無機礦物形成的過程。在生物礦化的過程中有機基質(zhì)如有機小分子、多肽、蛋白質(zhì)、核酸等作為礦物的成核位點，在生物環(huán)境中誘導晶體的定向生長和自組裝，進而產(chǎn)生具有多級有序結(jié)構的有機-無機復合結(jié)構。在生物體的調(diào)控作用下生物礦物通常具有優(yōu)異的理化特性，比人工合成材料具有更高的硬度、強度和韌性，能夠為生物體提供支撐保護、代謝調(diào)控等特殊的功能[1]。例如天然貝殼由95%的文石和5%的有機物質(zhì)組成，其強度和韌性比合成的碳酸鈣提高了約3000倍[2]；甲殼類昆蟲球鼠婦在周期性換殼過程中，降低甲殼中鎂離子和天冬氨酸的含量來減緩無定形相到結(jié)晶相的轉(zhuǎn)變過程，有效保證了新外殼的復雜結(jié)構[3]；哺乳動物的骨骼和牙本質(zhì)是由沿膠原纖維方向生長的羥基磷灰石晶體組成，其多級有序結(jié)構保證了自身的韌性和強度[4]。由此可見，在自然進化過程中，生物體根據(jù)自身特性和需求獲得了對礦物合成的精準調(diào)控能力，通過無機礦物與生物體巧妙的組裝產(chǎn)生更加優(yōu)越的性能[5]。

受到天然生物礦化的啟發(fā)，人們提出了仿生礦化的策略。有機基質(zhì)通過其表面活性官能團能夠降低晶體的成核能壘，促進無機礦物的異相成核過程[6]，故通過有機基質(zhì)能夠調(diào)控無機物結(jié)晶動力學過程，實現(xiàn)可控無機礦物的沉積。因此，仿生礦化的策略能夠用于模仿自然界中生物礦物的結(jié)構，通過合理設計能夠合成出結(jié)構可控、理化性質(zhì)優(yōu)異、生物相容性好的多級有序的復合材料，即實現(xiàn)結(jié)構仿生。例如：通過冷凍誘導組裝和乙酰化過程得到β-幾丁質(zhì)基質(zhì)，經(jīng)Ca(HCO3)2的分解對基質(zhì)進行礦化，再由絲素蛋白滲透和熱壓過程即可獲得與天然珍珠層的成分和結(jié)構高度相似的材料，具有良好的極限強度和斷裂韌性的仿生材料[7]；對于骨缺損[8]和牙釉質(zhì)[9]的修復，可通過在修復液中添加蛋白質(zhì)或多肽實現(xiàn)對羥基磷灰石(HAP)的成核、生長、取向過程的控制，實現(xiàn)晶體的原位再礦化，制備出具有優(yōu)異機械強度和摩擦性能的無機仿生修復層；I型膠原蛋白能夠組裝成三螺旋結(jié)構[10]，并誘導磷酸鈣在膠原纖維內(nèi)成核和礦化，實現(xiàn)晶體的定向生長和組裝，被廣泛用于軟骨和牙本質(zhì)的修復[11]。

在進化過程中，精密的生物礦化結(jié)構能使生物體獲得感光、趨磁、保護等特殊的功能。如趨磁細菌合成磁鐵礦晶體作為磁傳感器[12]；硅藻借助二氧化硅骨架來預防紫外線的輻射和掠食者的捕獲[13]。值得注意的是，處于極端環(huán)境中的生物通常具有特殊功能的生物礦化結(jié)構。例如沙漠地區(qū)的微生物通常產(chǎn)生二氧化硅礦化外殼來抵御高溫、輻射、干燥的影響[14]；火山口附近的多毛類蠕蟲體內(nèi)管道中通常具有較高含量的硫化鐵和二氧化硅，其在鈣化結(jié)構中有利于增強結(jié)構剛性和對環(huán)境的適應能力[15]。盡管生物礦化結(jié)構在不同生物體中表現(xiàn)出許多優(yōu)異的功能，但許多生物體并不具備自發(fā)生物礦化的能力。而通過仿生礦化的方法，將無機結(jié)構引入這類生物體中，經(jīng)材料與生物體的結(jié)構整合和功能調(diào)控可以產(chǎn)生“新功能生命體”，在保證生物體自身功能的同時，賦予其更多的新特性，即實現(xiàn)功能仿生。與結(jié)構仿生不同，功能仿生強調(diào)無機礦物的摻雜對生物體功能的改善。例如在雞蛋殼功能的啟發(fā)下，病毒經(jīng)可降解的磷酸鈣外殼修飾后能夠成為“特洛伊木馬”，既能逃避細胞外抗體的清除，還能通過非特異性的內(nèi)吞途徑進入細胞，在酸性條件下脫去外殼恢復感染能力，賦予病毒新的生物醫(yī)學應用潛力[16]。

綜上，本文通過闡述生物礦化基本原理和舉例說明自然界中生物礦化現(xiàn)象，強調(diào)了生物礦化的重要性，提出模擬生物礦化進行結(jié)構仿生和功能仿生的策略。在此基礎上詳細介紹了生物體和功能材料整合的方法，包括自發(fā)礦化、界面修飾礦化、胞內(nèi)礦化和基因工程礦化。隨后討論不同仿生策略下通過病毒、原核生物和真核生物與材料的整合實現(xiàn)的新功能，包括在環(huán)境保護、能源化工、生物催化和生物醫(yī)學等領域的應用。最后，總結(jié)仿生礦化領域進展，提出該研究領域的機遇與挑戰(zhàn)，對構筑“新功能生命體”的研究前景進行展望。

1 生物礦化

1.1 生物礦化和仿生礦化

早在35億年前，從原核生物到真核生物，生物體逐漸發(fā)展出合成礦物的能力，并通過體內(nèi)基因調(diào)控礦化“程序”的運行，實現(xiàn)對自身新陳代謝過程的調(diào)節(jié)，以適應環(huán)境和生物應力的變化[17]。

