無機納米材料在骨代謝調控中的應用

王秋祥，劉奕辛，葛昆，張金超，周國強1,,＊

1河北大學基礎醫學院，河北 保定 071000

2河北大學化學與環境科學學院，河北 保定 071002

骨作為一種分層結構的復合材料，在脊椎動物中發揮著重要的結構和生理功能。骨骼為關節、肌腱和韌帶提供機械支撐，保護重要器官免受損傷，并作為鈣和磷酸鹽的儲備庫發揮著重要的代謝作用[1]。由于事故、疾病和衰老等原因，骨骼很容易受到損害。受損的骨組織具有自我修復和再生的潛力，但這種能力是有限的，如嚴重骨折、關節痛、骨質疏松、腫瘤、感染等高沖擊創傷或臨界尺寸的骨缺損超出了自我愈合能力，需要手術干預和使用人工骨填充劑來進行治療[2,3]。目前，骨修復的臨床治療方法包括自體移植、異體移植和異種移植，這三種方法都具有各自的局限性，自體移植來源受限，手術時間長且容易患創傷并發癥；異體移植面臨免疫排斥，感染的風險；異種移植存在吸收率低，塑性差的缺點[4,5]。隨著納米科學、材料學、細胞生物學、組織工程與再生醫學的發展和進步，納米材料和仿生材料已經成為骨修復材料的主要發展趨勢。近年來，用于骨組織修復的主要有無機材料、高分子聚合物、納米仿生骨等。其中，無機納米材料因其具有易加工、良好的力學性能、在體內能保持穩定數周等優點使其具有廣闊的應用前景。納米羥基磷灰石、稀土納米顆粒、金納米顆粒和碳納米管是目前在骨代謝調控領域研究較多的幾種無機納米材料，這幾種材料可以通過可控的力學性能、孔徑、孔隙度和良好的生物相容性來模擬天然骨中的羥基磷灰石結構，制備出與天然骨成分、結構和性能類似的新型骨修復材料[6-9]。文章詳細介紹了納米羥基磷灰石、稀土納米顆粒、金納米顆粒和碳納米管的性質及對骨代謝的調控機制，為無機納米材料在骨組織工程的應用研究提供了理論基礎。

1 納米羥基磷灰石在骨代謝中的應用

納米羥基磷灰石，簡稱nHAP，分子結構為Ca10(PO4)6(OH)2，天然的納米羥基磷灰石為六方晶體結構，其中Ca:P的化學計量比通常為1.67。nHAP因其組成與體內骨礦物物質相似，生物相容性好，無毒副作用被廣泛應用于骨修復，參與成骨作用和骨微環境的調控[6,10]。

1.1 骨細胞調控

骨發育是通過多種事件同步作用形成機體支架，骨及周圍微環境的修復潛力貫穿整個成年期，可以維持骨代謝穩態。羥基磷灰石可以通過調控間充質干細胞、成骨細胞和破骨細胞等的分化來調控骨微環境。間充質干細胞是一種多功能的分化細胞，間充質干細胞向成骨方向分化的同時會降低成脂分化的比例。可以通過加入地塞米松、磷酸甘油和維生素C或骨形成蛋白的方法來誘導間充質干細胞向成骨細胞分化。間充質干細胞的成骨分化表現為堿性磷酸酶(ALP)的表達、細胞內礦質沉積和COL1、OCN、OPN等基因的表達。Remya等[11]將納米羥基磷灰石與骨髓間充質干細胞共培養，發現當顆粒濃度為20 μg·mL-1時，nHAP顆粒能顯著促進細胞的增殖，但高濃度的nHAP會導致細胞形態變得不規則。納米羥基磷灰石的長徑比越大對骨髓間充質干細胞的增殖及分化能力促進作用越強，長徑比較小的nHAP對細胞的增殖、分化及礦化能力的抑制作用較強[12]。

