酯酶熒光探針的研究現狀與進展

溫瑩，景寧，陰彩霞

山西大學分子科學研究所，太原 030006

動物、植物和微生物體內廣泛存在著可以將酯類物質水解為羧酸和醇的酯酶。但許多酯酶不僅作用于酯類，還會作用于其他含羰基物質，如酰胺、硫酯、磷酸酯、酸酐，甚至是氨基甲酸酯[1]。基于酯酶的水解特性，許多酯前藥策略被開發出來，比如將細胞通透性差的羧酸鹽類藥物以酯的形式進行預包裝以使其可以順利地透過細胞膜，最終經酯酶的水解釋放出有效的藥物。此外，酯酶還可以調節各種代謝功能如酯類物質的代謝、基因表達、物質運輸和解毒，這些都歸因于它具有高催化效率和高特異性[2-7]。按照底物的不同可以將酯酶分為羧酸酯酶、硫酯酶和磷酸酯酶等不同的類別，其中，羧酸酯酶(carboxylesterase，CES)對生物體的影響較為深遠，因此對它的研究也相對較多。如無特殊說明，本文中的“酯酶”一詞泛指羧酸酯酶。羧酸酯酶分為CES1、CES2、CES3和CES4四個亞型，大多數羧酸酯酶屬于CES1和CES2家族。圖1所示為CES1的晶體結構[8]與Alphafold2預測的CES2空間結構比較圖，由此可見：它們在結構上相似度極高。在體內分布上，CES1主要集中于肝臟、單核巨噬細胞和肺上皮細胞，在腸道中的含量極低；而CES2則集中于腸道，在肝臟也有分布[9]。作為一種發揮重要功能的代謝酶，酯酶的缺失或過量表達往往可以直接導致許多疾病，如動脈粥樣硬化、癌癥和高血脂癥等[10]，因此許多策略已經被開發出來用于酯酶的監測。隨著成像設備和熒光探針的迅速發展，熒光技術在酯酶檢測中發揮著越來越重要的作用。相對于PCR、比色法、分光光度法、平板分析法和色譜法等檢測方法，熒光探針檢測酯酶具有成本低、響應快、靈敏度高和實時無損成像等優勢[11,12]。因此，近些年熒光成像技術在檢測酯酶方面取得了快速發展。本文主要綜述了檢測酯酶的熒光探針，這個領域在不斷發展，因此這篇綜述的目的是總結已有文獻中的策略和最新進展。