在生物體中，生物礦化是指生物利用細胞活動來指導礦物沉積的過程[18,19]。首先，細胞分泌產(chǎn)生礦化相關的有機基質(zhì)，如聚合物、蛋白質(zhì)、多糖、膠原等作為模板，為礦化提供成核位點；其次，通過調(diào)節(jié)環(huán)境中陰離子和陽離子的濃度，細胞能夠?qū)⒌V化所需的離子運輸?shù)匠练e位點，促進成核并生長出復雜的特異性產(chǎn)物。其中陽離子主要通過離子通道主動運輸，而陰離子則是通過由陽離子傳輸過程中產(chǎn)生的pH梯度驅(qū)動的被動擴散。受細胞調(diào)控形成的生物礦物相通常具有特殊的形貌、尺寸、結(jié)晶度和微量元素組成，其中有機組分不僅增強了復合材料的機械性能，還對礦化過程起著至關重要的控制作用，使材料顯示出有趣的特性和受控的分級結(jié)構，與人工合成的整塊無機材料完全不同。

此外，生物礦化結(jié)構能夠在細胞水平上對外部刺激做出反應，進行自我修復和結(jié)構的重塑。例如骨鈣素作為骨骼中最豐富的非膠原蛋白，可協(xié)調(diào)鈣礦物的沉積，當出現(xiàn)骨折情況時可招募破骨細胞和成骨細胞進行骨吸收和再沉積[20,21]。因此，深入研究生物礦化的過程對于了解生物硬組織的形成方式至關重要，為仿生制備類似結(jié)構的生物材料提供研究思路[22,23]。此外，生物礦化的研究還能夠解釋生理性和病理性礦化的相關疾病的病因，例如骨質(zhì)疏松[24]、牙釉質(zhì)修復[25]、心血管疾病[26]、白內(nèi)障[27]等。

近年來隨著生物礦化領域的不斷拓展，在生物礦化原理的指導下，研究者們通過模擬生物礦化過程，利用生物大分子的模板效應對無機成核-結(jié)晶過程中的反應動力學加以控制，可實現(xiàn)仿生材料的可控合成，構建出性能優(yōu)異的有機-無機復合材料。唐睿康課題組[28]在雞蛋殼結(jié)構和功能的啟發(fā)下，首次提出了基于細胞殼工程策略的生物-材料整合概念，在單個細胞表面引入磷酸鈣外殼，通過化學修飾實現(xiàn)了細胞的生物功能多樣化。如圖1所示，與經(jīng)典的仿生礦化策略不同，通過仿生礦化策略構筑新型生命體的研究將生物體作為一個整體而不是簡單的有機模板[29]，突出了利用材料的結(jié)構和理化特性來實現(xiàn)對生命體的結(jié)構、功能、行為調(diào)控的目的，是一種基于化學和材料手段的生物體進化新策略[30]。

圖1 材料與生物體整合構筑“新功能生命體”[29]

1.2 生物礦物及其功能

生物礦物具有特殊的形貌結(jié)構和組裝方式，可發(fā)揮出特定的功能，如骨架支撐[31]、重力傳感[32]、磁場傳感[33]等作用。早在寒武紀末期，來自不同種屬的生物體就進化出了60多種不同的礦物種類[17]，主要由鈣、鐵、鎂、錳、鋇等金屬離子和陰離子結(jié)合形成碳酸鹽、磷酸鹽、草酸鹽、硫酸鹽、氧化物、硫化物、硅化物等礦物。

作為生物體內(nèi)重要的第二信使，鈣離子在生物的功能和新陳代謝中起到重要作用，因此鈣鹽在生物礦物中占主要部分，并主要以碳酸鈣和磷酸鈣的形式存在[34]。

碳酸鈣晶體主要包括文石、方解石、球霰石、一水合碳酸鈣(CaCO3·H2O)、六水合碳酸鈣(CaCO3·6H2O)[35]等晶型，并對應著不同的礦物微結(jié)構。除了碳酸鈣晶體，無定形碳酸鈣(ACC)也在生物體內(nèi)以相對穩(wěn)定的形式存在于礦物早期形成過程。在發(fā)育早期的海膽骨刺針狀體中，碳酸鈣以ACC的形式大量儲存，隨著海膽的發(fā)育成熟，ACC逐漸轉(zhuǎn)化為方解石[36]。

磷酸鈣礦物在生物體內(nèi)主要以無定形磷酸鈣(ACP)、羥基磷灰石(HAP，Ca10(PO4)6(OH)2)、磷酸八鈣(OCP，Ca8H2(PO4)6)、磷酸三鈣(TCP，Ca3(PO4)2)、磷酸氫鈣(DCP，CaHPO4)和二水磷酸氫鈣(DCPD，CaHPO4·H2O)等形式存在，其中HAP和TCP是生物體骨骼和牙齒的主要成分，賦予了生物硬組織優(yōu)異的物理和機械特性[37]。有趣的是，無脊椎動物主要依賴于碳酸鈣礦物，而脊椎動物除去以碳酸鈣形成的內(nèi)耳耳石外，幾乎只使用磷酸鈣。

硅礦物主要存在于硅藻、植物和海綿中。硅藻是單細胞藻類，主要通過從環(huán)境中吸收可溶性硅酸在細胞壁上催化納米二氧化硅(SiO2)形成，不同種類的硅藻細胞壁具有從納米到微米尺度上的結(jié)構多樣性[38]。植物體內(nèi)的二氧化硅賦予了植物剛性結(jié)構，在防止其偏倒的同時通過磨損捕食者的牙釉質(zhì)起到對自身的保護作用；此外，刺蓮花科植物的莖葉是由二氧化硅組成的細空心刺狀毛狀體，能夠穿透皮膚并注射炎癥物質(zhì)，引發(fā)蕁麻疹[39]；海綿則是通過酶促聚合二氧化硅，產(chǎn)生大量硅質(zhì)針狀體，以保證其結(jié)構的穩(wěn)定性，抵制捕食者的侵襲[40]。