成骨細胞由間充質干細胞分化而來，可促進骨形成，成骨分化的標志物為ALP，ALP含量越高，促進骨形成作用越明顯。破骨細胞可促進骨吸收，破骨分化標志物為抗酒石酸酸性磷酸酶(TRAP)和組織蛋白酶(CTSK)，TRAP和CTSK的含量越高，骨基質的吸收能力越強，保持成骨細胞和破骨細胞含量的相對穩定是維持骨代謝穩態的關鍵。骨缺損時成骨細胞相對含量降低，破骨細胞含量相對升高。納米羥基磷灰石可顯著提高成骨細胞的增殖、黏附、分化和礦化能力。研究表明20 nm的羥基磷灰石骨修復效果最好，最適濃度為20 μg·mL-1，濃度高于20 μg·mL-1后納米羥基磷灰石開始抑制成骨細胞增殖并引起細胞凋亡[13,14]。表面光滑的羥基磷灰石比粗糙的羥基磷灰石更有利于促進成骨細胞的增殖，與天然羥基磷灰石鈣磷比接近的仿生磷灰石，更易誘導成骨細胞的增殖、黏附和分化[15,16]。溫波等[17]將破骨細胞與納米羥基磷灰石和微米羥基磷灰石共培養檢測骨陷窩形成的數量及TRAP的含量，結果發現納米級的材料骨吸收能力更強，與對照組相比骨陷窩的數量和TRAP的含量顯著降低。

骨微環境的調控除調控成骨細胞和破骨細胞的平衡之外還需要調控內皮細胞、雪旺細胞、炎性因子和生長因子之間的相互作用。內皮細胞參與血管形成，為骨修復提供代謝所需營養素、可再生自體細胞和各種生長因子等物質，理想的骨替代物應具有調控內皮細胞的功能。Shi等[18]以人臍帶血內皮細胞為模型探討了羥基磷灰石納米顆粒對內皮細胞功能的影響和潛在機制，結果發現羥基磷灰石納米顆粒以劑量依賴性的方式顯著抑制了內皮細胞的遷移能力和血管生成能力。雪旺細胞是神經系統中的神經膠質細胞，可分泌神經營養因子，促進受損神經元及其軸突的再生，參與周圍神經系統纖維的形成。孟帥岑[19]發現含有羥基磷灰石涂層的鈦骨表面能夠顯著促進雪旺細胞的增殖和粘附。此外骨微環境的調控涉及表觀遺傳的調控，如組蛋白乙酰化和染色質重塑的改變，體內分泌的生長因子和各種炎性因子可以參與骨代謝的調控并刺激細胞釋放相關基因[20]。

1.2 骨礦物相影響

圖1 nHA通過cAMP/PKA信號通路促進BMSCs成骨分化的示意圖[21]

骨肉瘤是一種多發于青少年的常見惡性腫瘤，患者臨床表現包括間歇性疼痛、跛行、體重下降、器官衰竭等癥狀。羥基磷灰石可促進鈣化，提升堿性磷酸酶等蛋白的水平，有效促進骨愈合，治療骨肉瘤所引起的溶骨性疾病等并發癥。Zhu等[24]發現植入羥基磷灰石的動物相比不添加任何材料的動物，傷口明顯縮小，能夠形成新的骨基質，骨修復能力顯著增強。Lambert等[25]將三種形貌的羥基磷灰石植入家兔鼻竇提升模型，植入1、5和12周后采用非脫鈣切片進行組織學和組織形態測量，發現三種不同形貌的羥基磷灰石均會刺激骨再生，但天然羥基磷灰石較人工合成的羥基磷灰石有更好的骨-材料接觸面，具有更好的成骨效果。Wang等[26]構建矢狀縫模型評估羥基磷灰石對矢狀縫線的縫間隙面積、骨體積分數和骨密度機械性能及矢狀縫骨形成的影響。結果發現體外濃度為25 μg·mL-1羥基磷灰石在誘導成骨細胞相關基因和蛋白表達明顯高于其他組，縫線間隙面積減小，矢狀縫線的骨體積分數、骨密度、硬度和彈性模量顯著增加。

2 稀土納米顆粒在骨代謝中的應用

稀土元素主要由鑭系元素和釔、鈧組成，離子半徑與鈣離子的半徑相似，與鈣有較強競爭配位作用，更易結合電子形成比鈣穩定的化合物，可調控生命體內鈣磷代謝以及鋅的含量，常被應用于調控骨代謝。稀土納米顆粒具有較好的促進組織再生能力，可以通過調控成骨細胞、破骨細胞以及間充質干細胞的分化和礦化來實現骨組織再生。