圖1 CES1的晶體結構(PDB ID:5A7H[8])與Alphafold2預測的CES2空間結構比較圖

1 檢測酯酶的短波熒光探針

Wang課題組[13]基于共激發態分子內質子轉移(excited state intramolecular proton transfer，ESIPT)熒光團2-(2-羥基苯基)-苯并噻唑(HBT)設計了三個用于檢測酯酶的同系列熒光探針(1，2，3)(圖2為探針1–11的結構式)。探針中作識別基團的是乙酰氧基甲基醚，其中的乙酰氧基可以特異性識別酯酶并與之反應釋放熒光團和甲醛。值得一提的是，作者對HBT熒光團的羥基鄰位進行了修飾以擴展其共軛體系，因此上述三個探針的發射波長依次向長波方向移動。在體外實驗和HeLa細胞成像實驗中這三個探針顯示出了對酯酶的高特異性高靈敏度檢測。Obika課題組[14]設計并合成了一種基于鄰硝基苯并惡二唑(O-NBD)單元的顯色熒光探針(4)。探針由一個帶有甲酸酯的三甲基鎖和O-NBD基團通過乙醇胺連接而成。此外，作者還合成了一個長鏈乙醇胺探針以及一個無酯酶識別位點的探針，熒光實驗顯示后兩者均對酯酶無響應。這說明4的熒光開啟依賴于酯酶活性，同時也驗證了適當長度的連接體在分子內O-到N-NBD的快速遷移中有重要作用，能夠在合理的時間范圍內監測酶促反應。Hu等人[15]以黃酮類化合物衍生物作熒光團合成了一種熒光核磁雙信號通道的探針(5)。探針在檢測酯酶時可以明顯地釋放出熒光開啟和19F的化學位移信號。作者用5對HeLa細胞或MCF-7細胞進行成像，也能在細胞內明顯地觀察到兩種信號的變化。Morisseau課題組[16]開發了一種可以選擇性檢測人羧酸酯酶1(hCE1)的熒光探針6。它以吡啶衍生物作熒光團，長鏈酰胺基團為識別基團，對hCE1的響應信號強度遠高于其他酶。6對hCE1的高選擇性使hCE1可以作為一種生物標志物用于預測新藥的藥代動力學及患者某些相關疾病的狀態。Wang等人[17]開發了一種基于四苯乙烯衍生物的具有聚集誘導發射特性的新型羧酸酯酶熒光探針7。探針中含有四個羧酸基團，因此具有很好的水溶性；當其被酯酶分解后，釋放出相對疏水的熒光團，使探針析出并產生聚集，進而導致探針分子產生聚集誘導發射效應，熒光信號增強。Jung課題組[18]以單分子芘為基礎設計出了具有邏輯門正交檢測磷酸酶和羧酸酯酶功能的熒光探針8。探針通過在芘支架上修飾上一個羧酸酯和一個磷酸單酯基團得到。羧酸酯酶和/或堿性磷酸酶的存在與否可以正交組合出4種不同的熒光輸出模式，這些不同的熒光模式通過發射波長的差異表現出來。作者通過豬肝酯酶和堿性磷酸酶的不同添加組合進行了體外熒光實驗，結果與預期一致。用探針8對L929成纖維細胞瘤細胞和T84人結直腸癌細胞進行成像，只需用肉眼就可觀察到不同的顏色變化，這為活細胞的磷酸酶和羧酸酯酶檢測提供了有價值的工具。

圖2 探針1–11的結構式

合理范圍內的酯酶活性是細胞存活或死亡的重要標志之一，因此通過檢測酯酶的活性可以間接判斷細胞的生存狀態[19]。Yi課題組[20]以苯并噻唑為基本骨架合成了一種通過檢測酯酶活性來鑒別細胞生存狀態的熒光探針9。探針在體外熒光和細胞成像實驗中均表現出了對酯酶的高特異性和低檢測限，可以實現對活細胞和死細胞的鑒別。異常表達的酯酶活性往往伴隨著炎癥的發生，也意味著過量活性氧的表達[21]。通過識別過量的酯酶活性水平可以達到炎癥靶向的效果。Wu課題組[22]基于聚集誘導發射效應建立了一個診療一體的熒光探針(10)，它由親水性牛磺酸和聚集誘導發射熒光團通過酯鍵結合。10可以作為一種既具有成像酯酶激活牛磺酸釋放，又具有ROS清除的治療能力，是由于過量的酯酶可以斷裂酯鍵從而激活牛磺酸并釋放熒光團，其中牛磺酸具有清除活性氧特別是清除HOCl的作用，熒光團具有發射熒光跟蹤目標物的功能。10可以成功地用于成像RAW 264.7巨噬細胞中過量的酯酶和清除細胞內異常水平的活性氧。Hua課題組[23]設計并合成了一種新型二酮吡咯基熒光探針(11)，用于酯酶的定量檢測和細胞存亡的鑒別。起初，由于探針的分子內電荷轉移(intramolecular charge transfer，ICT)過程從二酮吡咯部分轉移到吡啶陽離子而呈現紅色熒光，當用酯酶處理后，分子內電荷轉移過程被破壞，探針發出的熒光由紅色變為黃色，熒光比率發生顯著變化(圖3)。此外，通過檢測不同通道的熒光強度，11可以達到鑒別TPC1人乳頭瘤狀甲狀腺癌細胞生存狀態的目的。為檢測活細胞中的Fe(II)，Lin課題組[24]設計出了一種只有在酯酶和Fe(II)同時存在的情況下才可被順序激活的熒光探針(12)(圖4為探針12–19的結構式)。該探針的精巧之處在于它被酯酶激活后可以對Fe(II)響應，而在沒有酯酶存在的情況下則不會響應Fe(II)。12由Fe(II)和酯酶的識別位點以及一個熒光團組成。HeLa細胞成像和活體實驗表明，它可以作為活細胞特異性Fe(II)和酯酶探針，也可用于生物體內Fe(II)和酯酶活性的檢測和評估。