鐵礦物主要存在于軟體動物的牙齒、微生物和飛禽中，具有研磨或磁傳感器的功能。例如結(jié)核分枝桿菌通過合成形態(tài)和尺寸可控的磁小體來利用地磁場進行游動，科學家通過仿生手段合成了這種磁小體，發(fā)現(xiàn)其在水溶液中具有較好的分散性，是一種理想的生物材料，目前被廣泛應用于生物醫(yī)學領域[41]；帽貝牙齒主要由包裹在幾丁質(zhì)基質(zhì)中的針鐵礦(α-FeOOH)組成，作為有著不同取向的生物纖維納米復合材料，具有極高的機械承載功能[42]。

為了適應外界環(huán)境的變化，生物通過調(diào)控無機礦物的形成，來提高自身的生存能力和增強生物功能，例如：趨磁改造、支撐保護、磨損咀嚼等。同時也將無機物與生命體有效地結(jié)合在一起，構建出功能化的有機-無機復合材料，由此啟發(fā)科學家們進行仿生材料的制備，或通過人工整合策略構建出功能化的生命體。

2 材料-生物體的整合策略

盡管生物體能夠通過生物礦化發(fā)揮保護、支撐、導航等作用，許多生物體不能自發(fā)地形成礦化結(jié)構。因此，基于生物礦化的基本原理，可利用仿生礦化的策略人工誘導生物礦化，實現(xiàn)生物體-無機材料的結(jié)構整合。如可通過化學或化學生物學的方法對生物界面進行修飾，添加特異性礦化位點；也可在生物體內(nèi)植入功能性材料來調(diào)控礦物形成，并表現(xiàn)出優(yōu)異的特性；或通過基因工程增強生物體與礦物的親和力來實現(xiàn)仿生礦化[43]。

2.1 自發(fā)礦化

表面具有相對高密度的離子受體或電荷密度的生物體，可為無機材料提供成核位點。通過與帶相反電荷的材料或前驅(qū)體混合，如：金屬陽離子、正電性聚合物或納米顆粒等，可以直接在生物體表面誘導礦物層的形成，即自發(fā)成礦過程。根據(jù)生物體與礦物材料間不同的相互作用，自發(fā)礦化又可分為原位礦化和礦物自組裝兩個方面。

2.1.1 原位礦化

表面富含負電荷的生物大分子能夠通過靜電作用與帶正電的無機金屬離子相結(jié)合，當整個體系處于過飽和狀態(tài)時，礦物質(zhì)會在生物體表面自發(fā)形成，其中以富含羧基、羥基和氨基的生物大分子最為顯著。例如病毒表面富含帶負電荷的磷酸化絲氨酸、谷氨酸或天冬氨酸端基，能夠作為礦物成核位點，通過離子吸附-沉積的方式自發(fā)礦化[44,45]。但由于生理環(huán)境中的離子濃度普遍較低，同時生物體表面富集金屬離子的能力較弱，因此大多數(shù)生物體難以自發(fā)形成完整的礦化層。

在高濃度的離子環(huán)境下，生物體更易發(fā)生原位礦化。例如微堿性和富含鈣離子的禽腸道環(huán)境為禽流感病毒的礦化提供了有利的環(huán)境。為了驗證這一假設，研究人員將禽流感病毒與腸道模擬液混合，發(fā)現(xiàn)了病毒顆粒表面的原位礦化現(xiàn)象。如圖2(a)，流感病毒顆粒表面的羧基能夠富集鈣離子并誘導鈣礦物的沉積從而構建出礦化外殼。此外，作者還利用流感病毒礦化的現(xiàn)象解釋了禽流感病毒從禽類傳染給人類這一現(xiàn)象。由于人類上呼吸道細胞不含禽流感病毒的受體，在正常情況下很難被禽流感所感染，但在禽類腸道中發(fā)生自發(fā)礦化后的禽流感病毒，能夠不依賴受體進入細胞，并利用溶酶體完成脫殼建立有效的感染[46]。而通過原位自發(fā)生物礦化的方法可將表面帶負電荷的日本腦炎疫苗(JEV)包裹在磷酸鈣礦物殼中，如圖2(b)，有效避免了疫苗與水溶液接觸發(fā)生氫鍵交換，在保證生物學特性的前提下實現(xiàn)疫苗的常溫穩(wěn)定儲存[47]。如圖2(c，d)，對于M13噬菌體，利用噬菌體展示技術在其p8衣殼蛋白上展示谷氨酸三聚體后，PdCl(OH2)3+可以高效吸附在其表面，并進一步沿病毒外殼自發(fā)還原形成Pd多晶，利用生物還原反應而無需加熱和添加還原劑[48]。

圖2 (a)模擬禽流感病毒礦化過程[46]；(b)礦化后JEV的TEM圖像[47]；(c)以E3-M13病毒為模板形成Pd納米線的示意圖；(d)病毒表面羧基與Pd配合物通過靜電作用絡合，在沒有任何還原劑或表面穩(wěn)定劑的情況下，Pd沿著病毒外殼蛋白自發(fā)礦化[48]

2.1.2 礦物自組裝

分子或納米粒子通過非共價作用能夠自組裝形成連續(xù)有序結(jié)構，與原位礦化不同，自組裝過程強調(diào)組分間相互作用的自發(fā)性和可逆性，是在溫和條件下實現(xiàn)生物體修飾的重要策略。

研究表明由酸堿度誘導的肽-兩親物可用于自組裝形成礦物外殼，例如將氨基末端烷基化的肽與含磷酸絲氨酸基團的親水酯分子(PA)連接，在水中自組裝形成圓柱形纖維膠束，顯示出高度磷酸化的表面，為無機物的沉積提供成核位點，礦化后羥基磷灰石(HAP)的結(jié)晶c軸與纖維的長軸對齊，與骨中膠原纖維和HAP晶體之間觀察到的排列極其相似，可用于類骨納米纖維支架的制備[49]。同時親疏水作用也可用于制造可逆交聯(lián)的納米纖維，如圖3(a)，將親水性聚乙二醇(PEG)與疏水性磷脂酰絲氨酸(PS)連接可實現(xiàn)膠束的自組裝，再連接腫瘤靶向肽精氨酰甘氨酰天冬氨酸(RGD)，通過生物礦化的方法將耐藥抑制劑VER和化療藥物MIT包裹在殼和核中，根據(jù)磷酸鈣對pH的響應可實現(xiàn)藥物緩釋，用于耐藥肝細胞癌的治療[50]。