2.1 骨細胞調控

2.2 骨礦物相影響

骨質疏松是一種代謝性疾病，多發于老年人和絕經期婦女，其特點是骨質變脆，骨密度降低。骨質疏松癥患者會出現過度生成破骨細胞和成骨受損的癥狀。本課題組通過多種給藥方式評價了納米氧化釓(Gd2O3)的急性及慢性毒性。結果發現腹腔注射Gd2O3顆粒時，低劑量無明顯毒性，高劑量有一定的肝、腎及心肌的損傷。滴鼻時，高劑量引起了海馬損傷，導致大鼠學習記憶功能的減退，而灌胃無任何毒性反應。灌胃時，Gd2O3顆粒引起小鼠骨密度增大，最大載荷增大，骨小梁變粗，骨沉積線明顯，類骨質豐富。并能夠促進成骨細胞增殖和礦化結節的形成，促進成骨相關基因BMP-2，Runx-2和OCN的表達[31-33]。Chu等[34]構建卵巢切除的大鼠骨髓基質細胞和骨髓源的巨噬細胞模型，研究了鑭取代層狀氫氧化物納米支架(La-LDH)的成骨和抗破骨細胞活性。結果發現支架中的La3+通過激活Wnt/β-catenin途徑促進大鼠骨髓基質細胞的增殖和成骨分化，從而導致ALP、Runx-2、COL-1和OCN基因的高表達。此外，La-LDH支架通過抑制NF-κB信號通路抑制破骨細胞的生成。與不摻雜La3+的支架相比，La-LDH支架提供了更有利誘導新骨生長的微環境。

3 金納米顆粒在骨代謝中的應用

3.1 骨細胞調控

金屬納米粒子(AuNPs)因易于控制的納米級尺寸、容易制備、高比表面積、易于功能化、優異的生物相容性等特點在骨組織工程與再生醫學領域引起了廣泛關注[8]。金納米顆粒的尺寸一般在1-100 nm之間，粒徑不同呈現的顏色也不同。它對骨相關細胞如成骨細胞、破骨細胞、間充質干細胞等具有重要的調節作用。本課題組[35]研究表明不同粒徑的金納米顆粒均能促進MC3T3-E1細胞的增殖、分化和礦化功能，呈現出了時間和劑量依賴關系。但20 nm的AuNPs對MC3T3-E1細胞的增殖分化的影響要高于40 nm的AuNPs。Li等[36]合成了牛血清白蛋白包覆的Au納米球、Au納米星和Au納米棒，尺寸分別為40、70和110 nm，并研究了它們對人間充質干細胞成骨分化的影響。發現AuNPs的大小和形狀會影響人間充質干細胞的成骨分化，球體-40、球體-70和棒狀體-70顯著提高細胞堿性磷酸酶活性和鈣沉積，而棒狀體-40降低堿性磷酸酶活性和鈣沉積。AuNPs的大小和形狀是通過調節Yes相關蛋白(YAP)的激活來影響骨髓間充質干細胞的成骨分化。另一項研究發現，不同大小Au NPs均促進人脂肪干細胞向成骨細胞分化，其中30 nm和50 nm的AuNPs表現出最高的成骨分化率[37]。AuNPs除對成骨細胞、破骨細胞、間充質干細胞有一定的影響外，對人牙周膜祖細胞有一定的影響。Zhang等[38]評估了不同粒徑的AuNP對人牙周膜祖細胞成骨分化的影響，發現5 nm AuNPs降低堿性磷酸酶活性、礦化結節形成和成骨基因表達，而13 nm和45 nm AuNPs促進這些成骨標記物的表達進而促進成骨分化。AuNPs可以抑制核因子受體激活因子-κB配體(RANKL)誘導骨髓來源巨噬細胞形成破骨細胞，同時減少RANKL響應產生的活性氧，并上調了RANKL誘導的谷胱甘肽過氧化物酶-1的表達，表明對破骨細胞形成的抑制作用可能是由于提高了對氧化應激的防御[39]。

3.2 骨礦物相影響

本課題組[40]發現AuNPs可以顯著促進成骨細胞的增殖，成骨相關基因BMP-2、Runx-2、OCN和Col-1的表達會隨著ALP活性、骨結節和鈣含量的增加而增強，其機制與激活ERK/mapk通路有關。AuNPs濃度越高，促進骨髓間充質干細胞成骨分化的能力越強。隨著ALP活性和細胞外基質礦化的增加，AuNPs促進骨髓間充質干細胞向成骨細胞方向分化而非向脂肪細胞方向分化。AuNPs促使Runx2、BMP-2、OCN、ALP等成骨分化相關基因表達上調，促使PPARγ2、E/CBPα、E/CBPβ、E/CBP成脂分化相關基因表達下調，其分子機制與激活p38 MAPK信號通路有關(圖2)。Bai等[41]建立脂多糖誘導的骨侵蝕小鼠模型研究了AuNPs對骨吸收的治療作用，發現AuNPs通過調節破骨細胞酸分泌來抑制過度的骨吸收，其中血清中I型膠原交聯羧基端肽下降，抗酒石酸酸性磷酸酶和組織蛋白酶K下降至正常水平，從而顯著減少骨侵蝕，進而達到修復骨缺損的作用。Zhang等[42]通過在免疫缺陷小鼠皮下植入AuNPs后，發現有更多的骨結構和膠原形成，表明AuNPs可通過上調骨相關蛋白表達和礦化，促進成骨分化。