圖3 經不同時間紫外線預處理的TPC1人乳頭瘤狀甲狀腺癌細胞的熒光圖像[23]

圖4 探針12–19的結構式

酯酶在生物體內的分布位置略有不同，但主要分布在肝臟和腸道組織細胞中的內質網內腔和線粒體中[25,26]。對不同亞細胞的酯酶含量進行靶向檢測也是研究其功能發揮和作用的必然要求。Jing課題組[27]開發了一種比率型熒光探針(13)，用來定量檢測線粒體中酯酶的活性。該探針由4-羥基萘酰亞胺支架、反應性乙酰氧基和靶向線粒體的甲基吡啶陽離子部分組成。在工作時，隨著酯酶對吸電子乙酰氧基部分的裂解，探針分子內的電荷轉移可以有效地被增強，從而導致其光譜模式的變化[28,29]，體外實驗結果表明，熒光發射從428 nm紅移到555 nm。此外，作者還對HeLa細胞進行了線粒體酯酶檢測，結果表明該探針具有良好的激發/發射波長、對內源性線粒體酯酶具有高靈敏度和高選擇性以及低細胞毒性等優點。Hakamata課題組[30]開發了一系列靶向內質網酯酶的熒光探針(14，15，16，17)。對羥甲基苯酚的酚羥基被修飾為酯基，酯基的羧基端連接不同的內質網特異性熒光團，以此合成了探針14-17。不同的探針由于熒光團不同而對內質網酯酶的發射波長也不同，可以對其實現多色成像。實驗證明，這一系列熒光探針可以實現對HT-1080人纖維肉瘤細胞、SK-N-SH人神經母細胞瘤細胞和HeLa細胞的內質網酯酶進行靶向檢測。Zhou課題組[7]以半菁骨架為熒光信號單元，乙酰基為猝滅識別劑合成了靶向溶酶體檢測羧酸酯酶的熒光探針(18)。對溶酶體的靶向功能可能歸因于探針分子中的吲哚結構，由于吲哚的質子受體特性，使其傾向于對溶酶體的特異性定位。細胞成像和亞細胞共定位實驗表明，18可以實現檢測溶酶體中羧酸酯酶的功能。Liu課題組[31]報道了一種用于溶酶體酯酶活性原位檢測的熒光探針19。探針以水楊醛嗪為熒光團，并分別以乙酰氧基和嗎啉基團為酯酶反應性基團和溶酶體靶向部分。探針可以通過形成聚集體的方式來防止水的高極性和氫鍵對其熒光性能的破壞，從而有利于ESIPT的發射。MCF-7細胞成像和亞細胞共定位實驗表明，19可以被用于活細胞溶酶體酯酶活性的特異性檢測，此外，它還可以用于監測溶酶體的運動。

2 近紅外(NIR)熒光探針

近紅外熒光成像的組織吸收度和自體熒光大大降低，從而導致更高的組織穿透率和成像分辨率[32]。因此近紅外熒光成像已經成為近些年組織成像技術中非常有前景的手段。Guo課題組[33]開發了一系列不同環結構的用于檢測酯酶的近紅外熒光探針(典型地，如20，其酯基羧酸部分為三元環)(圖5為探針20–27的結構式)。這一系列探針的發光基團均為半花菁，而識別基團(酯基)中的羧酸部分則依次為三元環至六元環。環的大小不同可以改變分子中平面扭曲的偏轉，以此來探究探針熒光發射特性的相應變化規律，作者發現從三元環到六元環，探針的發射波長逐步紅移且熒光量子產率(φf)也逐步增加。作者通過細胞實驗發現，它還可以靶向至線粒體進行酯酶的原位成像。而小鼠和斑馬魚的抑制劑和時間序列成像則證明20可以被用于檢測生物體內的酯酶含量(圖6)。Li課題組[34]開發了一種用于檢測羧酸酯酶的水溶性近紅外熒光探針(21)。作者以IR-783染料(一種近紅外熒光染料)不穩定前驅體的分解產物為熒光團，其優良的水溶性和近紅外發射特性分別來自于磺酸基和大的共軛體系。體外實驗顯示出了探針對羧酸酯酶的高靈敏度和高特異性，乙酰膽堿酯酶和丁酰膽堿酯酶也無法觸發其熒光發射。此外，作者對HeLa細胞進行的細胞成像實驗表明，21可以被用于檢測細胞內源性的羧酸酯酶，這歸因于其具有良好的細胞相容性和細胞膜通透性。