此外，近年來金屬-有機框架(MOFs)材料被廣泛用于生物體的改善，與致密礦物材料相比，MOF材料一般呈多孔的高表面積網(wǎng)絡結(jié)構，傾向于通過自組裝過程與生物體相連接[51-53]。如圖3(b)，簡單地將煙草花葉病毒(TMV)與2-甲基咪唑混合，再加入乙酸鋅溶液，由于鋅離子對蛋白質(zhì)的親和力導致局部濃度過高從而促進礦化過程的發(fā)生，形成生物納米顆粒。該自組裝過程可將TMV封裝在ZIF-8外殼(TMV@ZIF)內(nèi)，為病毒提供抵抗外界環(huán)境變化的能力，保持長期的生物活性[54]。如圖3(c)，受海膽啟發(fā)使用ZIF-8封裝的辣根過氧化物酶(HRP)即使放置在胰蛋白酶，甚至是沸水(100 °C)和沸騰的DMF(153 °C)溶液中均能保持生物活性，性能遠高于其他常用的保護涂層，如CaCO3和SiO2等[55]。

圖3 (a)殼-核多功能納米粒子VM-RGD-NPs的合成路線[50]；(b)TMV病毒的封裝示意圖[54]；(c)由海膽啟發(fā)的MOF生物復合材料示意圖[55]

通過離子吸附和自組裝過程進行生物礦化是最簡單和直接的雜交方式，可快速構建可控的新功能生命體。

2.2 界面修飾誘導礦化

由于大多數(shù)生物體表面存在的活性礦化位點較少，因此需要人為地引入礦化誘導層來加速仿生礦化過程的發(fā)生。層層自組裝(layer-by-layer，LBL)技術過程是通過交替沉積帶相反電荷或存在分子間相互作用的材料層進而形成具有可控厚度的化學涂層的技術。除了靜電相互作用，LBL涂層還可通過非共價作用力如氫鍵、范德華力和親疏水等作用與生物體連接[56,57]。

LBL技術于2008年首次被用于增強酵母細胞的礦化能力，如圖4(a)，在帶負電荷的細胞表層依次引入帶正電荷的聚二烯丙基二甲基氯化銨(PDADMAC)和帶負電荷的聚丙烯酸鈉(PAA)，通過交替沉積兩種電荷相反的聚電解質(zhì)，在酵母細胞表面制備了一層富含羧酸根基團的礦化誘導層，為磷酸鈣礦化提供了成核位點，從而在高鈣環(huán)境中形成磷酸鈣外殼，提高酵母細胞的儲存時間，同時實現(xiàn)酵母細胞的保護和輸送[28,58]。此外，也可借助納米涂層的堆積實現(xiàn)纖維的礦化，在骨修復和再生方面有巨大潛力，如圖4(b)，電紡纖維經(jīng)聚多巴胺修飾后，依次吸附陽離子I型膠原蛋白和陰離子硫酸軟骨素，可構建仿生界面誘導HAP的沉積，具有促進骨-植入物的粘合和骨誘導的作用[59]。

生物硅化也是另一重要的礦化過程，但由于細胞表面缺乏硅化相關的蛋白，如硅蛋白等。天然藍藻很難實現(xiàn)自發(fā)硅化，故光合作用的效率常受到環(huán)境的脅迫影響，如高光照、紫外線輻射和高溫，限制了它們在工業(yè)上的應用[60]。如圖4(c)，通過引入帶負電的聚苯乙烯磺酸鹽(PSS)來促進帶正電季胺基團的聚二烯丙基二甲基氯化銨(PDADMAC)的沉積，可在室溫下快速誘導原位硅化，減弱強光對其的抑制作用，使得藍藻在強光下的光合作用更加高效[61]。或在單細胞藍藻表面引入Au@L-半胱氨酸構成的納米生物界面和介孔二氧化硅層，穩(wěn)定的雙層外殼不僅能有效保護細胞免受酸堿度變化以及強紫外線輻射的影響，還能保證活細胞與外界環(huán)境之間的陽光運輸和質(zhì)量交換，從而創(chuàng)建出一種可重復使用、高活性的“光合生物反應器”[62]。

圖4 (a)在酵母細胞上構建人工CaP礦物殼[58]；(b)通過LBL過程制造具有生物功能的骨支架的示意圖[59]；(c)單個藍藻的二氧化硅封裝過程[61]

通過添加聚電解質(zhì)可以為不能自發(fā)成礦的生物體提供足夠的成核位點，為構建新功能生命體提供強有力的支持，但還需注意成殼穩(wěn)定性和生物毒性的問題，以預防其脫落并保證生物體的活性。

2.3 胞內(nèi)礦化

在通過與材料的整合來改造生物體的方法中，除了在生物體表面引入礦化外殼外，還可以在生物體內(nèi)部進行仿生礦化，構建一種特殊的“人工細胞器”或細胞內(nèi)支架，有助于調(diào)節(jié)細胞離子穩(wěn)態(tài)和發(fā)揮傳遞信號的作用，幫助生物體及時對外界刺激做出反應，賦予生物體新的功能[63,64]。

盡管生物體內(nèi)構建的功能材料展現(xiàn)出靈活、優(yōu)異的性能，但同時也存在著一定的空間約束。如圖5(b)，研究通過改變?nèi)芤旱膒H和金屬離子濃度來控制病毒衣殼上離子通道的打開和關閉，并使用NaBH4還原[PtCl4]-生成純Pt NPs或加入額外金屬離子(Co或Fe)后可合成Co-Pt、Fe-Pt合金納米團簇，與傳統(tǒng)方法相比，有效限制了納米粒子的聚集，也控制了合金的尺寸[67]。