圖2 金納米顆粒調控骨髓間充質干細胞成骨分化的分子機制[40]

4 碳納米管在骨代謝中的應用

碳納米管(CNT)的密度遠低于其他金屬骨支架材料，包括鋼和鈦。然而，碳納米管是地球上最強的材料，將其植入骨中可以改善受損骨組織的力學性能。碳納米管不僅可以用來刺激骨再生，還可以起到永久性的機械作用。碳納米管還具有優異的柔韌性和彈性，碳納米管基材料及其復合材料在骨組織工程與再生醫學領域具備巨大的應用潛力[9]。

4.1 骨細胞調控

CNT能夠維持成骨細胞生長和促進骨形成，并能調節細胞表型。Usui等[43]研究表明鄰近骨的CNT很少引起局部炎癥反應，顯示出良好的骨組織相容性，易于整合到新骨中并加速重組人骨形態發生蛋白-2刺激的骨形成。本課題組[44]發現CNT在體外短期和長期骨結合過程中抑制了骨髓間充質干細胞的增殖、成骨分化、成脂分化和礦化，氧化應激實驗結果表明產生的活性氧與觀察到的細胞毒性無關，在骨髓間充質干細胞分化過程中，成骨和成脂特異性基因表達明顯減弱。Baik等[45]通過氧等離子體對單壁碳納米管進行表面處理后，增強了骨髓間充質干細胞的粘附、增殖甚至成骨分化。Tay等[46]報道了單壁碳納米管薄膜對培養2周的骨髓間充質干細胞的相互作用、細胞行為和基因表達的影響。結果發現，單壁碳納米管膜具有高度的生物相容性，為更好的細胞粘附提供了良好的平臺，其納米粗糙度促進了絲狀偽足的形成。在沒有誘導培養基的情況下，單壁碳納米管通過增加粗糙度可以有效地改善人骨髓間充質干細胞的粘附能力和早期分化，調節細胞內成骨分化基因的表達，而促進成骨分化。Sa等[47]研究表明透明質酸鈉功能化的單壁碳納米管可以促進I型和III型膠原、骨鈣素和骨形態發生蛋白表達升高，進而增加了礦化結節的沉積而促進骨礦化。

4.2 骨礦物相影響

本課題組[44]發現骨髓間充質干細胞增殖和成骨分化被抑制與Smad依賴的BMP信號通路有關。Du等[48]表明多壁碳納米管能促進人脂肪間充質干細胞增殖，其機制與多壁碳納米管能通過濃縮更多的蛋白質(包括特異性骨誘導蛋白)激活Notch相關的信號通路有關。Tanaka等[49]將碳納米管植入小鼠顱骨缺損處，碳納米管明顯吸附蛋白質并緩慢釋放，種植在碳納米管上的成骨細胞充滿了伸展的肌動蛋白細絲和絲狀足孔，碳納米管表現出良好的骨傳導能力、細胞粘附和增殖能力以及生長因子保留能力。研究利用多壁碳納米管構建具有最大機械強度的三維塊體，評估其作為骨修復支架材料的有效性。將含人骨形態發生蛋白-2的多壁碳納米管塊植入小鼠背部肌肉后，小鼠肌肉與多壁碳納米管塊直接接觸形成異位骨，骨髓密度與植入含人骨形態發生蛋白-2的聚對苯二甲酸乙二醇酯增強膠原蛋白片的小鼠骨髓密度相當，同時顯示出與皮質骨相當的最大壓縮強度[50]。

5 結語

文章系統總結了羥基磷灰石、稀土納米材料、金納米顆粒、碳納米管等幾種無機納米材料在骨代謝調控中的作用及其機制，但目前仍面臨諸多挑戰：(1)相比較骨髓間充質干細胞和成骨細胞而言，無機納米材料對破骨細胞的研究相對較少；(2)對免疫原性的影響和內在機制需要進一步研究；(3)與有機材料復合成結構可控的材料，也可與溫敏性材料復合聯合光熱治療骨肉瘤等多種疾病。單一的無機納米材料脆性大，不宜制成各種形狀的支架材料，無機納米材料可以與殼聚糖等有機或高分子材料復合增強力學性質以及抗菌特性，從而制成理想的骨修復材料，以解決目前骨組織工程領域靠單一組分材料無法解決的一些難題。