圖5 探針20–27的結構式

圖6 (A)探針20在活斑馬魚中的熒光成像，其中：(a)斑馬魚在熒光前用探針20預處理1 h后成像；(b)在斑馬魚中加入AEBSF 30 min后，將20加入斑馬魚中孵育1 h進行成像。(B)20在小鼠中的熒光成像，其中：(a)腹腔注射探針孵育0、5、10、30和60 min后的體內成像；(b)將20靜脈注射到小鼠體內，12 h和24 h后對小鼠的心臟、肝臟、脾臟、肺臟和腎臟進行成像[33]。通道：705–750 nm(λex=690 nm)

Stains課題組發明了一系列含膦酸鹽的羅丹紅和熒光素染料，這些熒光染料被用來產生一種靈敏的細胞酯酶活性成像探針[35]。其中，作者在保留羅丹明支架亮度和光穩定性的基礎上對其進行修飾，得到了內布拉斯加州紅(NR)熒光團家族。用乙酰氧基甲基醚(AME)基團對基于二甲基膦酸鹽的熒光素NR600上的苯酚和膦酸鹽進行掩蔽，從而使熒光團猝滅得到目標探針22。作者對HeLa細胞、NIH-3T3成纖維細胞和RAW 264.7細胞進行了細胞成像，結果表明，在細胞胞漿中可以清楚地觀察到NR600的形成并產生比背景高10倍的熒光信號。Levine等人[36]開發了一種鹵代螺環氨基甲酸酯熒光團，并利用可特異性識別酯酶的AME基團對其進行掩蔽，合成了兩種檢測酯酶的近紅外熒光探針(23，24)。其中，24可以實現對活細胞進行酯酶熒光成像，但由于細胞攝取性差及溶解性低等原因導致成像效果不盡如人意。Chao等人[37]開發了兩種基于石杉堿支架和花菁5熒光團的乙酰膽堿酯酶近紅外熒光探針(25，26)。25和26可以在不同組織中對乙酰膽堿酯酶進行原位檢測。相比之下，由于26中石杉堿基團和花菁5熒光團之間的間隔更長，它表現出比25更強的信號和穩定性。在復雜的生物體內環境中，往往多種生物物質同時參與一個生物事件，如果只檢測其中某一種物質有可能會出現假陽性或假陰性的情況。而設計同時報告兩種關聯物質的探針則可以大大降低這種可能性。為克服腫瘤復雜的微環境而對其進行精準診斷，Liang課題組[38]開發了一種可以同時靶向生物素受體和酯酶的近紅外熒光探針(27)。它由一個用于識別生物素受體過度表達生物素基團、一個用于提供近紅外熒光和酯酶識別位點的Cy5.5熒光團(以酯基相連)以及一個用于自組裝27納米粒子的2-氰基-6-氨基苯并噻唑組成。該探針可以識別生物素受體過表達的HepG2癌細胞，并通過細胞內的酯酶水解來開啟熒光，用于腫瘤的雙靶向成像。肝癌小鼠的活體成像實驗也顯示出了探針對癌變組織的精準靶向能力。該課題組還報道了一種可以同時響應酯酶和組蛋白去乙酰化酶的生物發光探針，用于對惡性腫瘤的快速精準診斷[39]。此探針由生物發光的D-熒光素和6-乙酰氨基己酸部分通過酯鍵連接，用于對酯酶和組蛋白去乙酰化酶的識別，由于它并非熒光探針，因此就不做過多贅述。