圖5 (a)CaCO3納米顆粒的內(nèi)源性生成[65]；(b)限制納米團簇生長的病毒衣殼(左)及其截面圖(右)[67]

與形成礦化外殼的方法相比，生物體內(nèi)的改性對生物體的影響更大，效果更明顯，但也面臨著生存期短、合成路線復雜、具有潛在毒性等挑戰(zhàn)，需要科學家們進一步的研究和改進。

2.4 基因工程修飾誘導礦化

自然界中生物體的自發(fā)礦化能力受到生物礦化相關蛋白質(zhì)的調(diào)控[68]，因此，對于缺乏礦化蛋白的生物體來說，可以通過基因工程技術引入編碼生物礦化相關蛋白的基因，使生物體獲得具有遺傳效應的礦化能力，能夠自發(fā)利用該蛋白與材料相互作用。

將誘導礦化的肽段整合在表面能夠?qū)崿F(xiàn)生物體的界面礦化。例如研究人員在人類腸道病毒71型(EV71)顆粒表面的合適位點插入成礦肽磷酸鹽螯合劑(N6p)或鈣螯合劑(NWp和W6p)，如圖6(a，b)，從而使疫苗能夠通過自主地將磷酸鈣引入表面來獲得礦化外殼，提高疫苗的熱穩(wěn)定性，并保證疫苗免疫原性[69]。外殼蛋白氨基端被插入半胱氨酸的基因工程化煙草花葉病毒(TMV)，可促進各種金屬簇在其表面的沉積[70]。除了病毒，基因工程技術也被廣泛用于細菌[71]、酵母細胞[72]、硅藻[73]等其他多種生物。如圖6(c)，將衍生自DMP-1的兩個β結(jié)構形成肽和HAP成核肽分別編碼到M13噬菌體的表面，通過相鄰噬菌體β結(jié)構的驅(qū)動自組裝成束，再從HAP過飽和溶液中精確成核到工程化的噬菌體束內(nèi)，形成的HAP晶體具有c軸優(yōu)先取向，可實現(xiàn)類骨生物材料復合體的合成[74]。

圖6 (a)EV71基因組及VP1的β-(BC)環(huán)插入位點；(b)攜帶成核肽的工程化EV71礦化示意圖[69]；(c)工程化M13噬菌體構建生物納米纖維的過程[74]

細胞內(nèi)的生物礦化也可以通過基因工程的方法實現(xiàn)。例如在低鐵條件下，鐵響應轉(zhuǎn)錄激活因子Aft1會轉(zhuǎn)移到細胞核中調(diào)節(jié)鐵的攝取。因此細胞內(nèi)引入Aft1上調(diào)的鐵蛋白(Ft)突變體，可實現(xiàn)細胞內(nèi)鐵礦物的有效生成，構建出磁傳感器，用于多尺度細胞成像[75]。受驅(qū)磁細菌的啟發(fā)，有研究開發(fā)了一種結(jié)合鐵氧化和鐵螯合功能的新型基因構建體，通過在細菌內(nèi)構建結(jié)合深紅紅螺菌十聚鐵氧化酶與鐵結(jié)合肽M6A的融合蛋白，使細菌能夠在“超順磁性”大分子復合物中積累鐵，在磁場中被捕獲，用于體外和體內(nèi)的磁共振成像(MRI)成像[76]。

目前，多數(shù)生物體的蛋白序列和三維結(jié)構已被解析，因此基因工程策略可以被廣泛且有效地應用于生物體的改造，是一種新穎、目的性強的策略，但也同時面臨著操作復雜、可能引起基因突變等問題，有待人們進一步探索。

總的來說，借助仿生礦化來構建新功能生命體是一種行之有效且意義重大的策略，可根據(jù)不同的需求從形式多樣的構筑方法中選取合適的途徑來實現(xiàn)儲存、保護和支撐等作用，對于生物體功能的改進具有極大的推進作用，值得人們繼續(xù)深入研究和擴展其應用。

3 構筑新功能生命體

研究者們通過模仿生物體實現(xiàn)仿生礦化的策略，在細胞表面或內(nèi)部引入材料以構筑新功能生命體，在保證生物體自身正常生命活動的同時賦予其特殊的性質(zhì)，被應用于環(huán)境控制、能源生產(chǎn)、生物催化、醫(yī)學治療等多個領域，具有非常廣闊的前景。

3.1 細胞殼化

3.1.1 剛性外殼

細胞表面殼工程化的策略是一種可控、簡單且快捷的細胞修飾方法，常被用作保護生物體免受外界環(huán)境的傷害。由于功能外殼對生物體的內(nèi)環(huán)境和新陳代謝過程影響較小，是目前細胞工程領域中應用最為廣泛的材料-生物體整合方法。金屬配合物、無機礦物材料和高分子聚合物常被用于制造生物體的剛性外殼，如MOF、CaP、SiO2以及天然或人工合成的聚合物等，具有御防外界的脅迫、疾病治療、環(huán)境保護、生物催化和導電傳感[77]等作用。

通過仿生礦化能在細胞外部引入“鎧甲”用于細胞的保護。酵母細胞壁主要由帶負電的多糖組成，難以引起二氧化硅的自發(fā)礦化和沉積，通過LBL技術用帶正電的PDADMAC和具有良好生物相容性的帶負電荷聚苯乙烯磺酸鹽(PSS)包被酵母細胞，在近生理條件下，通過靜電相互作用吸附溶液中帶負電荷的二氧化硅納米粒子，可形成連續(xù)的均勻二氧化硅層，賦予細胞高溫防御能力，同時也不會損害細胞活力[78]。此外，依賴于二氧化硅良好的水合作用能力，能為病毒提供一個封閉的無水納米環(huán)境，有效避免化學反應的發(fā)生，如圖7(a)，研究在EV71病毒表面引入二氧化硅層，可顯著改善疫苗的熱穩(wěn)定性，室溫下儲存35天后仍可保持90%的效果[79]。近來也有研究通過液-液相分離從帶相反電荷的聚電解質(zhì)混合物中構筑凝聚層微滴外殼用于保護酵母免受氧化損傷[80]。

圖7 (a)熱穩(wěn)定病毒的仿生方法[79]；(b)鼻腔疫苗設計原理[85]；(c)由生物礦化誘導的可光合產(chǎn)氫綠藻聚集體；(d)聚集的小球藻的空間功能分化[87]

礦化外殼還可用于新型生物催化劑的開發(fā)。生物催化劑如酶、微生物細胞等具有高催化效率和反應速度，被廣泛應用于精細化學品、藥物和燃料的制備和加工等領域[81]，但其容易受到高溫、有機溶劑和環(huán)境pH變化的影響而失活。因此將糞產(chǎn)堿菌與多孔磷酸鈣(CaP)礦物殼和Fe3O4納米粒子結(jié)合，CaP外殼可保護生物催化免受有機溶劑脅迫，F(xiàn)e3O4納米顆粒提供磁分離和回收的功能，礦化的細菌則作為循環(huán)的皮克林(Pickering)界面生物催化劑。無機-細菌復合結(jié)構顯著提高了生物催化劑的催化效率和重復使用性[82]。近年來納米酶也因其高催化效率、強穩(wěn)定性和易于制備等優(yōu)點引起了人們的興趣[83]，其中具有多種酶活性的二氧化錳(MnO2)納米酶包裹的酵母細胞能夠用于增強細胞對環(huán)境(包括脫水、裂解酶、紫外輻射等)的耐受性，保證細胞在儲存兩周后仍保持其高活性。并在去除外殼后，迅速恢復正常的生長和功能，體現(xiàn)了生物體-材料復合體的多酶活性[84]。

礦化外殼在醫(yī)學領域也有著廣泛的應用，如黏膜免疫、抗體的有效釋放等。基于磷酸鈣材料在細胞和組織上的強大粘附能力，如圖7(b)，用CaP納米殼包裹病毒，可增強與鼻粘膜組織的粘附作用，有利于不依賴受體的攝取和鼻腔內(nèi)局部IgA反應的升高，從而引發(fā)增強性的全身抗體反應[85]。單克隆抗體(mAb)只能識別和中和細胞外蛋白而無法進入細胞，通過將抗體原位CaP礦化，經(jīng)過胞吞作用可以有效地輸送到受感染的細胞中釋放抗體，抑制病毒復制[86]。

此外，材料外殼的構建也常被用于解決能源與環(huán)境問題。綠藻體內(nèi)的氫酶會在缺氧環(huán)境下被激活進行光合作用產(chǎn)生氫氣，如圖7(c，d)，使用二氧化硅去包裹綠藻，多個綠藻會逐漸粘合形成綠藻復合體，外層的綠藻進行正常的光合作用產(chǎn)生氧氣的同時，隔絕內(nèi)部綠藻和外界的接觸，內(nèi)部的綠藻通過光合產(chǎn)氧和呼吸作用的耗氧平衡，制造出一個既能維持綠藻細胞光合活性又能夠激活氫酶的無氧條件，從而實現(xiàn)光合產(chǎn)氫，效率等同于正常的光合作用，可在沒有破壞綠藻正常生命過程的前提下實現(xiàn)持續(xù)產(chǎn)氫，工藝上更具操作性與便捷性，為化學手段改造光合生物提出了全新的思路[87]。

環(huán)境中大量繁殖的藍藻會消耗水中氧氣并釋放藍藻毒素，導致水生生物的大量死亡，對水資源和生態(tài)系統(tǒng)構成重大威脅，研究發(fā)現(xiàn)二氧化硅納米粒子可以在PDADMAC聚合物的存在下自發(fā)地結(jié)合到藍藻上，得到的藍藻-SiO2復合物可以在水中保持沉積狀態(tài)，顯著抑制藍藻的光合生長，減少水華事件的發(fā)生，是一種有效的環(huán)境控制策略[88]。

3.1.2 柔性外殼

與“硬”保護不同，細胞外“軟”保護主要采用柔韌的高分子材料和生物大分子，具有一定的流動性，可以更好地保證生命體的基本功能和生物活性，最大限度地減少構建新功能生命體過程中對生物體的損害。

利用仿生手段可在紅細胞表面構建柔性外殼。俗稱“熊貓血”的Rh陰性血是稀有血型，因此將RhD陽性血液轉(zhuǎn)化為RhD陰性血液具有極大的臨床應用價值。有研究表明通過酶去除紅細胞(RBC)抗原可成功地將A型或B型紅細胞轉(zhuǎn)化為O型紅細胞[89]，但這一過程與Rh抗原的免疫原表位無關，且Rh相關多肽的缺失會導致整個紅細胞膜的裂解，對核酸酶血型的決定基因進行編輯也有可能會引起突變，引發(fā)未知的風險[90]。為解決該問題，如圖8(a)，研究構建了一種唾液酸與鹽酸酪胺交聯(lián)的柔軟凝膠網(wǎng)絡結(jié)構，能保證紅細胞良好的變形性，使其能在動物體內(nèi)各個部位進行氣體及能量運輸，并基于其優(yōu)越的生物親和性和對細胞膜表面抗原的掩蔽作用，實現(xiàn)了“通用熊貓血”的人工構建和安全輸血，展示了良好的臨床轉(zhuǎn)化前景[91]。

圖8 (a)“通用熊貓血”的人工構建[91]；(b)可用于細胞打印的水凝膠設計[92]