3 雙光子(TP)型熒光探針

雙光子熒光成像技術以其高光穩定性，低光損傷，高時空分辨率等優勢成為一種有吸引力的生物成像方法[40]。基于小分子的雙光子熒光探針已被廣泛開發用于檢測和成像生物系統中的各種生物分析物[41]。Kim課題組[42]報道了一種可用于活體肝細胞和肝組織中酯酶活性定量分析的比率雙光子熒光探針(28)(圖7為探針28–32的結構式)。探針由基于乙酸苯酯的三甲基鎖、作為酯酶水解位點的3-(2-乙酰氧基-4,6-二甲基苯基)-3-甲基丁酸衍生物和含有增溶基團的雙光子熒光團組成。用28預孵育的HepG2細胞雙光子成像顯示出細胞中有不均勻的TP激發熒光信號，這說明該探針不僅可以響應酯酶，還能對酯酶在不同亞細胞的分布水平做出反應。此外，利用28對鼠肝組織切片進行比率雙光子成像得到比HepG2細胞更強烈的熒光發射比，這說明其可以定量檢測酯酶的活性，因為有報道證明人類和大鼠之間的酯酶激活水平不同[43]。如前所述，CES2是羧酸酯酶的一種亞型，也是許多抗癌前藥的關鍵介質，許多癌癥的發生往往也與其異常的CES2水平有關。Choi課題組[44]設計并合成了一種用琥珀酸酯作CES2識別單元的雙光子比率型熒光探針(29)。用29對CES2進行定量分析，作者首次發現乳腺癌細胞中的CES2活性明顯地低于正常細胞。總之，該探針可以為定量測定CES2活性以及預測抗腫瘤藥物的療效提供輔助信息。Tang課題組[45]開發了一種基于半菁和萘衍生物的D-π-A結構的雙光子酯酶熒光探針(30)。在檢測酯酶時探針會被水解并釋放出半花菁熒光團，從而觀察到明顯的熒光變化。體外實驗和HeLa細胞成像實驗均表明，30具有出色的熒光增強和光穩定性。

圖7 探針28–32的結構式

許多傳統的生色團在形成聚集體時通常會有嚴重的熒光猝滅現象。為了克服這種現象，可以使用具有聚集誘導發射效應的熒光團，這樣不僅可以在聚集體中發出明顯的熒光，還可以改善雙光子特性。Lee課題組[46]通過重氮化和相應芳香胺與萘酚之間的偶氮偶聯反應合成了鄰苯偶氮萘酚衍生物AN-OH和AN-Br-OH，再利用乙酰基對其羥基進行保護，得到了響應酯酶的聚集誘導發射-雙光子熒光探針(31，32)。由于羥基提供的電子是發射熒光所必須的，因此31和32在固態和液態情況下均保持熒光靜默。識別酯酶后，探針中酯基被切斷從而暴露出羥基，顯示出聚集誘導發射的雙光子熒光效應。兩個探針分別對HepG2細胞進行單光子/雙光子熒光成像，結果均顯示雙光子成像分辨率優于單光子成像，可以作為酯酶檢測的候選。

4 總結和展望

在過去的幾年中，用于酯酶傳感和成像的分子熒光探針的發展取得了相當大的進展，這些熒光探針在酯酶檢測領域中占有著不可或缺的一席，促進了我們對酯酶生理及病理作用和功能的理解。這些熒光探針的應用得益于現代顯微鏡高分辨率技術的快速發展。目前，絕大部分酯酶熒光探針都可以達到精確地、靈敏地檢測細胞內或生物體內酯酶的目的，有一些還可以完成定量檢測或亞細胞定位檢測。盡管如此，仍有必要進一步開發具有更優波長、更優穩定性和更優成像效果的熒光探針。為了實現這一目標，我們可能在同一探針分子中交叉使用多種形式的信號輸出模式(如熒光、比色、光聲和核磁等信號)。此外，在我們所收集到的有限的文獻中，并沒有發現可以針對酯酶水平異常相關疾病的診療一體型熒光探針的報道，這可能也是今后一個重要的研究方向。總之，用于酯酶檢測的熒光探針將繼續受到挑戰，并隨著需求和問題的不斷深入而向前推進。