同時，可塑的生物活性水凝膠作為柔性外殼在組織工程領域也有廣泛研究，例如3D細胞培養(yǎng)和組織再生的平臺。如圖8(b)，一種交聯(lián)的、可生物降解的聚己內(nèi)酯-聚乙二醇-聚己內(nèi)酯(PCL-PEG-PCL)三嵌段聚合物水凝膠，兼具高彈性和高韌性，可以自由進行拉伸、壓縮和扭曲過程而不會出現(xiàn)明顯的斷裂，用于細胞打印可實現(xiàn)細胞在材料中至少7天的培養(yǎng)[92]。而用含有Arg-Gly-Asp序列的細胞粘附肽修飾的微尺度海藻酸鹽凝膠和未經(jīng)修飾的凝膠組成雙峰水凝膠，經(jīng)單軸冷凍干燥引入各向異性排列的微通道，可以驅(qū)動骨髓基質(zhì)細胞在經(jīng)過修飾的凝膠微通道中粘附，并分化成神經(jīng)元和神經(jīng)膠質(zhì)細胞，實現(xiàn)對細胞粘附空間位置上的可控性[93]。

3.1.3 病理性外殼

除了生物體內(nèi)正常形成骨骼、牙齒等硬組織的礦化過程，也同時存在著異常的礦化現(xiàn)象，會形成如同結(jié)石、齲齒等對生物體有危害的物質(zhì)。通過對異常生物礦物的特征和形成機理的深入研究，并借鑒新功能生命體的構建方法，可將其轉(zhuǎn)化為對人類有益的方式，達到預防和治療疾病的效果。

通過誘導病理鈣化可實現(xiàn)腫瘤治療。基于癌細胞中的葉酸受體(FR)上調(diào)的現(xiàn)象，研究提出了一種癌細胞靶向鈣化(Cancer-Cell-Targeting Calcification,CCTC)的無藥物癌癥治療方法，如圖9(a)，由于葉酸(FA)的羧酸基團可以與生物液中的Ca2+特異性結(jié)合，從而促進鈣礦物質(zhì)的成核，誘導選擇性吸附FA分子的癌細胞鈣化死亡，與傳統(tǒng)的化學療法相比，CCTC治療可以有效抑制腫瘤的生長并限制其轉(zhuǎn)移，而不會損害正常細胞，從而大幅度地提高治療的存活率[94]。除了對生物體進行界面修飾，還可增強磷酸鈣粒子與癌細胞的粘附程度。通過向磷酸鈣添加陰離子羧甲基纖維素(CMC)聚合物和光敏卟啉染料，再附著一層陽離子聚乙烯亞胺(PEI)來反轉(zhuǎn)這些顆粒的電性，可大大增強癌細胞對磷酸鈣的吸收率，具有很好的治療效果[95]。

病理性鈣化還可用于腫瘤診療一體化。例如基于Ca2+獨特的細胞毒性機制，如圖9(b)，由pH敏感的透明質(zhì)酸鈉修飾的過氧化鈣納米顆粒，在酸性腫瘤微環(huán)境中可緩慢分解為游離的Ca2+和H2O2，從而改變鈣離子通道，阻礙鈣離子信號的準確傳遞，導致癌細胞死亡，同時在Ca2+富集的過程中，有利于產(chǎn)生腫瘤鈣化的傾向，抑制腫瘤在體內(nèi)的生長，也可以通過CT成像應用于治療效果的監(jiān)測；相反，由于正常細胞有足夠的過氧化氫酶使外源性Ca2+可通過鈣通道泵出或儲存，具有一定的耐受性，因而該項研究在臨床癌癥治療中顯示出巨大的潛力[96]。

圖9 (a)癌細胞靶向鈣化的無藥物治療原理[95]；(b)pH響應性過氧化鈣納米粒子的設計[96]

3.2 胞內(nèi)仿生細胞器

仿生細胞器常被用于生物醫(yī)學領域。例如在癌癥治療手段中，化療藥物并不能區(qū)分健康和病變細胞，因此研究構建了一種用以捕獲和釋放化療藥物的仿生細胞器，如圖10(a)，通過巰基修飾將富含GC堿基雙鏈寡聚核苷酸(ODN)組裝到金納米籠中，由于化療藥物如阿霉素(DOX)進入細胞核會優(yōu)先插入富含GC堿基的核酸序列，因此材料具有良好的藥物捕獲性，當細胞內(nèi)Au-ODN濃度高于臨界保護濃度時，能有效捕獲進入肝細胞內(nèi)的DOX，保護肝臟免受損傷；當腫瘤組織細胞內(nèi)的Au-ODN低于臨界保護濃度時，該材料對進入腫瘤內(nèi)的DOX捕獲作用微弱，對藥物的抗腫瘤作用基本沒有影響。此外，金納米籠材料具有良好的近紅外光(NIR)熱效應，對腫瘤進行近紅外照射時，可使腫瘤細胞內(nèi)被Au-ODN捕獲的DOX再次釋放，繼續(xù)發(fā)揮抗癌作用，進一步消除瘤內(nèi)Au-ODN對DOX的抗腫瘤作用的潛在影響，實現(xiàn)了在癌癥化療中既保證藥物抗癌效果又保護肝臟免受藥物損傷[97]。同時，還可利用胞內(nèi)仿生細胞器來靶向遞送藥物。如圖10(b)，表面葉酸(FA)功能化的胞內(nèi)礦化酵母細胞nHAP@yeasts-FA不僅保留了細胞原有的性質(zhì)和功能，還有極大的藥物負載能力，可以作為載體靶向腫瘤，進行藥物的有效遞送和釋放，基于腫瘤的FA依賴性和羥基磷灰石(HAP)納米粒子的pH敏感性來實現(xiàn)雙重響應釋放的效果，能顯著抑制腫瘤生長，同時顯示出低毒性，為納米礦物質(zhì)提供了一種生物友好的胞內(nèi)合成和應用策略[66]。如圖10(c)，胰島素在礦化CaP相內(nèi)濃縮和復合產(chǎn)生CaP-胰島素納米顆粒(BINP)，可促進胰島素的大規(guī)模細胞攝取，經(jīng)過溶酶體逃逸機制到細胞質(zhì)中有效釋放，模擬了細胞內(nèi)改善糖代謝的機制，保護胰島素免受生物降解，對胰島素抵抗可產(chǎn)生長期的治療作用[98]。或?qū)e0納米顆粒錨定在腫瘤靶向紅細胞膜包覆的葡萄糖氧化酶內(nèi)腔中，形成鐵礦化葡萄糖氧化酶(GOx-Fe0@EM-A)，在腫瘤部位進行近紅外光照射后，紅細胞膜破裂，通過光熱效應實現(xiàn)超小納米GOx-Fe0的光驅(qū)動釋放和腫瘤深度滲透，實現(xiàn)腫瘤的有效根除[99]。

此外，植入性生物燃料電池也引起了研究者的關注。以紅細胞為原料，通過嵌入超小羥基磷灰石(HAP、Ca10(PO4)6(OH)2)來制備生物燃料電池的正極材料，具有高電催化活性、穩(wěn)定性和選擇性，并在保持細胞的原始生物學特性的同時，通過HAP的-OH基團與血紅蛋白的相互作用增強了催化氧還原反應，實現(xiàn)了電子的直接傳輸，而無需轉(zhuǎn)移介質(zhì)[100]，展現(xiàn)了納米材料可以作為人工細胞器實現(xiàn)超級細胞的構建，為材料和生物的功能化裝配提供了新概念和新思路。

胞內(nèi)細胞器還可用來開發(fā)能源生產(chǎn)。例如研究以金納米團簇(AuNCs)的形式引入了一種細胞內(nèi)的、生物相容性好的光吸收劑，以規(guī)避現(xiàn)有光合生物混合系統(tǒng)電子轉(zhuǎn)移緩慢的動力學問題，將AuNCs轉(zhuǎn)移到非光合細菌中，使得CO2光合作用產(chǎn)生乙酸成為可能，同時AuNCs還可以作為活性氧(ROS)的抑制劑來維持細菌的活力，有效地收集陽光并將光生電子轉(zhuǎn)移到細胞代謝中，實現(xiàn)CO2的持續(xù)固定[101]。

3.3 其他特殊作用的仿生礦化策略

除了材料與生物體結(jié)合構建仿生外殼或人工細胞器以外，還可設計出具有特殊作用的無機-生物復合材料，應用于工業(yè)生產(chǎn)和環(huán)境保護等領域。

固廢煤矸石(CG)常與水泥混合作為地下回填材料，在中國各地的煤礦中得到廣泛應用。但由于水泥的存在，這種材料在其生產(chǎn)、制備和運輸過程中往往對環(huán)境會造成嚴重污染。而微生物誘導碳酸鹽沉淀技術作為一種無水泥環(huán)保技術，常被用于生產(chǎn)生物礦化材料，固結(jié)松散顆粒，同時微生物生長環(huán)境也與地下溫度相適應。因此如圖11(b)，研究模擬自然礦化作用，利用巴斯德氏芽胞桿菌來產(chǎn)生具有一定晶型和結(jié)合作用的碳酸鈣(CaCO3)晶體沉淀來以填充孔隙，將固體廢棄物煤矸石顆粒結(jié)合成一個具有高生物礦物質(zhì)含量的整體，達到很好固化廢料顆粒的目的，與水泥混合地下回填材料相比，對環(huán)境更加友好[103]。

圖11 (a)海洋細菌通過協(xié)同生物礦化抑制鋼鐵腐蝕[102]；(b)礦化固廢煤矸石作為環(huán)保地下充填材料[103]

4 結(jié)語

通過師法自然，仿生礦化研究領域?qū)崿F(xiàn)了從生物體系對材料結(jié)晶的調(diào)控到利用材料改進生物體性能的擴展，并已經(jīng)取得了快速的進展，為生物和材料的可持續(xù)發(fā)展提供了新的方向，但是該領域仍然存在一些改進空間和挑戰(zhàn)。

首先，目前利用材料改性的生命體大多是病毒，酵母細胞和動物細胞，還有很大部分微生物和植物尚未被挖掘利用[104]，由于生物體具有選擇與特定材料結(jié)合的能力，表現(xiàn)出感知并適應外界環(huán)境的能力，因此，研究者可以從目的出發(fā)，快速找到適合生物體的材料，從而構建出更加智能的新功能生命體。

其次，生物體內(nèi)的材料通常是在溫和的條件下合成的，能耗相對較低，因此利用生物自身的生理環(huán)境進行材料的合成和整合也是未來的研究趨勢之一[105]，而在人工構筑新功能生命體的過程中，為減少對生物體損害，保證生物活性，整合條件包括溫度、壓力、離子濃度、pH、毒性、反應時間、生物降解性、協(xié)調(diào)性等都應被納入考慮范圍之內(nèi)[29]，避免高溫高壓等合成條件。

此外，為了更好地控制礦物生成的成核、生長、相變和粒子組裝過程，還可在礦化過程中引入一些分子添加劑或穩(wěn)定劑[106]。例如，用小分子三乙胺(TEA)穩(wěn)定磷酸鈣離子團簇，將其揮發(fā)可誘導離子團簇聚集融合成一個結(jié)構連續(xù)的整體，在牙釉質(zhì)表面構建一個由結(jié)晶體到無定型前驅(qū)體的連續(xù)界面，隨后通過氟離子的誘導實現(xiàn)晶體的外延生長[107]；添加富含羧酸的聚丙烯酸(PAA)作為一種很好的調(diào)節(jié)劑來穩(wěn)定磷酸鈣液體前驅(qū)體(PILP)，其良好的骨誘導性允許滲透入膠原纖維中進行纖維內(nèi)礦化[108]，或用于合成尺寸分布均勻的納米磷酸鈣[109]。

總而言之，通過材料改性生物在細胞保護、疫苗儲存、信號屏蔽、活性增強等領域均取得了較為重大的成果，證明了仿生礦化策略的可行性和有效性，也進一步模糊了生物和非生物的界限，相信隨著未來生物學和材料學的發(fā)展，新功能生命體的應用將越來越廣泛。